葡萄糖敏感性胰岛素衍生物的制作方法

1.本发明涉及新型胰岛素衍生物及其药物用途。此外，本发明涉及包含这类胰岛素衍生物的药物组合物，并且涉及这类化合物在治疗或预防与糖尿病有关的医学状况中的用途。


背景技术：

2.胰岛素是治疗高血糖最有效的药物，但由于生理葡萄糖窗口很窄，胰岛素给药是过多与过少之间的微妙平衡。健康人在禁食状态下的血糖水平接近5mm，而糖尿病患者尝试给予膳食和基础胰岛素制剂以接近5mm。然而，在胰岛素治疗期间经常发生低于约3mm的血糖值(低血糖症)，低血糖会导致不适、意识丧失、脑损伤或死亡。因此，糖尿病患者出于对低血糖症的恐惧而犹豫是否积极地治疗他们的高或中高血糖值。如果开发出仅在较高血糖值时有活性或从贮库中释放，而在较低血糖值时无活性或活性较弱的胰岛素药物，则可以帮助糖尿病治疗。自二十世纪七十年代以来，许多论文已经接近了这些目标(brownlee等人,science 1979,1190；zaykov等人,nature rev.drug disc.2016,425)，但最常见的是通过葡萄糖敏感性聚合物，这些聚合物捕获并以葡萄糖依赖性方式从皮下贮库中释放胰岛素。然而，这样的系统很慢，因此不适用于治疗例如餐后快速波动的血糖值。因此，皮下葡萄糖敏感性释放系统从未达到临床试验。
3.如果可以在血液中进行胰岛素生物活性的葡萄糖敏感性调节，那就更好了。可以实现这一愿望的一种方法可能是葡萄糖敏感性白蛋白结合，如之前对于脂肪酸
‑
单硼酸酯胰岛素衍生物所描述的，其中脂肪酸部分引起白蛋白结合(novo nordisk wo2011/000823；wo 2014/093696；chou等人,proc.nat.acad.sci.2015,2401)。这些系统中白蛋白相互作用的主要驱动力来自脂肪酸
‑
单硼酸酯胰岛素衍生物(不是硼酸酯)的脂肪酸部分，而葡萄糖对白蛋白亲和力的影响很弱。为了增加白蛋白结合的葡萄糖敏感性，因此需要直接被葡萄糖置换的葡萄糖敏感性白蛋白结合基序。已知单硼酸酯以中等至高毫摩尔范围内的亲和力(kd)结合葡萄糖和其他糖(hansen等人,sensors actuators b 2012,45)。然而，为了在生理葡萄糖水平下提供足够的葡萄糖敏感性，需要更强的对葡萄糖的亲和力。具有相对于葡萄糖上的羟基以适当几何形状放置的两个硼酸酯(boronate)/硼氧杂环戊烯(boroxole)的二硼化合物可以提供相对于单硼化合物增加的葡萄糖亲和力，即低mm kd或亚mm kd(hansen等人,sensors actuators b 2012,45)。文献中描述的大多数此类二硼化合物包括荧光探针，因为这些研究的目的是制造光学葡萄糖传感器。候选药物中不希望使用荧光探针，因为这些探针可能对光敏感、有毒和有色。因此需要在生理血糖水平内具有增加的葡萄糖敏感性的胰岛素衍生物。


技术实现要素：

4.在最宽泛的方面，本发明涉及胰岛素衍生物。
5.令人惊讶地发现本发明的化合物与白蛋白(hsa)和葡萄糖均结合，并且hsa亲和力
是葡萄糖敏感的。在存在hsa时的人胰岛素受体(hir)亲和力因此也变为葡萄糖敏感性的。与hsa结合的那部分胰岛素不会与hir结合，但是葡萄糖促进的从hsa释放会增加胰岛素的游离部分，因此葡萄糖会增加hir亲和力。
6.与先前公开的具有所谓的葡萄糖敏感性白蛋白结合的胰岛素衍生物相反，本发明的化合物不依赖于脂肪酸部分进行白蛋白结合，而是包含被葡萄糖直接置换的白蛋白结合基序，导致葡萄糖对白蛋白结合的影响增加，从而增加胰岛素的葡萄糖敏感性。
7.白蛋白结合通常可以延长基于肽和蛋白质的药物的体内半衰期。由于白蛋白结合的部分免于酶促降解和肾脏消除，因此实现了延长的效果，并且只有游离部分具有生物活性，从而防止受体介导的白蛋白结合部分的清除。
8.本发明的化合物因此表现出依赖于葡萄糖浓度的胰岛素活性，并因此用作葡萄糖敏感性胰岛素衍生物。
9.在一方面，本发明的化合物包含胰岛素或其类似物，以及一个或多个修饰基团。
10.在一方面，所述修饰基团对葡萄糖和白蛋白具有亲和力。
11.在一方面，所述胰岛素肽或其类似物任选地包含间隔体。
12.在一方面，本发明的化合物包含
13.i)人胰岛素或人胰岛素类似物；以及
14.ii)一个或多个修饰基团m，其中每个修饰基团m包含两个芳基部分，其中硼原子附接至所述两个芳基部分中的每一个。所述一个或多个修饰基团m中的每一个任选地经由间隔体附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物的a链或b链的n末端氨基酸残基的氨基，或者附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物中赖氨酸的ε氨基。
15.在一个实施方案中，所述一个或多个修饰基团m任选地通过间隔体附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物中游离半胱氨酸的硫化物。
16.在一方面，本发明的化合物包含
17.i)人胰岛素或人胰岛素类似物；以及
18.ii)两个或更多个修饰基团m，其中每个修饰基团m包含两个芳基部分，其中硼原子附接至所述两个芳基部分中的每一个。所述两个或更多个修饰基团m中的每一个任选地经由间隔体附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物的a链或b链的n末端氨基酸残基的氨基，或者附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物中赖氨酸的ε氨基。
19.从实施例中可以看出，具有两个或更多个修饰基团m的化合物通常比只有一个修饰基团m的化合物表现出更高程度的葡萄糖敏感性(更高的葡萄糖因子)。
20.在一方面，本发明提供了新型胰岛素类似物形式的中间产物，包括包含肽间隔体的新型胰岛素类似物。
21.在一方面，本发明的化合物根据血液和组织中的葡萄糖浓度激活胰岛素受体。
22.在一方面，在低血糖，例如低于约3mm葡萄糖的水平(低血糖症)的情况下，本发明的化合物具有低利用度(低非结合的、血浆游离部分)，因此具有低活性或无活性。
23.在一方面，响应于高血糖，例如高于约10mm葡萄糖(高血糖症)，本发明的化合物具有高利用度(高非结合的、血浆游离部分)，因此具有高活性。
24.在一方面，本发明的化合物表现出葡萄糖敏感性白蛋白结合。
25.在另一方面，本发明涉及包含根据本发明的化合物的药物组合物。在另一方面，本
发明涉及用作药物的根据本发明的化合物。在另一方面，本发明涉及用于治疗糖尿病的根据本发明的化合物。在另一方面，本发明涉及根据本发明的化合物的医学用途。
26.本发明也可以解决从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出的其他问题。
附图说明
27.图1显示了在10mm和3.5
‑
4mm葡萄糖时静脉内团注门冬胰岛素的pk曲线(实施例e)。
28.图2显示了在10mm和3.5
‑
4mm葡萄糖时静脉内团注德谷胰岛素的pk曲线(实施例e)。
29.图3显示了在10mm(实心)和3.5
‑
4mm(空心)葡萄糖时静脉内团注实施例编号210(三角形)和实施例编号211(圆形)的pk曲线(实施例e)。
30.图4显示了在10mm(实心)和3.5
‑
4mm(空心)葡萄糖时静脉内团注实施例编号233(三角形)和实施例编号234(正方形)的pk曲线(实施例e)。
31.图5显示了在10mm(实心)和3.5
‑
4mm(空心)葡萄糖时静脉内团注实施例编号240(三角形)和实施例编号227(圆形)的pk曲线(实施例e)。
32.图6显示了在10mm(实心)和3.5
‑
4mm(空心)葡萄糖时静脉内团注实施例编号241(三角形)和实施例编号181(正方形)的pk曲线(实施例e)。
33.图7显示了在10mm(实心)和3.5
‑
4mm(空心)葡萄糖时静脉内团注实施例编号205(三角形)和实施例编号239(正方形)的pk曲线(实施例e)。
34.图8显示了在10mm(实心)和3.5
‑
4mm(空心)葡萄糖时静脉内团注实施例编号285(三角形)和实施例编号273(正方形)的pk曲线(实施例e)。
35.图9显示了在10mm(实心)和3.5
‑
4mm(空心)葡萄糖时静脉内团注实施例编号280(三角形)和实施例编号272(正方形)的pk曲线(实施例e)。
36.图10显示了对于实施例编号205、239、272和280，对于3.5
‑
4mm葡萄糖与10mm葡萄糖的钳夹实验，基线调整的葡萄糖输注速率曲线下面积之间的比较(实施例e)。
37.描述
38.本发明涉及胰岛素衍生物。在一方面，本发明涉及葡萄糖敏感性胰岛素衍生物。
39.在一个实施方案中，本发明涉及包含人胰岛素或其类似物和修饰基团的化合物，该修饰基团对葡萄糖和白蛋白均表现出亲和性。
40.在一个实施方案中，所述修饰基团表现出葡萄糖敏感性白蛋白结合。
41.在一个实施方案中，所述胰岛素类似物是人胰岛素的类似物(seq id no:1和seq id no:2)。
42.在一个实施方案中，本发明的人胰岛素或人胰岛素类似物可包含间隔体。
43.在一个实施方案中，本发明提供了化合物，其包含人胰岛素或人胰岛素类似物；以及一个或多个修饰基团m，其中每个修饰基团m包含两个芳基部分，其中硼原子附接至所述两个芳基部分中的每一个。所述一个或多个修饰基团m中的每一个任选地经由间隔体附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物的a链或b链的n末端氨基酸残基的氨基，或者附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物中赖氨酸的ε氨基。
44.在一个实施方案中，本发明提供了化合物，其包含人胰岛素或人胰岛素类似物；以
及两个或更多个修饰基团m，其中每个修饰基团m包含两个芳基部分，其中硼原子附接至所述两个芳基部分中的每一个。所述两个或更多个修饰基团m中的每一个任选地经由间隔体附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物的a链或b链的n末端氨基酸残基的氨基，或者附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物中赖氨酸的ε氨基。修饰基团m还可以任选地通过间隔体附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物中游离半胱氨酸的硫化物。
45.一般定义
46.本文使用术语“化合物”表示分子实体，因此，“化合物”除了针对每种化合物或化合物组定义的最小元件外，还可具有不同的结构元件。术语“化合物”还旨在涵盖其药学上相关的形式，即，本发明涉及本文所定义的化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯。
47.例如在本发明的上下文中使用的术语“肽”或“多肽”是指包含一系列通过酰胺(或肽)键互相连接的氨基酸的化合物。在特定实施方案中，肽由通过肽键相互连接的氨基酸组成。
48.术语“类似物”通常是指与参考氨基酸序列相比，其序列具有一个或多个氨基酸改变的肽。与其参考序列相比，“包含”某些指定改变的类似物可包含进一步的改变。在特定实施方案中，类似物“具有”或“包含”指定的改变。在其他特定实施方案中，类似物“由改变组成”。当对于类似物使用术语“组成”或“由
……
组成”时，例如类似物由一组指定的氨基酸突变组成时，应该理解，指定的氨基酸突变是类似物中仅有的氨基酸突变。相反，“包含”一组指定的氨基酸突变的类似物可以具有另外的突变。
49.术语“衍生物”通常是指可以通过化学修饰，特别是通过一个或多个取代基的共价连接，由天然肽或其类似物制备的化合物。
50.在本发明的背景下，修饰基团m是共价连接的取代基。
51.术语“氨基酸”包括蛋白型(proteinogenic)(或天然)氨基酸(其中有20种标准氨基酸)以及非蛋白型(或非天然)氨基酸。蛋白型氨基酸是天然地并入蛋白质中的氨基酸。标准氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸。非蛋白型氨基酸或者不存在于蛋白质中，或者不通过标准细胞机制产生(例如，它们可能已经经历翻译后修饰)。
52.通常，氨基酸残基(肽/蛋白质序列)可用其全名、其单字母代码和/或其三字母代码来表示。这三种方式完全等效。在下文中，未说明其光学异构体的本发明肽的各个氨基酸都应被理解为意指l
‑
异构体(除非另有说明)。氨基酸是含有氨基和羧酸基团以及可选的一个或多个通常被称为侧链的额外基团的分子。
53.本文中，术语“氨基酸残基”是在形式上已从羧基中去除羟基的氨基酸，和/或在形式上已从氨基中去除氢原子的氨基酸。
54.从以下实例可以明显看出，氨基酸残基可以用其全名、其单字母代码和/或其三字母代码来表示。这三种方式完全等效并且可互换使用。
55.在本文中，术语“芳基”是指具有5至12个碳原子的环状或多环芳族环。术语芳基包括单价、二价和多价物质。芳基的实例包括但不限于苯基、联苯基、萘基、蒽基等。在特定实施方案中，芳基是苯基。在本文中，术语“芳基”还包括“杂芳基”。术语“杂芳基”是指并入一个或多个(例如1
‑
4个，特别是1、2或3个)选自氮、氧或硫的杂原子的芳族单环、双环或多环。
56.胰岛素
57.如本文所用的术语“人胰岛素”意指人胰岛素激素，其结构和性质是众所周知的。
人胰岛素具有两条多肽链，被命名为a链和b链。a链为21个氨基酸的肽，而b链为30个氨基酸的肽，这两条链通过以下的二硫桥连接：在a链位置7上的半胱氨酸与b链位置7上的半胱氨酸之间的第一桥，以及在a链位置20上的半胱氨酸与b链位置19上的半胱氨酸之间的第二桥。第三桥存在于a链的位置6和11上的半胱氨酸之间。
58.人胰岛素a链具有以下序列：giveqcctsicslyqlenycn(seq id no:1)，而b链具有以下序列：fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt(seq id no:2)。
59.如本文所用的术语“胰岛素肽”、“胰岛素化合物”或“胰岛素”意指作为人胰岛素或其具有胰岛素活性(即，激活胰岛素受体)的类似物或衍生物的肽。
60.胰岛素类似物
61.如本文所用的术语“胰岛素类似物”意指经修饰的人胰岛素，其中该胰岛素的一个或多个氨基酸残基已经被其他氨基酸残基置换，并且/或者其中一个或多个氨基酸残基已从该胰岛素中删除，并且/或者其中一个或多个氨基酸残基已被添加和/或插入到该胰岛素中。
62.如本文所用的术语“胰岛素类似物”是指表现出胰岛素活性的胰岛素类似物，即，其激活胰岛素受体。
63.胰岛素类似物包含相对于人胰岛素的少于10个氨基酸修饰(置换、缺失、添加(即延伸)、插入及其任何组合)，或者相对于人胰岛素的少于9、8、7、6、5、4、3、2或1个修饰。在一方面，胰岛素类似物具有相对于人胰岛素的少于10个氨基酸修饰(置换、缺失、添加(即延伸)、插入及其任何组合)，或者相对于人胰岛素的少于9、8、7、6、5、4、3、2或1个修饰。
64.胰岛素分子中的修饰通过说明置换天然氨基酸残基的氨基酸残基所在的链(a或b)、其位置以及单字母或三字母代码来表示。
65.本文中，如“a1”、“a2”和“a3”等术语分别表示在胰岛素a链中的位置1、2和3等位置上的氨基酸(从n末端开始计数)。类似地，如“b1”、“b2”和“b3”等术语分别表示在胰岛素b链中的位置1、2和3等位置上的氨基酸(从n末端开始计数)。使用氨基酸的单字母代码，诸如a21a、a21g和a21q等术语表示a21位置的氨基酸分别为a、g和q。使用氨基酸的三字母代码，相应的表示分别为a21ala、a21gly和a21gln。
[0066]“desb30”是指缺乏b30氨基酸的天然胰岛素b链或其类似物。
[0067]
在本文中，术语“a
‑
1”或“b
‑
1”分别表示处于a1或b1的n端侧的氨基酸的位置。术语a
‑
2或b
‑
2分别表示处于a
‑
1或b
‑
1的n端侧的第一个氨基酸的位置。
[0068]
术语“a22”或“b31”分别表示处于a21或b30的c端侧的氨基酸的位置。
[0069]
因此，例如，a14e b1k b2p b25h desb27 desb30人胰岛素是人胰岛素的类似物，其中a链中位置14处的氨基酸被谷氨酸置换，b链中位置1处的氨基酸被赖氨酸置换，b链中位置2处的氨基酸被脯氨酸置换，b链中位置25处的氨基酸被组氨酸置换，并且b链中位置27和30处的氨基酸缺失。
[0070]
具有置换的胰岛素类似物的实例是这样的胰岛素类似物，其中位置a14处的tyr被glu置换。此外，位置b1或b4处的氨基酸可以被lys置换。位置b2处的氨基酸可以被pro置换。位置b25处的氨基酸可以被his置换。
[0071]
具有缺失的胰岛素类似物的实例是其中人胰岛素中的b30氨基酸已经缺失的类似物(desb30人胰岛素)、其中人胰岛素中的b1氨基酸已经缺失的胰岛素类似物(desb1人胰岛
素)、其中人胰岛素中的b1和b2氨基酸已经缺失的胰岛素类似物(desb1 desb2人胰岛素)和desb27人胰岛素。
[0072]
其中a链和/或b链具有n末端延伸(即其中一个或多个氨基酸残基已添加至n末端)的胰岛素类似物的实例是包含a
‑
2k和a
‑
1p的人胰岛素类似物，即，其中a链已在n末端用kp延伸的人胰岛素类似物。另一个实例是其中一个甘氨酸残基被添加至b链的n末端的人胰岛素类似物，即包含b
‑
1g的人胰岛素类似物。
[0073]
其中a链和/或b链具有c末端延伸(即其中一个或多个氨基酸残基已添加至c末端)的胰岛素类似物的实例是包含a22k的人胰岛素类似物。
[0074]
进一步的实例是包含所提及突变的组合的胰岛素类似物。
[0075]
胰岛素类似物的实例包括：
[0076]
desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:11)；
[0077]
a21q desb30人胰岛素(seq id no:3和seq id no:11)；
[0078]
a14e b25h desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:12)；
[0079]
a14e b1k b2p b25h desb27 desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:13)；
[0080]
a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素(seq id no:5和seq id no:14)；
[0081]
a14e a22k b25h b27p b28g desb30人胰岛素(seq id no:5和seq id no:15)；
[0082]
a14e desb1
‑
b2 b4k b5p desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:16)；
[0083]
a14e desb1
‑
b2 b3g b4k b5p desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:17)；
[0084]
a14e b
‑
1g b1k b2p desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:18)；
[0085]
a22k desb30人胰岛素(seq id no:6和seq id no:11)；
[0086]
a22k b29r desb30人胰岛素(seq id no:6和seq id no:19)；
[0087]
a22k b22k b29r desb30人胰岛素(seq id no:6和seq id no:20)；和
[0088]
a
‑
2k a
‑
1p desb30人胰岛素(seq id no:7和seq id no:11)。
[0089]
间隔体
[0090]
如上所述，本发明的胰岛素类似物包含相对于人胰岛素的少于10个氨基酸修饰(置换、缺失、延伸及其任何组合)，或者相对于人胰岛素的少于9、8、7、6、5、4、3、2或1个修饰。除了这些多达9个修饰之外，本发明的人胰岛素或人胰岛素类似物还可以在人胰岛素或人胰岛素类似物a链的c末端，或在人胰岛素或人胰岛素类似物b链的n末端包含间隔体。
[0091]
在一个实施方案中，所述间隔体是肽，其在本文中被称为间隔肽或肽间隔体。在另一个实施方案中，所述间隔体是非肽连接体l。
[0092]
肽间隔体
[0093]
各种间隔肽是本领域已知的，并且可以在本发明的化合物中使用。在一个实施方案中，所述间隔体是由经由肽键连接的4
‑
40个氨基酸组成的肽区段。在一个实施方案中，所述间隔体是由经由肽键连接的4
‑
24个氨基酸组成的肽区段。
[0094]
在一个实施方案中，所述间隔体包含以下氨基酸残基中的一个或多个：gly(g)、glu(e)、ser(s)、pro(p)、arg(r)、phe(f)、tyr(y)、asp(d)和lys(k)。在一个实施方案中，所述间隔体包含以下氨基酸残基中的一个或多个：gly(g)、glu(e)、ser(s)和lys(k)。在一个实施方案中，所述间隔体包含以下氨基酸残基中的一个或多个：gly(g)、ser(s)、pro(p)、arg(r)、phe(f)、tyr(y)、asp(d)和lys(k)。在一个实施方案中，所述间隔体包含以下氨基酸
残基中的一个或多个：gly(g)、ser(s)、pro(p)和lys(k)。在一个实施方案中，所述间隔体包含至少一个lys(k)残基。
[0095]
在一个实施方案中，本发明的人胰岛素或人胰岛素类似物在所述人胰岛素或所述人胰岛素类似物的a链的c末端包含肽间隔体。在一个实施方案中，所述肽间隔体包含(ges)
p
k，其中p为3至12的整数。
[0096]
在所述人胰岛素或所述人胰岛素类似物a链的c末端的肽间隔体的实例包括：(ges)3k(seq id no:29)；(ges)6k(seq id no:30)；和(ges)
12
k(seq id no:31)。
[0097]
在一个实施方案中，本发明的人胰岛素或人胰岛素类似物在所述人胰岛素或所述人胰岛素类似物的b链的n末端包含肽间隔体。在一个实施方案中，所述肽间隔体包含gkpg、gkp(g4s)
q
、kp(g4s)
r
、gkprgffytp(g4s)
s
或tyffgrkpd(g4s)
t
，其中q、r、s和t中的每一个独立地选自1至5的整数。在另一个实施方案中，所述肽间隔体包含gkpg、gkp(g4s)
q
、kp(g4s)
r
、gkprgffytp(g4s)
s
或tyffgrkpd(g4s)
t
，其中q为1至3的整数。
[0098]
在所述人胰岛素或所述人胰岛素类似物b链的n末端的肽间隔体的实例包括：
[0099]
gkpg(seq id no:32)；
[0100]
gkpggggs(gkp(g4s))(seq id no:33)；
[0101]
gkpggggsggggs(gkp(g4s)2)(seq id no:34)；
[0102]
gkpggggsggggsggggs(gkp(g4s)3)(seq id no:35)；
[0103]
kpggggsggggsggggs(kp(g4s)3)(seq id no:36)；
[0104]
gkprgffytpggggsggggs(gkprgffytp(g4s)2)(seq id no:37)；和
[0105]
tyffgrkpdggggsggggsggggs(tyffgrkpd(g4s)3)(seq id no:38)。
[0106]
在所述人胰岛素或所述人胰岛素类似物a链的c末端包含肽间隔体的胰岛素类似物的实例包括：
[0107]
a21q(ges)3k desb30人胰岛素(seq id no:8和seq id no:11)；
[0108]
a21q(ges)6k desb30人胰岛素(seq id no:9和seq id no:11)；和
[0109]
a21q(ges)
12
k desb30人胰岛素(seq id no:10和seq id no:11)。
[0110]
在所述人胰岛素或所述人胰岛素类似物b链的n末端包含肽间隔体的胰岛素类似物的实例包括：
[0111]
b1
‑
kpggggsggggsggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:21)；
[0112]
b1
‑
kpggggsggggsggggs a14e b25h desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:22)；
[0113]
b1
‑
gkpggggsggggsggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:23)；
[0114]
b1
‑
gkpggggsggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:24)；
[0115]
b1
‑
gkpggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:25)；
[0116]
b1
‑
gkpg desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:26)；
[0117]
b1
‑
gkprgffytpggggsggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:27)；和
[0118]
b1
‑
tyffgrkpdggggsggggsggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:28)。
[0119]
连接体l
[0120]
在一方面，所述间隔体是非肽连接体l。各种非肽连接体是本领域已知的，并且可
以在本发明的化合物中使用。
[0121]
在一个实施方案中，本发明的人胰岛素或人胰岛素类似物在所述人胰岛素或所述人胰岛素类似物的b链的n末端包含连接体l。
[0122]
在一个实施方案中，所述连接体是式l1：
[0123][0124]
其中*1表示与修饰基团m的附接点，且*2表示与人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的氨基酸残基的氨基的附接点。
[0125]
在一个实施方案中，所述连接体是式l2：
[0126][0127]
其中*1表示与修饰基团m的附接点，且*2表示与人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的氨基酸残基的氨基的附接点，并且其中u为1、2或3。在一个实施方案中，u为2或3。
[0128]
在一个实施方案中，所述连接体是式l3：
[0129][0130]
其中*1表示与修饰基团m的附接点，且*2表示与人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的氨基酸残基的氨基的附接点，并且其中v为2或3。
[0131]
胰岛素衍生物
[0132]
如本文所用的术语“胰岛素衍生物”是指化学修饰的胰岛素或其类似物，其中所述修饰是一个或多个修饰基团m的连接的形式。
[0133]
在一个实施方案中，所述一个或多个修饰基团m中的每一个任选地经由间隔体附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物的a链或b链的n末端氨基酸残基的氨基，或者附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物中赖氨酸的ε氨基。
[0134]
在一个实施方案中，每个修饰基团m附接至选自以下基团之一的附接点：
[0135]
a)所述人胰岛素或人胰岛素类似物a链的n末端氨基酸残基的氨基；
[0136]
b)所述人胰岛素类似物a链的位置22处的赖氨酸的ε氨基；
[0137]
或
[0138]
所述人胰岛素或人胰岛素类似物a链c末端的所述可选肽间隔体中赖氨酸的ε氨基；
[0139]
c)所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的n末端氨基酸残基的氨基；
[0140]
所述人胰岛素类似物b链的位置1或位置4处的赖氨酸残基的ε氨基；
[0141]
所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的所述可选肽间隔体中赖氨酸的ε氨基；或者
[0142]
所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的所述可选连接体l中用*1标记的远端氨基；以及
[0143]
d)所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置22或位置29处的赖氨酸的ε氨基。
[0144]
在一个实施方案中，不超过一个修饰基团m附接至基团a)、b)、c)和d)中的每一个内的附接点。
[0145]
在一个实施方案中，本发明的化合物包含两个修饰基团m，其中一个修饰基团m附接至所述人胰岛素类似物b链的位置1或位置4处的赖氨酸残基的氨基，或者所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的可选肽延伸中赖氨酸的ε氨基；并且另一个修饰基团m附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置29处的赖氨酸的ε氨基。
[0146]
在一个实施方案中，本发明的化合物具有恰好两个修饰基团m，其中一个修饰基团m附接至所述人胰岛素类似物b链的位置1或位置4处的赖氨酸残基的氨基，或者所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的可选肽延伸中赖氨酸的ε氨基；并且另一个修饰基团m附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置29处的赖氨酸的ε氨基。
[0147]
在一个实施方案中，本发明的化合物包含两个修饰基团m，其中一个修饰基团m附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物a链的n末端氨基酸残基的氨基；并且另一个修饰基团m附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置29处的赖氨酸的ε氨基。
[0148]
在一个实施方案中，本发明的化合物具有恰好两个修饰基团m，其中一个修饰基团m附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物a链的n末端氨基酸残基的氨基；并且另一个修饰基团m附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置29处的赖氨酸的ε氨基。
[0149]
在一个实施方案中，本发明的化合物包含两个修饰基团m，其中一个修饰基团m附接至所述人胰岛素类似物a链的位置22处的赖氨酸的ε氨基，或者附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物a链c末端的可选肽间隔体中赖氨酸的ε氨基；并且另一个修饰基团m附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置22或位置29处的赖氨酸的ε氨基。
[0150]
在一个实施方案中，本发明的化合物具有恰好两个修饰基团m，其中一个修饰基团m附接至所述人胰岛素类似物a链的位置22处的赖氨酸的ε氨基，或者附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物a链c末端的可选肽间隔体中赖氨酸的ε氨基；并且另一个修饰基团m附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置22或位置29处的赖氨酸的ε氨基。
[0151]
在一个实施方案中，本发明的化合物包含一个修饰基团m，其中该修饰基团m附接至所述人胰岛素类似物a链的位置22处的赖氨酸的ε氨基；或者附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置29处的赖氨酸的ε氨基。
[0152]
在一个实施方案中，本发明的化合物具有恰好一个修饰基团m，其中该修饰基团m附接至所述人胰岛素类似物a链的位置22处的赖氨酸的ε氨基；或者附接至所述人胰岛素或
人胰岛素类似物b链的位置29处的赖氨酸的ε氨基。
[0153]
在一个实施方案中，本发明的化合物包含三个或四个修饰基团m，其中第一修饰基团m附接至所述人胰岛素类似物a链的位置22处的赖氨酸的ε氨基；第二修饰基团m附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置22或位置29处的赖氨酸的ε氨基；其余的修饰基团m各自附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物a链的n末端氨基酸残基的氨基；附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置22或位置29处的赖氨酸的ε氨基；或者附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的所述可选连接体l中用*1标记的远端氨基。
[0154]
在一个实施方案中，本发明的化合物具有恰好三个或四个修饰基团m，其中第一修饰基团m附接至所述人胰岛素类似物a链的位置22处的赖氨酸的ε氨基；第二修饰基团m附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置22或位置29处的赖氨酸的ε氨基；其余的修饰基团m各自附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物a链的n末端氨基酸残基的氨基；附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置22或位置29处的赖氨酸的ε氨基；或者附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的所述可选连接体l中用*1标记的远端氨基。
[0155]
修饰基团m
[0156]
本发明的化合物包含一个或多个修饰基团m。在一个实施方案中，本发明的化合物包含一个、两个、三个或四个修饰基团m。在一个实施方案中，本发明的化合物包含两个或更多个修饰基团m。在一个实施方案中，本发明的化合物包含两个、三个或四个修饰基团m。在一个实施方案中，本发明的化合物包含两个修饰基团m。在一个实施方案中，本发明的化合物具有恰好两个修饰基团m。所述一个或多个修饰基团可以相同或不同。所述两个或更多个修饰基团可以相同或不同。在一个实施方案中，所述修饰基团是相同的。
[0157]
一些修饰基团包含一个或多个氨基酸残基。这些氨基酸残基中的每一个可以独立地为相应氨基酸残基的d
‑
或/l
‑
形式，即，修饰基团中的每个手性原子可以独立地为(r)
‑
或(s)
‑
形式。在一个实施方案中，修饰基团的氨基酸残基为l
‑
氨基酸残基。
[0158]
每个修饰基团m包含二硼部分，其中该二硼部分(即修饰基团m)包含两个芳基部分，其中硼原子附接至所述两个芳基部分中的每一个。该硼原子可以是硼酸(或硼酸酯，取决于pka/ph)的一部分，或者它可以是硼氧杂环戊烯(或硼氧杂环戊二烯(boroxolate)，取决于pka/ph)的一部分。
[0159]
术语“包括”或“包含”某些特征应被解释为表示所讨论的主题包括这些某些特征，但不排除存在其他特征。因此，修饰基团m可以具有多于两个芳基部分，其中硼原子附接至每个芳基部分。在一个实施方案中，该修饰基团具有恰好两个芳基部分，其中硼原子附接至所述两个芳基部分中的每一个。在一个实施方案中，该修饰基团具有恰好四个芳基部分，其中硼原子附接至所述四个芳基部分中的每一个。
[0160]
本发明的二硼酸酯/二硼氧杂环戊烯与葡萄糖的结合强于单硼酸酯，如实施例a中所示。此外，令人惊讶的是，本发明的二硼化合物能够与人血清白蛋白(hsa)结合，因此具有双重作用，因为hsa结合也是葡萄糖敏感的(由于肽上的受体结合位点被阻断，二硼肽的hsa结合部分是无活性的)(数据显示在实施例b中)。
[0161]
在一个实施方案中，所述修饰基团是式m1：
[0162][0163]
其代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且
[0164]
其中n代表1至4范围内的整数；
[0165]
其中w1不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w1代表
[0166]
nh
‑
ch2‑
c(＝o)
‑
*，
[0167]
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*，
[0168]
nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，
[0169]
nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，
[0170]
或
[0171]
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
nh
‑
(ch2)2‑
o
‑
(ch2)2‑
o
‑
ch2‑
co
‑
*，
[0172]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；以及
[0173]
其中r1选自
[0174][0175][0176]
其中y1、y2、y3、y4、y5和y6独立地选自h、f、cl、chf2和cf3。
[0177]
在另一个实施方案中，所述修饰基团是式m1，其中y1和y2为h，并且y3为f或cf3；y4为h或f；并且y5为h且y6为f。
[0178]
在又一个实施方案中，所述修饰基团是式m1，其中n为1；
[0179]
w1代表nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*或nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的l
‑
形式，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且r1为
[0180][0181]
其中y1和y2为h；并且y3为f或cf3。
[0182]
在一个实施方案中，所述修饰基团是式m2：
[0183][0184]
其中w2不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w2代表nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，或nh
‑
ch2ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且
[0185]
其中r2选自
[0186][0187]
其中y7、y8、y9、y10、y11和y12独立地选自h、f、cl、chf2和cf3。
[0188]
在另一个实施方案中，所述修饰基团是式m2，其中y7为h；y8为h、cl、chf2或cf3；y9为h、f或cf3；y10为f；y11为h；并且y12为f；条件是y8和y9中只有一个为h。
[0189]
在又一个实施方案中，所述修饰基团是式m2，其中w2不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w2代表nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的l
‑
形式，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中r2为
[0190][0191]
其中y7和y8为h；并且y9为cl、chf2或cf3。
[0192]
在一个实施方案中，所述修饰基团是式m3：
[0193][0194]
其代表3,4
‑
二氨基
‑
吡咯烷的r,r或s,s，或r,s立体异构体；并且其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y13和y14独立地选自h、f、cl、chf2和cf3。
[0195]
在另一个实施方案中，所述修饰基团是式m3，其中y13为h或f；并且y14为h或cf3；条件是y13和y14中只有一个为h。
[0196]
在一个实施方案中，所述修饰基团是式m4：
[0197][0198]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点，并且其中y15和y16独立地选自h、f、cl、chf2和cf3。
[0199]
在另一个实施方案中，所述修饰基团是式m4，其中y15和y16独立地选自h和f。
[0200]
在又一个实施方案中，所述修饰基团是式m4，其中y15为h，并且y16为f。
[0201]
在一个实施方案中，所述修饰基团是式m5：
[0202][0203]
其中每个所述氨基酸残基独立地代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点。
[0204]
在一个实施方案中，所述修饰基团是式m6：
[0205]
[0206]
其中α
‑
氨基酸残基代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y17和y18独立地选自h、f、cl、chf2和cf3。
[0207]
在另一个实施方案中，所述修饰基团是式m6，其中y17为h或f；并且y18为h或f。
[0208]
在一个实施方案中，所述修饰基团是式m7：
[0209][0210]
其中w3不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w3代表nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点。在一个实施方案中，w3代表nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的l
‑
形式，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点。
[0211]
在一个实施方案中，所述修饰基团是式m8：
[0212][0213]
其中w4不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w4代表nh
‑
ch2‑
c(＝o)
‑
*，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y19为h、f、cl、chf2和cf3或sf5。
[0214]
在另一个实施方案中，所述修饰基团是式m8，其中y19为cf3或sf5。
[0215]
在又一个实施方案中，所述修饰基团是式m8，其中y19为cf3。
[0216]
在一个实施方案中，所述修饰基团是式m9：
[0217][0218]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y20、y21和y22中的每一个独立地选自h、f、cl、chf2和cf3。
[0219]
在另一个实施方案中，所述修饰基团是式m9，其中y20、y21和y22中的每一个独立地选自h和f；条件是当y21为f时，y20和y22为h；并且当y21为h时，y20和y22为f。
[0220]
在一个实施方案中，所述修饰基团是式m10：
[0221][0222]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点。
[0223]
在一个实施方案中，所述修饰基团是式m11：
[0224][0225]
其中每个所述氨基酸残基代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点。
[0226]
本发明的化合物
[0227]
在一个实施方案中，本发明的化合物包含人胰岛素或人胰岛素类似物；以及一个或多个修饰基团m，其中每个修饰基团m包含两个芳基部分，其中硼原子附接至所述两个芳基部分中的每一个；并且其中所述一个或多个修饰基团m中的每一个任选地经由间隔体附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物的a链或b链的n末端氨基酸残基的氨基，或者附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物中赖氨酸的ε氨基。
[0228]
在另一个实施方案中，本发明的化合物包含人胰岛素或人胰岛素类似物；以及2个修饰基团m，其中每个修饰基团m包含两个芳基部分，其中硼原子附接至所述两个芳基部分中的每一个；并且其中第一修饰基团m附接至所述人胰岛素类似物b链的位置1或位置4处的赖氨酸残基的ε氨基，或者附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的可选肽间隔体中赖氨酸的ε氨基；并且第二修饰基团附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置22或位置29处的赖氨酸的ε氨基。
[0229]
在另一个实施方案中，本发明的化合物包含人胰岛素或人胰岛素类似物；以及2个修饰基团m，其中每个修饰基团m包含两个芳基部分，其中硼原子附接至所述两个芳基部分中的每一个；并且其中第一修饰基团m附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物a链的n末端氨基酸残基的氨基；并且第二修饰基团附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置
29处的赖氨酸的ε氨基。
[0230]
在另一个实施方案中，本发明的化合物包含人胰岛素或人胰岛素类似物；以及2个修饰基团m，其中每个修饰基团m包含两个芳基部分，其中硼原子附接至所述两个芳基部分中的每一个；并且其中第一修饰基团m附接至所述人胰岛素类似物a链的位置22处的赖氨酸的ε氨基，或者附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物a链c末端的可选肽间隔体中赖氨酸的ε氨基；并且第二修饰基团附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置22或位置29处的赖氨酸的ε氨基。
[0231]
在另一个实施方案中，本发明的化合物包含人胰岛素或人胰岛素类似物；以及1个修饰基团m，其中该修饰基团m包含两个芳基部分，其中硼原子附接至所述两个芳基部分中的每一个；并且其中该修饰基团m附接至所述人胰岛素类似物a链的位置22处的赖氨酸的ε氨基，或者附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置22或位置29处的赖氨酸的ε氨基。
[0232]
在一个实施方案中，本发明涉及化合物，其独立地选自实施例181、205、210、211、227、233、234、239、240、241、272、273、280、284、285、288、291、300、301、324、327、331、333和335的化合物。
[0233]
在一个实施方案中，本发明涉及化合物，其独立地选自实施例181、205、210、211、227、233、234、239、240、241、272、273、280、285、288、291、300、301、327、331、333和335的化合物。
[0234]
在一个实施方案中，本发明的化合物是实施例181的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是205的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是210的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是211的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是227的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是233的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是234的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是239的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是240的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是241的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是272的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是273的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是280的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是284的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是285的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是288的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是291的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是300的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是301的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是324的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是327的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是331的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是333的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是335的化合物。
[0235]
中间产物
[0236]
此外，本发明提供了中间产物，其为新型胰岛素类似物或包含肽间隔体的胰岛素类似物的形式。
[0237]
因此，本发明还涉及独立地选自下组的中间产物：
[0238]
a14e desb1
‑
b2 b4k b5p desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:16)；
[0239]
a14e desb1
‑
b2 b3g b4k b5p desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:17)；
[0240]
a14e b
‑
1g b1k b2p desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:18)；
[0241]
a22k b22k b29r desb30人胰岛素(seq id no:6和seq id no:20)；
[0242]
a21q(ges)3k desb30人胰岛素(seq id no:8和seq id no:11)；
[0243]
a21q(ges)6k desb30人胰岛素(seq id no:9和seq id no:11)；
[0244]
a21q(ges)12k desb30人胰岛素(seq id no:10和seq id no:11)；
[0245]
b1
‑
kpggggsggggsggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:21)；
[0246]
b1
‑
kpggggsggggsggggs a14e b25h desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:22)；
[0247]
b1
‑
gkpggggsggggsggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:23)；
[0248]
b1
‑
gkpggggsggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:24)；
[0249]
b1
‑
gkpggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:25)；
[0250]
b1
‑
gkpg desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:26)；
[0251]
b1
‑
gkprgffytpggggsggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:27)；和
[0252]
b1
‑
tyffgrkpdggggsggggsggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:28)。
[0253]
胰岛素功能
[0254]
胰岛素类似物对人胰岛素受体(ir)的相对结合亲和力可以通过如实施例b所述的闪烁迫近测定(spa)中的竞争结合来确定。
[0255]
在一个实施方案中，本发明的化合物具有与胰岛素受体结合的能力。在一个实施方案中，与不存在葡萄糖时相比，在20mm葡萄糖的存在下，本发明的化合物具有更高的胰岛素受体亲和力。
[0256]
实施例c中描述了akt磷酸化测定，并且实施例d中描述的脂肪生成测定可以用作胰岛素类似物的功能(激动性)活性的量度。
[0257]
药物组合物
[0258]
本发明还涉及药物组合物，其包含本发明的化合物，包括例如本发明的类似物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，以及一种或多种药学上可接受的辅料。这类组合物可以如本领域所知的那样制备。
[0259]
术语“辅料”宽泛地指除活性治疗成分以外的任何组分。辅料可以是惰性物质、无活性物质和/或非药学活性物质。辅料可用于各种目的，例如作为载体、媒介物、稀释剂和/或用来改善活性物质的给药和/或吸收。辅料的非限制性实例是：溶剂、稀释剂、缓冲液、防腐剂、张度调节剂、螯合剂和稳定剂。药学活性成分与各种辅料的配制是本领域已知的，参见例如remington:the science and practice of pharmacy(例如第21版(2005)和任何后续版本)。
[0260]
本发明的组合物可以是液体制剂的形式，即，包含水的水性制剂。液体制剂可以是溶液或悬浮液。本发明的组合物可以用于肠胃外给药，例如通过皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射进行。
[0261]
芳基硼化合物在ph接近中性值的水溶液中通常具有低稳定性。c
‑
b键可以水解，从而生成苯基残基和游离硼酸盐，ph
‑
h b(oh)3，或者该化合物可被氧化以生成酚残基 游离硼酸盐，ph
‑
oh b(oh)3。发现本发明的某些优选二硼化合物和二硼胰岛素缀合物比本发明
的其他芳基
‑
硼和一般的芳基
‑
硼更稳定。例如，可以通过在25或37摄氏度下在中性ph的水溶液中放置延长的一段时间，例如一周，之后测量胰岛素衍生物的纯度来评估稳定性。
[0262]
药物适应症
[0263]
糖尿病
[0264]
术语“糖尿病”包括1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病(妊娠期间)和引起高血糖症的其他状态。该术语用于其中胰腺产生的胰岛素量不足，或者其中身体细胞对胰岛素没有适当反应从而阻止细胞吸收葡萄糖的代谢紊乱。结果，葡萄糖在血液中积聚。
[0265]
1型糖尿病，也称为胰岛素依赖型糖尿病(iddm)和幼年型糖尿病，是由β
‑
细胞破坏引起的，通常导致绝对胰岛素缺乏。
[0266]
2型糖尿病，也称为非胰岛素依赖型糖尿病(niddm)和成年型糖尿病，与主要的胰岛素抵抗相关，因此与相对胰岛素缺乏相关，和/或与主要的胰岛素分泌缺陷伴胰岛素抵抗相关。
[0267]
其他适应症
[0268]
在一个实施方案中，根据本发明的化合物用于制备用于治疗或预防包括应激诱发的高血糖症在内的高血糖症、2型糖尿病、糖耐量减低或1型糖尿病的药物。
[0269]
在另一个实施方案中，根据本发明的化合物用作延迟或预防2型糖尿病的疾病进展的药物。
[0270]
在本发明的一个实施方案中，所述化合物用作治疗或预防包括应激诱发的高血糖症在内的高血糖症、2型糖尿病、糖耐量减低或1型糖尿病的药物。
[0271]
在进一步的实施方案中，本发明涉及治疗或预防包括应激诱发的高血糖症在内的高血糖症、2型糖尿病、糖耐量减低或1型糖尿病的方法，该方法包括向需要这种治疗的患者施用有效量的采用本发明化合物的这类治疗。
[0272]
给药方式
[0273]
术语“治疗”旨在包括预防和最小化所提及的疾病、病症或病况(即，“治疗”是指预防性和治疗性施用本发明的化合物或包含本发明化合物的组合物，除非另有说明或与上下文明显矛盾)。
[0274]
给药途径可以是有效地将本发明化合物输送至身体中的所需或适当位置的任何途径，诸如肠胃外，例如皮下、肌肉内或静脉内途径。
[0275]
对于肠胃外给药，与已知胰岛素的制剂类似地配制本发明的化合物。此外，对于肠胃外给药，与已知胰岛素的施用类似地施用本发明的化合物，医生熟悉该程序。
[0276]
与熟悉糖尿病治疗的医师协商决定待施用的本发明化合物的量，确定本发明化合物的给药频率，以及选择哪种或哪些本发明化合物任选地与另一抗糖尿病化合物一起施用。
[0277]
虽然本文已经阐述并描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、改变和等同方案。因此，应当理解，意欲以所附实施方案涵盖所有这些落入本发明真正范围内的修改和变化。
[0278]
实施方案
[0279]
通过以下本发明的非限制性实施方案进一步描述本发明：
[0280]
1.化合物，其包含：
[0281]
i)人胰岛素或人胰岛素类似物；以及
[0282]
ii)一个或多个修饰基团m，其中每个修饰基团m包含两个芳基部分，其中硼原子附接至所述两个芳基部分中的每一个；并且
[0283]
其中所述一个或多个修饰基团m中的每一个任选地经由间隔体附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物的a链或b链的n末端氨基酸残基的氨基，或者附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物中赖氨酸的ε氨基。
[0284]
2.根据实施方案1所述的化合物，其中每个所述修饰基团m独立地选自
[0285][0286]
其代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且
[0287]
其中n代表1至4范围内的整数；
[0288]
其中w1不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w1代表
[0289]
nh
‑
ch2‑
c(＝o)
‑
*，
[0290]
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*，
[0291]
nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，
[0292]
nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，或
[0293]
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
nh
‑
(ch2)2‑
o
‑
(ch2)2‑
o
‑
ch2‑
co
‑
*，
[0294]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；以及
[0295]
其中r1选自
[0296][0297]
其中y1、y2、y3、y4、y5和y6独立地选自h、f、cl、chf2和cf3；
[0298][0299]
其中w2不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w2代表nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，或nh
‑
ch2ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且
[0300]
其中r2选自
[0301][0302]
其中y7、y8、y9、y10、y11和y12独立地选自h、f、cl、chf2和cf3；
[0303][0304]
其代表3,4
‑
二氨基
‑
吡咯烷的r,r或s,s或r,s立体异构体；并且其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y13和y14独立地选自h、f、cl、chf2和cf3；
[0305][0306]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点，并且其中y15和y16独立地选自h、f、cl、chf2和cf3；
[0307][0308]
其中每个所述氨基酸残基独立地代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；
[0309][0310]
其中α
‑
氨基酸残基代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y17和y18独立地选自h、f、cl、chf2和cf3；
[0311][0312]
其中w3不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w3代表nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；
[0313][0314]
其中w4不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w4代表nh
‑
ch2‑
c(＝o)
‑
*，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y19为h、f、cl、chf2和cf3或sf5；
[0315][0316]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y20、y21和y22中的每一个独立地选自h、f、cl、chf2和cf3；
[0317][0318]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；以及
[0319][0320]
其中每个所述氨基酸残基独立地代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点。
[0321]
3.根据实施方案1至2中任一项所述的化合物，其中每个所述修饰基团m独立地选自
[0322][0323]
其代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且
[0324]
其中n代表1至4范围内的整数；
[0325]
其中w1不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w1代表
[0326]
nh
‑
ch2‑
c(＝o)
‑
*，
[0327]
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*，
[0328]
nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，
[0329]
nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，或
[0330]
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
nh
‑
(ch2)2‑
o
‑
(ch2)2‑
o
‑
ch2‑
co
‑
*，
[0331]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；以及
[0332]
其中r1选自
[0333][0334]
其中y1和y2为h，并且y3为f或cf3；y4为h或f；并且y5为h且y6为f；
[0335][0336]
其中w2不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w2代表nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，或nh
‑
ch2ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且
[0337]
其中r2选自
[0338][0339]
其中y7为h；y8为h、cl、chf2或cf3；y9为h、f或cf3；y10为f；y11为h；并且y12为f；条
件是y8和y9中只有一个为h；
[0340][0341]
其代表3,4
‑
二氨基
‑
吡咯烷的r,r或s,s或r,s立体异构体；并且其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y13为h或f；并且y14为h或cf3；条件是y13和y14中只有一个为h；
[0342][0343]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点，并且其中y15和y16独立地选自h和f；
[0344][0345]
其代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；
[0346][0347]
其中α
‑
氨基酸残基代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y17为h或f；并且y18为h或f；
[0348][0349]
其中w3不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w3代表nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；
[0350][0351]
其中w4不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w4代表nh
‑
ch2‑
c(＝o)
‑
*，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y19为cf3或sf5；
[0352][0353]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y20、y21和y22中的每一个独立地选自h和f；条件是当y21为f时，y20和y22为h；并且当y21为h时，y20和y22为f；
[0354]
[0355]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；以及
[0356][0357]
其中每个所述氨基酸残基独立地代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点。
[0358]
4.根据实施方案1至3中任一项所述的化合物，其中每个所述修饰基团m独立地选自
[0359][0360]
其代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且其中n为1；
[0361]
w1代表nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*或nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且
[0362]
r1为
[0363]
其中y1和y2为h；并且y3为f或cf3；
[0364][0365]
其中w2不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w2代表nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且
[0366]
其中r2为
[0367]
其中y7和y8为h；并且y9为cl、chf2或cf3；
[0368][0369]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y15为h，且y16为f；
[0370][0371]
其中w3不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w3代表nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；
[0372][0373]
其中w4不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w4代表nh
‑
ch2‑
c(＝o)
‑
*，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y19为cf3；以及
[0374][0375]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y20、y21和y22中的每一个独立地选自h和f；条件是当y21为f时，y20和y22为h；并且当y21为h时，y20和y22为f。
[0376]
5.根据实施方案1至4中任一项所述的化合物，其中所述修饰基团m是相同的。
[0377]
6.根据实施方案1至5中任一项所述的化合物，其中所述人胰岛素或人胰岛素类似物任选地包含选自下组的间隔体
[0378]
a)在所述人胰岛素或人胰岛素类似物的a链的c末端的肽间隔体，其中所述肽间隔体包含(ges)
p
k，其中p为3至12的整数；或者
[0379]
b)在所述人胰岛素或人胰岛素类似物的b链的n末端的肽间隔体或连接体l；
[0380]
其中所述肽间隔体包含gkpg、gkp(g4s)
q
、kp(g4s)
r
、gkprgffytp(g4s)
s
或tyffgrkpd
(g4s)
t
，其中q、r、s和t中的每一个独立地选自1至5的整数；并且
[0381]
其中所述连接体l选自
[0382][0383]
其中*1表示与修饰基团m的附接点，且*2表示与所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的氨基酸残基的氨基的附接点；
[0384][0385]
其中*1表示与修饰基团m的附接点，且*2表示与所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的氨基酸残基的氨基的附接点，并且其中u为1、2或3；以及
[0386][0387]
其中*1表示与修饰基团m的附接点，且*2表示与所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的氨基酸残基的氨基的附接点，并且其中v为2或3。
[0388]
7.根据实施方案6所述的化合物，其中q为选自1至3的整数；r为3；s为2；并且t为3。
[0389]
8.根据实施方案1至7中任一项所述的化合物，其中手性氨基酸为l
‑
形式。
[0390]
9.根据实施方案1至8中任一项所述的化合物，其中每个修饰基团m附接至选自以下基团之一的附接点：
[0391]
a)所述人胰岛素或人胰岛素类似物a链的n末端氨基酸残基的氨基；
[0392]
b)所述人胰岛素类似物a链的位置22处的赖氨酸的ε氨基；
[0393]
或
[0394]
所述人胰岛素或人胰岛素类似物a链c末端的所述可选肽间隔体中赖氨酸的ε氨基；
[0395]
c)所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的n末端氨基酸残基的氨基；
[0396]
所述人胰岛素类似物b链的位置1或位置4处的赖氨酸残基的ε氨基；
[0397]
所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的所述可选肽间隔体中赖氨酸的ε氨基；或者
[0398]
所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的所述可选连接体l中用*1标记的远端氨基；以及
[0399]
d)所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置22或位置29处的赖氨酸的ε氨基。
[0400]
10.根据实施方案9所述的化合物，其中不超过一个修饰基团m附接至基团a)、b)、c)和d)中的每一个内的附接点。
[0401]
11.根据实施方案1至10中任一项所述的化合物，其具有恰好一个、两个、三个或四个修饰基团m。
[0402]
12.根据实施方案1至10中任一项所述的化合物，其包含至少两个修饰基团m。
[0403]
13.根据实施方案1至10中任一项所述的化合物，其具有恰好两个、三个或四个修饰基团m。
[0404]
14.根据实施方案1至10中任一项所述的化合物，其具有恰好两个修饰基团m。
[0405]
15.根据实施方案1至14中任一项所述的化合物，其中所述人胰岛素或人胰岛素类似物是包含desb30的人胰岛素类似物。
[0406]
16.根据实施方案1至15中任一项所述的化合物，其中所述人胰岛素或人胰岛素类似物是选自下组的人胰岛素类似物
[0407]
desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:11)；
[0408]
a21q desb30人胰岛素(seq id no:3和seq id no:11)；
[0409]
a14e b25h desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:12)；
[0410]
a14e b1k b2p b25h desb27 desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:13)；
[0411]
a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素(seq id no:5和seq id no:14)；
[0412]
a14e a22k b25h b27p b28g desb30人胰岛素(seq id no:5和seq id no:15)；
[0413]
a14e desb1
‑
b2 b4k b5p desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:16)；
[0414]
a14e desb1
‑
b2 b3g b4k b5p desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:17)；
[0415]
a14e b
‑
1g b1k b2p desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:18)；
[0416]
a22k desb30人胰岛素(seq id no:6和seq id no:11)；
[0417]
a22k b29r desb30人胰岛素(seq id no:6和seq id no:19)；
[0418]
a22k b22k b29r desb30人胰岛素(seq id no:6和seq id no:20)；和
[0419]
a
‑
2k a
‑
1p desb30人胰岛素(seq id no:7和seq id no:11)。
[0420]
17.根据实施方案1所述的化合物，其包含
[0421]
i)人胰岛素或人胰岛素类似物，其中所述人胰岛素或人胰岛素类似物任选地在所述人胰岛素或人胰岛素类似物的b链的n末端包含选自肽间隔体的间隔体或连接体l；
[0422]
其中所述肽间隔体包含gkpg、gkp(g4s)
q
、kp(g4s)
r
、gkprgffytp(g4s)
s
或tyffgrkpd(g4s)
t
，其中q、r、s和t中的每一个独立地选自1至5的整数；并且
[0423]
其中所述连接体l选自
[0424][0425]
其中*1表示与修饰基团m的附接点，且*2表示与所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的氨基酸残基的氨基的附接点；
[0426][0427]
其中*1表示与修饰基团m的附接点，且*2表示与所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的氨基酸残基的氨基的附接点，并且其中u为1、2或3；以及
[0428][0429]
其中*1表示与修饰基团m的附接点，且*2表示与所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的氨基酸残基的氨基的附接点，并且其中v为2或3；
[0430]
ii)两个、三个或四个修饰基团m，其中每个所述修饰基团m独立地选自
[0431][0432]
其代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且
[0433]
其中n代表1至4范围内的整数；
[0434]
其中w1不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w1代表
[0435]
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*，
[0436]
nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，
[0437]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；以及
[0438]
其中r1选自
[0439][0440][0441]
其中y1和y2为h，并且y3为f或cf3；y4为f；并且y5为h且y6为f；
[0442][0443]
其中w2不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w2代表nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且
[0444]
其中r2选自
[0445][0446]
其中y7为h；y8为h、cl、chf2或cf3；y9为h、f或cf3；y10为f；y11为h；并且y12为f；条件是y8和y9中只有一个为h；
[0447][0448]
其代表3,4
‑
二氨基
‑
吡咯烷的r,r或s,s或r,s立体异构体；并且其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y13为h或f；并且y14为h或cf3；条件是y13和y14中只有一个为h；
[0449][0450]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y15为h，且y16为f；
[0451][0452]
其中α
‑
氨基酸残基代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y17为f；并且y18为h；
[0453][0454]
其中w3不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w3代表nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；
[0455][0456]
其中w4不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w4代表nh
‑
ch2‑
c(＝o)
‑
*，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y19为cf3或sf5；
[0457][0458]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y20、y21和y22中的每一个独立地选自h和f；条件是当y21为f时，y20和y22为h；并且当y21为h时，y20和y22为f；并且
[0459][0460]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且
[0461]
其中每个修饰基团m附接至选自以下基团之一的附接点：
[0462]
a)所述人胰岛素或人胰岛素类似物a链的n末端氨基酸残基的氨基；
[0463]
b)所述人胰岛素类似物a链的位置22处的赖氨酸的ε氨基；
[0464]
或
[0465]
所述人胰岛素或人胰岛素类似物a链c末端的所述可选肽间隔体中赖氨酸的ε氨基；
[0466]
c)所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的n末端氨基酸残基的氨基；
[0467]
所述人胰岛素类似物b链的位置1或位置4处的赖氨酸残基的ε氨基；
[0468]
所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的所述可选肽间隔体中赖氨酸的ε氨基；或者
[0469]
所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的所述可选连接体l中用*1标记的远端氨基；以及
[0470]
d)所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置22或位置29处的赖氨酸的ε氨基，
[0471]
其中一个修饰基团m附接至附接点c)之一，并且一个修饰基团m附接至附接点d)。
[0472]
18.根据实施方案17所述的化合物，其中不超过一个修饰基团m附接至基团a)、b)、c)和d)中的每一个内的附接点。
[0473]
19.根据实施方案17至18中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有恰好两个修饰基团m，其中一个修饰基团m附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置22或位置29处的赖氨酸的ε氨基；并且一个修饰基团m附接至
[0474]
所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的n末端氨基酸残基的氨基；
[0475]
所述人胰岛素类似物b链的位置1或位置4处的赖氨酸残基的ε氨基；
[0476]
所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的所述可选肽间隔体中赖氨酸的ε氨基；或者
[0477]
所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的所述可选连接体l中用*1标记的远端氨基。
[0478]
20.根据实施方案17至19中任一项所述的化合物，其包含
[0479]
i)人胰岛素或人胰岛素类似物，其中所述人胰岛素或人胰岛素类似物任选地在所述人胰岛素或人胰岛素类似物的b链的n末端包含肽间隔体；
[0480]
其中所述肽间隔体包含gkpg、gkp(g4s)
q
、kp(g4s)
r
、gkprgffytp(g4s)
s
或tyffgrkpd(g4s)
t
，其中q为1
‑
3的整数；r为3；s为2且t为3；
[0481]
ii)两个修饰基团m，其中每个所述修饰基团m独立地选自
[0482][0483]
其代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且其中n为1；w1代表
[0484]
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*或nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且
[0485]
其中r1为
[0486][0487]
其中y1和y2为h，并且y3为cf3；
[0488][0489]
其中w3不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w3代表nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；
[0490][0491]
其中w4不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w4代表nh
‑
ch2‑
c(＝o)
‑
*，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y19为cf3；
[0492][0493]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y20、y21和y22中的每一个独立地选自h和f；条件是当y21为f时，y20和y22为h；并且当y21为h时，y20和y22为f；并且
[0494]
其中一个修饰基团m附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置29处的赖氨酸的ε氨基；并且一个修饰基团m附接至
[0495]
所述人胰岛素类似物b链的位置1或位置4处的赖氨酸残基的ε氨基；或者
[0496]
所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的所述可选肽间隔体中赖氨酸的ε氨基。
[0497]
21.根据实施方案17至20中任一项所述的化合物，其包含
[0498]
i)人胰岛素类似物，其中所述人胰岛素类似物在所述人胰岛素或人胰岛素类似物
的b链的n末端包含肽间隔体；其中所述肽间隔体包含gkp(g4s)
q
或kp(g4s)
r
，其中q为1
‑
3的整数；并且r为3；
[0499]
ii)两个修饰基团m，其独立地选自
[0500][0501]
其代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且其中n为1；w1代表
[0502]
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*或nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且
[0503]
其中r1为
[0504][0505]
其中y1和y2为h，并且y3为cf3；
[0506]
其中一个修饰基团m附接至所述肽间隔体中的赖氨酸的ε氨基；并且一个修饰基团m附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置29处的赖氨酸的ε氨基。
[0507]
22.根据实施方案17
‑
19中任一项所述的化合物，其由以下成分组成
[0508]
i)人胰岛素类似物，其中所述人胰岛素类似物任选地在所述人胰岛素或人胰岛素类似物的b链的n末端包含肽间隔体；
[0509]
其中所述肽间隔体包含gkpg、gkp(g4s)
q
、kp(g4s)
r
、gkprgffytp(g4s)
s
或tyffgrkpd(g4s)
t
，其中q为1
‑
3的整数；r为3；s为2且t为3；
[0510]
ii)两个修饰基团m，其中每个所述修饰基团m独立地选自
[0511][0512]
其代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且其中n为1；w1代表
[0513]
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*或nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且
[0514]
其中r1为
[0515][0516]
其中y1和y2为h，并且y3为cf3；
[0517][0518]
其中w3不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w3代表nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；
[0519][0520]
其中w4不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w4代表nh
‑
ch2‑
c(＝o)
‑
*，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y19为cf3；
[0521][0522]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y20、y21和y22中的每一个独立地选自h和f；条件是当y21为f时，y20和y22为h；并且当y21为h时，y20和y22为f；并且
[0523]
其中一个修饰基团m附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置29处的赖氨酸的ε氨基；并且
[0524]
一个修饰基团m附接至：
[0525]
所述人胰岛素类似物b链的位置1或位置4处的赖氨酸残基的ε氨基，或者
[0526]
所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链n末端的所述可选肽间隔体中赖氨酸的ε氨基。
[0527]
23.根据实施方案17至22中任一项所述的化合物，其由以下成分组成
[0528]
i)人胰岛素类似物，其中所述人胰岛素类似物在所述人胰岛素或人胰岛素类似物的b链的n末端具有肽间隔体；其中所述肽间隔体是gkp(g4s)
q
或kp(g4s)
r
，其中q为1
‑
3的整数；并且r为3；
[0529]
ii)两个修饰基团m，其独立地选自
[0530][0531]
其代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且其中n为1；w1代表
[0532]
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*或nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且
[0533]
其中r1为
[0534][0535]
其中y1和y2为h，并且y3为cf3；
[0536]
其中一个修饰基团m附接至所述肽间隔体中的赖氨酸的ε氨基；并且一个修饰基团m附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置29处的赖氨酸的ε氨基。
[0537]
24.根据实施方案17至23中任一项所述的化合物，其中手性氨基酸为l
‑
形式。
[0538]
25.根据实施方案17至24中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有恰好2个修饰基团m。
[0539]
26.根据实施方案17至25中任一项所述的化合物，其中所述修饰基团m是相同的。
[0540]
27.根据实施方案17至26中任一项所述的化合物，其中所述人胰岛素类似物包含desb30。
[0541]
28.根据实施方案17至27中任一项所述的化合物，其中所述人胰岛素或人胰岛素类似物是选自下组的人胰岛素类似物
[0542]
desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:11)；
[0543]
a14e b25h desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:12)；
[0544]
a14e b1k b2p b25h desb27 desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:13)；
[0545]
a14e desb1
‑
b2 b4k b5p desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:16)；
[0546]
a14e desb1
‑
b2 b3g b4k b5p desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:17)；
[0547]
a14e b
‑
1g b1k b2p desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:18)；
[0548]
a22k desb30人胰岛素(seq id no:6和seq id no:11)；
[0549]
a22k b29r desb30人胰岛素(seq id no:6和seq id no:19)；和
[0550]
a22k b22k b29r desb30人胰岛素(seq id no:6和seq id no:20)。
[0551]
29.根据实施方案17至28中任一项所述的化合物，其中包含所述间隔体的所述人胰岛素类似物选自
[0552]
b1
‑
kpggggsggggsggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:21)；
[0553]
b1
‑
kpggggsggggsggggs a14e b25h desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:22)；
[0554]
b1
‑
gkpggggsggggsggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:23)；
[0555]
b1
‑
gkpggggsggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:24)；和
[0556]
b1
‑
gkpggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:25)。
[0557]
30.根据实施方案17至29中任一项所述的化合物，其中所述化合物选自：
[0558]
实施例280的化合物；实施例284的化合物；实施例285的化合物；实施例288的化合物；实施例291的化合物；实施例300的化合物；实施例301的化合物；实施例324的化合物；实施例327的化合物；实施例331的化合物；实施例333的化合物；和实施例335的化合物。
[0559]
31.根据实施方案17至30中任一项所述的化合物，其中所述化合物选自：
[0560]
实施例280的化合物；实施例285的化合物；实施例288的化合物；实施例291的化合物；实施例300的化合物；实施例301的化合物；实施例327的化合物；实施例331的化合物；实施例333的化合物；和实施例335的化合物。
[0561]
32.根据实施方案17至31中任一项所述的化合物，其中所述化合物是实施例280的化合物。
[0562]
33.根据实施方案17至31中任一项所述的化合物，其中所述化合物是实施例284的化合物。
[0563]
34.根据实施方案17至31中任一项所述的化合物，其中所述化合物是实施例285的化合物。
[0564]
35.根据实施方案17至31中任一项所述的化合物，其中所述化合物是实施例288的化合物。
[0565]
36.根据实施方案17至31中任一项所述的化合物，其中所述化合物是实施例291的化合物。
[0566]
37.根据实施方案17至31中任一项所述的化合物，其中所述化合物是实施例300的化合物。
[0567]
38.根据实施方案17至31中任一项所述的化合物，其中所述化合物是实施例301的化合物。
[0568]
39.根据实施方案17至31中任一项所述的化合物，其中所述化合物是实施例324的化合物。
[0569]
40.根据实施方案17至31中任一项所述的化合物，其中所述化合物是实施例327的化合物。
[0570]
41.根据实施方案17至31中任一项所述的化合物，其中所述化合物是实施例331的化合物。
[0571]
42.根据实施方案17至31中任一项所述的化合物，其中所述化合物是实施例333的化合物。
[0572]
43.根据实施方案17至31中任一项所述的化合物，其中所述化合物是实施例335的化合物。
[0573]
44.根据实施方案1所述的化合物，其包含
[0574]
i)人胰岛素或人胰岛素类似物；
[0575]
ii)两个修饰基团m，其独立地选自
[0576][0577]
其代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且
[0578]
其中n代表1至4范围内的整数；
[0579]
其中w1不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w1代表
[0580]
nh
‑
ch2‑
c(＝o)
‑
*，
[0581]
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*，
[0582]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且
[0583]
其中r1选自
[0584][0585]
其中y1和y2为h，并且y3为f或cf3；y4为h或f；并且y5为h且y6为f；
[0586][0587]
其中w2不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*；并且
[0588]
其中r2选自
[0589][0590]
其中y7为h；y8为h、cl、chf2或cf3；y9为h、f或cf3；y10为f；y11为h；并且y12为f；条件是y8和y9中只有一个为h；
[0591][0592]
其中α
‑
氨基酸残基代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y17为h或f；并且y18为h或f；以及
[0593][0594]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y20、y21和y22中的每一个独立地选自h和f；条件是当y21为f时，y20和y22为h；并且当y21为h时，y20和y22为f；并且
[0595]
其中一个修饰基团m附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物a链的n末端氨基酸残基的氨基；并且一个修饰基团m附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置29处的赖氨酸的ε氨基。
[0596]
45.根据实施方案44所述的化合物，其中所述修饰基团m是相同的。
[0597]
46.根据实施方案44至45中任一项所述的化合物，其中所述人胰岛素或人胰岛素类似物是包含desb30的人胰岛素类似物。
[0598]
47.根据实施方案46所述的化合物，其中所述人胰岛素类似物是desb30人胰岛素。
[0599]
48.根据实施方案1所述的化合物，其包含
[0600]
i)人胰岛素或人胰岛素类似物，其中所述人胰岛素或人胰岛素类似物任选地在所述人胰岛素或人胰岛素类似物的a链的c末端包含肽间隔体，其中所述肽间隔体包含(ges)
p
k，其中p为3至12的整数；
[0601]
ii)两个修饰基团m，其独立地选自
[0602][0603]
其代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且
[0604]
其中n代表1至4范围内的整数；
[0605]
其中w1不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w1代表
[0606]
nh
‑
ch2‑
c(＝o)
‑
*，
[0607]
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*，
[0608]
nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，
[0609]
nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，或
[0610]
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
nh
‑
(ch2)2‑
o
‑
(ch2)2‑
o
‑
ch2‑
co
‑
*，
[0611]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且
[0612]
其中r1选自
[0613][0614]
其中y1和y2为h，并且y3为f或cf3；y4为h或f；并且y5为h且y6为f；
[0615][0616]
其中w2不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w2代表nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，或nh
‑
ch2ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且
[0617]
其中r2选自
[0618][0619]
其中y7为h；y8为h、cl、chf2或cf3；y9为h、f或cf3；y10为f；y11为h；并且y12为f；条件是y8和y9中只有一个为h；
[0620][0621]
其代表3,4
‑
二氨基
‑
吡咯烷的r,r或s,s或r,s立体异构体；并且其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y13为h或f；并且y14为h或cf3；条件是y13和y14中只有一个为h；
[0622][0623]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点，并且其中y15和y16独立地选自h和f；
[0624][0625]
其中每个所述氨基酸残基代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；
[0626][0627]
其中α
‑
氨基酸残基代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y17为h或f；并且y18为h或f；
[0628][0629]
其中w3不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w3代表nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；
[0630][0631]
其中w4不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w4代表nh
‑
ch2‑
c(＝o)
‑
*，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y19为cf3或sf5；
[0632][0633]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y20、y21和y22中的每一个独立地选自h和f；条件是当y21为f时，y20和y22为h；并且当y21为h时，y20和y22为f；
[0634][0635]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且
[0636][0637]
其中每个所述氨基酸残基代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且
[0638]
其中一个修饰基团m附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置22或位置29处的赖氨酸的ε氨基；并且一个修饰基团m附接至：
[0639]
所述人胰岛素类似物a链的位置22处的赖氨酸的ε氨基；或
[0640]
所述人胰岛素或人胰岛素类似物a链c末端的所述可选肽间隔体中赖氨酸的ε氨基。
[0641]
49.根据实施方案48所述的化合物，其中手性氨基酸为l
‑
形式。
[0642]
50.根据实施方案48至49中任一项所述的化合物，其中所述修饰基团m是相同的。
[0643]
51.根据实施方案48至51中任一项所述的化合物，其中所述人胰岛素或人胰岛素类似物是包含desb30的人胰岛素类似物。
[0644]
52.根据实施方案48至51中任一项所述的化合物，其中所述人胰岛素或人胰岛素类似物选自：
[0645]
a21q desb30人胰岛素(seq id no:3和seq id no:11)；
[0646]
a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素(seq id no:5和seq id no:14)；
[0647]
a14e a22k b25h b27p b28g desb30人胰岛素(seq id no:5和seq id no:15)；
[0648]
a22k desb30人胰岛素(seq id no:6和seq id no:11)；和
[0649]
a22k b22k b29r desb30人胰岛素(seq id no:6和seq id no:20)。
[0650]
53.根据实施方案48至52中任一项所述的化合物，其中所述化合物选自：
[0651]
实施例227的化合物；实施例239的化合物；实施例240的化合物；实施例241的化合物；和实施例272的化合物。
[0652]
54.根据实施方案1所述的化合物，其包含
[0653]
i)人胰岛素或人胰岛素类似物；
[0654]
ii)一个修饰基团m，其选自
[0655][0656]
其代表d
‑
或l
‑
氨基酸形式，并且
[0657]
其中n代表1至4范围内的整数；
[0658]
其中w1不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w1代表
[0659]
nh
‑
ch2‑
c(＝o)
‑
*，
[0660]
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*，
[0661]
nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，
[0662]
nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，或
[0663]
nh
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
nh
‑
(ch2)2‑
o
‑
(ch2)2‑
o
‑
ch2‑
co
‑
*，
[0664]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且
[0665]
其中r1选自
[0666][0667]
其中y1和y2为h，并且y3为f或cf3；y4为h或f；并且y5为h且y6为f；
[0668][0669]
其中w2不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w2代表nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，或nh
‑
ch2ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且
[0670]
其中r2选自
[0671][0672]
其中y7为h；y8为h、cl、chf2或cf3；y9为h、f或cf3；y10为f；y11为h；并且y12为f；条件是y8和y9中只有一个为h；
[0673][0674]
其中w3不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w3代表nh
‑
ch(cooh)
‑
ch2ch2‑
c(＝o)
‑
*的d
‑
或l
‑
形式，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；
[0675][0676]
其中w4不存在并且代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点*，或者w4代表nh
‑
ch2‑
c(＝o)
‑
*，其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y19为cf3或sf5；
[0677][0678]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且其中y20、y21和y22中的每一个独立地选自h和f；条件是当y21为f时，y20和y22为h；并且当y21为h时，y20和y22为f；
[0679][0680]
其中*代表与所述人胰岛素或人胰岛素类似物的附接点；并且
[0681]
其中所述修饰基团m附接至所述人胰岛素类似物a链的位置22处的赖氨酸的ε氨基，或者附接至所述人胰岛素或人胰岛素类似物b链的位置22或位置29处的赖氨酸的ε氨基。
[0682]
55.根据实施方案54所述的化合物，其中所述人胰岛素或人胰岛素类似物是包含a22k和desb30的人胰岛素类似物。
[0683]
56.根据实施方案1至55中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有与胰岛素受体结合的能力。
[0684]
57.根据实施方案1至55中任一项所述的化合物，其中与不存在葡萄糖时相比，在20mm葡萄糖的存在下，所述化合物具有更高的胰岛素受体亲和力。
[0685]
58.根据实施方案1至55中任一项所述的化合物，其中与不存在葡萄糖时相比，在20mm葡萄糖的存在下，所述化合物具有至少3倍的胰岛素受体亲和力。
[0686]
59.根据实施方案1至55中任一项所述的化合物，其中与不存在葡萄糖时相比，在
20mm葡萄糖的存在下，所述化合物具有至少10倍的胰岛素受体亲和力。
[0687]
60.根据实施方案1至55中任一项所述的化合物，其中与不存在葡萄糖时相比，在20mm葡萄糖的存在下，所述化合物具有至少15倍的胰岛素受体亲和力。
[0688]
61.包含根据实施方案1
‑
55中任一项所述的化合物的组合物。
[0689]
62.根据实施方案1
‑
55中任一项所述的化合物，其用作药物。
[0690]
63.根据实施方案1
‑
55中任一项所述的化合物，其用于预防或治疗糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、糖耐量减低、高血糖症和代谢综合征(代谢综合征x、胰岛素抵抗综合征)。
[0691]
64.根据实施方案1
‑
55中任一项所述的化合物或根据实施方案61所述的组合物在制备用于治疗或预防糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、糖耐量减低、高血糖症和代谢综合征(代谢综合征x、胰岛素抵抗综合征)的药物中的用途。
[0692]
65.治疗或预防糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、糖耐量减低、高血糖症和代谢综合征(代谢综合征x、胰岛素抵抗综合征)的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据实施方案1
‑
55中任一项所述的化合物或根据实施方案61所述的组合物。
实施例
[0693]
材料与方法
[0694]
缩写列表
[0695]
aibn2,2
’‑
偶氮二异丁腈
[0696]
akt别称pkb，蛋白激酶b(pkb)
[0697]
alp水解无色杆菌(achromobactorlyticus)蛋白酶
[0698]
ar芳基
[0699]
ars茜素红钠
[0700]
c18十八烷基(hplc柱)
[0701]
cv柱体积
[0702]
dast二乙基氨基三氟化硫
[0703]
dbu1,8
‑
二氮杂双环(5.4.0)十一碳
‑7‑
烯
[0704]
dcm二氯甲烷
[0705]
dicn,n
‑
二异丙基碳二亚胺
[0706]
dmfn,n
‑
二甲基甲酰胺
[0707]
dipean,n
‑
二异丙基乙胺
[0708]
edc.hcln
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
n'
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐
[0709]
etoac乙酸乙酯
[0710]
ffc游离脂肪细胞(r，大鼠)
[0711]
fmoc
‑
osu9
‑
芴基甲基n
‑
琥珀酰亚胺基碳酸酯
[0712]
hatu1
‑
((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)
‑
1h
‑
[1,2,3]三唑并[4,5
‑
b]吡啶3
‑
氧化物六氟磷酸盐
[0713]
hbtu2
‑
(1h
‑
苯并三唑
‑1‑
基
‑
)
‑
1,1,3,3
‑
四甲基脲鎓六氟磷酸盐
[0714]
hepes4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸
[0715]
hir人胰岛素受体(a＝a同种型，b＝b同种型)
[0716]
hobt1
‑
羟基苯并三唑
[0717]
honsun
‑
羟基琥珀酰亚胺
[0718]
hrms高分辨率质谱法
[0719]
hsa人血清白蛋白
[0720]
kd置换常数
[0721]
lcms液相色谱质谱法
[0722]
mecn乙腈
[0723]
mm毫摩尔
[0724]
nbsn
‑
溴代琥珀酰亚胺
[0725]
n.d.无法检出
[0726]
nmmn
‑
甲基
‑
吗啉
[0727]
nmr核磁共振
[0728]
nmpn
‑
甲基
‑
吡咯烷酮
[0729]
oeg2
‑
(2
‑
氨基乙氧基)乙氧基
‑
乙酸(寡聚乙二醇氨基酸)
[0730]
oxyma氰基羟基亚氨基乙酸乙酯
[0731]
rp
‑
hplc反相高效液相色谱法
[0732]
ph苯基
[0733]
spa闪烁迫近测定
[0734]
tfa三氟乙酸
[0735]
thf四氢呋喃
[0736]
thpta三(3
‑
羟基丙基三唑基甲基)胺
[0737]
tstu琥珀酰亚胺基
‑
四甲基脲鎓四氟硼酸盐
[0738]
uplc超高效液相色谱法
[0739]
wga麦胚凝集素
[0740]
胰岛素变体的制备
[0741]
实施例1：胰岛素变体在酵母中的表达以及用alp等的转化
[0742]
使用公知的技术在酵母中表达胰岛素类似物，例如，如wo2017/032798中所公开的那样。更具体而言，将胰岛素类似物表达为单链前体，通过离子交换捕获将其分离，并通过如下所述的alp处理将其裂解为2条链的胰岛素类似物。
[0743]
在spsepharosebb上捕获前体：
[0744]
将酵母上清液以10
‑
20cv/h的流速上样到用spsepharosebb填充的柱上。用0.1m柠檬酸ph3.5洗涤，并用40％etoh进行洗涤。用0.2m乙酸钠ph5.5/35％etoh洗脱该类似物。
[0745]
alp消化：
[0746]
将单链前体的溶液调节至ph9，并以1:100(w/w)添加alp酶。在uplc上进行反应。将alp裂解合并物调节至ph2.5，并稀释2倍，以便为rp
‑
hplc纯化作准备。
[0747]
rp
‑
hplc纯化：
[0748]
如下所示通过rp
‑
hplcc18进行纯化：
[0749]
柱：15umc1850x250mm
[0750]
缓冲液：
[0751]
a：0.2％甲酸，5％etoh，
[0752]
b：0,2％甲酸，50％etoh
[0753]
梯度：20
‑
55％b
‑
缓冲液。
[0754]
梯度：20cv
[0755]
流速20cv/h
[0756]
上样g～5g/l树脂
[0757]
通过uplc分析级分，合并，并冷冻干燥。
[0758]
在以下实施例中制备并使用的胰岛素类似物：
[0759]
desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:11)；
[0760]
a14e b1k b2p b25h desb27 desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:13)；
[0761]
a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素(seq id no:5和seq id no:14)；
[0762]
a14e a22k b25h b27p b28g desb30人胰岛素(seq id no:5和seq id no:15)；
[0763]
a14e desb1
‑
b2 b4k b5p desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:16)；
[0764]
a14e desb1
‑
b2 b3g b4k b5p desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:17)；
[0765]
a14e b
‑
1g b1k b2p desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:18)；
[0766]
a22k desb30人胰岛素(seq id no:6和seq id no:11)；
[0767]
a22k b29r desb30人胰岛素(seq id no:6和seq id no:19)；
[0768]
a22k b22k b29r desb30人胰岛素(seq id no:6和seq id no:20)；
[0769]
a
‑
2k a
‑
1p desb30人胰岛素(seq id no:7和seq id no:11)；
[0770]
a21q(ges)3k desb30人胰岛素(seq id no:8和seq id no:11)；
[0771]
a21q(ges)6k desb30人胰岛素(seq id no:9和seq id no:11)；
[0772]
a21q(ges)12k desb30人胰岛素(seq id no:10和seq id no:11)；
[0773]
b1
‑
kpggggsggggsggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:21)；
[0774]
b1
‑
kpggggsggggsggggs a14e b25h desb30人胰岛素(seq id no:4和seq id no:22)；
[0775]
b1
‑
gkpggggsggggsggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:23)；
[0776]
b1
‑
gkpggggsggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:24)；
[0777]
b1
‑
gkpggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:25)；
[0778]
b1
‑
gkpg desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:26)；
[0779]
b1
‑
gkprgffytpggggsggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:27)；和
[0780]
b1
‑
tyffgrkpdggggsggggsggggs desb30人胰岛素(seq id no:1和seq id no:28)。
[0781]
b1
‑
gkprgffytpggggsggggs desb30人胰岛素是指从b1延伸gkprgffytpggggsggggs的desb30人胰岛素(从新的n末端g写起，c末端s连接至desb30人胰岛素的b1)。a21q(ges)3k desb30人胰岛素是指从a21q延伸gesgesgesk的胰岛素(从连接至c末端a21q的新的n末端g写起)。其他b1和a21延伸的胰岛素类似物也类似。b
‑
1表示处于b1的n端侧的位置，例如，b
‑
1g表示胰岛素b1的n末端延伸出g。
[0782]
结构单元的制备
[0783]
在每个实施例中，中间体和最终产物都给出了编号，以便于阅读。实施例之间使用了相同的数字，但每个实施例中的数字都是明确的。
[0784]
实施例2：3,5
‑
双[[[3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基]氨基]甲基]苯甲酸o
‑
琥珀酰亚胺酯
[0785][0786]
将2
‑
氟
‑4‑
羧基苯基硼酸(1，8.44g，45.9mmol)、频哪醇(5.42g，45.9mmol)和硫酸镁(60g)在四氢呋喃(110ml)中的混合物在室温下搅拌过夜。该悬浮液通过celite垫过滤，将滤液蒸发并真空干燥，得到呈米色粉末的3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸(2)。产量：10.4g(85％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：7.93
‑
7.80(m,2h)；7.75(d,j＝9.4hz,1h)；1.39(s,12h)。
[0787]
将羧酸2(10.3g，38.6mmol)溶解于二氯甲烷(130ml)中。添加1
‑
羟基
‑
吡咯烷
‑
2,5
‑
二酮(hosu，8.89g，77.2mmol)和n
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
n'
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc.hcl，14.8g，77.2mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在乙酸乙酯(130ml)与0.5m盐酸水溶液(130ml)之间分配。有机层用0.5m盐酸水溶液(3x120ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。将残余物溶解于二氯甲烷(40ml)中，并通过添加环己烷(130ml)进行沉淀。通过过滤收集产物，用环己烷洗涤，并真空干燥，得到呈白色粉末的3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸琥珀酰亚胺酯(3)。产量：13.9g(99％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：7.93
‑
7.84(m,2h)；7.77(d,j＝9.4hz,1h)；2.92(s,4h)；1.39(s,12h)。
[0788]
将3,5
‑
二甲基苯甲酸4(827.6g，18.4mmol)悬浮在甲醇(80ml)中，并用浓硫酸(8ml)处理。将混合物回流2天。用碳酸钠(50g)中和后，将混合物溶解于水(250ml)中，并用乙醚(2x300ml)萃取。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发至干，得到呈浅黄色油状物的3,5
‑
二甲基苯甲酸甲酯(5)。产量：29.3g(97％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：7.67(s,2h)；7.19(s,1h)；3.91(s,3h)；2.37(s,6h)。
[0789]
在加热至回流的同时，用可见光照射上述3,5
‑
二甲基苯甲酸甲酯5(29.3g,178mmol)、n
‑
溴代琥珀酰亚胺(nbs，111g，623mmol)和一刮刀偶氮二异丁腈在甲酸甲酯(450ml)中的混合物20小时。蒸发溶剂，并将残余物溶解于二氯甲烷(200ml)中。滤出沉淀的琥珀酰亚胺，并用饱和亚硫酸钠水溶液(2x150ml)洗涤滤液。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。通过急骤柱色谱法(硅胶60，0.040
‑
0.063mm；洗脱液：己烷/乙酸乙酯15:1)纯化残余物。产物从乙酸乙酯/环己烷混合物中结晶，得到呈白色固体的3,5
‑
双(溴甲基)苯甲酸甲酯(6)。产量：25.6g(45％)。rf(sio2，己烷/乙酸乙酯9:1)：0.50。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.02
‑
7.95(m,2h)；7.62(s,1h)；4.51(s,4h)；3.94(s,3h)。
[0790]
将上述溴化物6(25.3g，78.6mmol)和二甲酰胺钠(20.9g，220mmol)在无水乙腈
(350ml)中的悬浮液回流4小时。通过过滤除去白色固体后，蒸发溶剂。从乙酸乙酯/环己烷混合物中重结晶得到呈白色粉末的3,5
‑
双((n
‑
甲酰基甲酰胺基)甲基)苯甲酸甲酯(7)。
[0791]
产量：21.0g(88％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.08(s,4h)；7.72(s,2h)；7.44(s,1h)；4.70(s,4h)；3.84(s,3h)。
[0792]
将苯甲酸酯7(20.9g，68.5mmol)溶解于1,4
‑
二氧杂环己烷(220ml)和浓盐酸(280ml)的混合物中，并加热2小时至回流。冷却至室温后，使空气流通过该溶液。产物开始沉淀。1小时后，蒸发溶剂，产物从甲醇/乙醚混合物中重结晶，得到呈白色粉末的3,5
‑
双(氨基甲基)苯甲酸二盐酸盐(8)。产量：17.1g(98％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：13.26(bs,1h)；8.65(bs,6h)；8.10(s,2h)；7.88(s,1h)；4.08(s,4h)。
[0793]
将二盐酸盐8(2.08g，8.20mmol)溶解于水(20ml)中。随后添加n,n
‑
二异丙基乙胺(5.73ml，32.9mmol)、n,n
‑
二甲基甲酰胺(40ml)和活化酯(3，5.97g，16.4mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜；然后用1m盐酸水溶液酸化。溶剂与甲苯共蒸发3次。将残余物溶解于二氯甲烷/甲苯混合物(1:1，100ml)中，并用频哪醇(1.40g，11.8mmol)处理。将混合物从甲苯中蒸发3次。将残余物溶解于乙酸乙酯(250ml)中，并用水(3x150ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残余物溶解于二氯甲烷(10ml)中，产物开始沉淀。添加环己烷(170ml)。通过过滤收集沉淀物，用环己烷洗涤，并真空干燥，得到呈白色粉末的3,5
‑
双((3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)甲基)苯甲酸(9)。产量：4.18g(75％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：12.96(bs,1h)；9.27(t,j＝5.9hz,2h)；7.82
‑
7.67(m,6h)；7.64
‑
7.56(m,2h)；7.53(s,1h)；4.58
‑
4.44(m,4h)；1.31(s,24h)。
[0794]
将上述酸9(4.17g，6.20mmol)溶解于乙腈/n,n
‑
二甲基甲酰胺混合物(4:1，100ml)中。添加n
‑
羟基琥珀酰亚胺(hosu，0.85g，7.40mmol)。将混合物冷却至0℃，然后添加n,n
‑
二环己基碳二亚胺(dcc，1.53g，7.40mmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟，并在室温下过夜。滤出不溶性副产物，并蒸发滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯(250ml)中，并用水(2x150ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残余物溶解于二氯甲烷(10ml)中，产物开始沉淀。添加环己烷(170ml)。通过过滤收集沉淀物，用环己烷洗涤，并真空干燥，得到呈白色粉末的3,5
‑
双[[[3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基]氨基]甲基]苯甲酸o
‑
琥珀酰亚胺酯(10)。产量：4.62g(97％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.31(t,j＝5.7hz,2h)；7.93(s,2h)；7.79
‑
7.68(m,5h)；7.63
‑
7.56(m,2h)；4.60
‑
4.50(m,4h)；2.87(s,4h)；1.31(s,24h)。lc
‑
ms:773.4(m h)

，计算值773.4。
[0795]
实施例3：o
‑
琥珀酰亚胺基n,n
‑
双(3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基
‑
lys
‑
beta
‑
ala
[0796][0797]
将2
‑
氯三苯甲基树脂100
‑
200目1.8mmol/g 1(53.3g，96.0mmol)在无水二氯甲烷(350ml)中溶胀20分钟。然后过滤树脂，并用无水二氯甲烷(300ml)洗涤。之后，将fmoc
‑
ala
‑
oh(24.9g，80.0mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(55.7ml,320mmol)在无水二氯甲烷(250ml)中的溶液添加到树脂中，并将混合物振摇过夜。之后过滤树脂，并用n,n
‑
二异丙基乙胺(50ml)在甲醇/二氯甲烷混合物(4:1，2x5min，2x250ml)中的溶液处理。然后过滤树脂，并用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x250ml)、二氯甲烷(2x250ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x250ml)洗涤。通过用在n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶溶液(1x5min，1x30min，2x250ml)处理去除fmoc基团。之后过滤树脂，并用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x250ml)、二氯甲烷(2x250ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x250ml)洗涤。之后将fmoc
‑
l
‑
lys(boc)
‑
oh(56.2g，120mmol)、5
‑
氯
‑1‑
((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)
‑
1h
‑
苯并[d][1,2,3]三唑
‑3‑
氧化物四氟硼酸盐(tctu，42.7g，120mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(34.8ml，200mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(180ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇3小时。之后过滤树脂，并用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x250ml)、二氯甲烷(2x250ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x250ml)洗涤。通过用在n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶溶液(1x5min，1x30min，2x300ml)处理去除fmoc基团。然后过滤树脂，并用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x300ml)、二氯甲烷(2x300ml)、甲醇(2x300ml)和二氯甲烷(10x300ml)洗涤。通过用2,2,2
‑
三氟乙醇(300ml)处理过夜，从树脂上切下产物。滤出树脂，并用二氯甲烷(2x200ml)、2
‑
丙醇(2x200ml)和二氯甲烷(2x200ml)洗涤。减压去除溶剂，并在乙醚(2x300ml)中研磨残余物。过滤并干燥后，我们获得了呈灰白色粉末的l
‑
lys(boc)
‑
beta
‑
ala(2)。产量：13.3g(56％)。1h nmr谱(300mhz,acod
‑
d4,δ
h
)：4.20(t,j＝7.1hz,1h)；3.66
‑
3.46(m,2h)；3.17
‑
3.00(m,2h)；2.65(t,j＝6.4hz,2h)；1.97
‑
1.80(m,2h)；1.60
‑
1.30(m,13h)。
[0798]
将95％三氟乙酸水溶液(60ml)加入到2(13.2g，41.6mmol)在二氯甲烷(50ml)中的悬浮液中，并将整个混合物搅拌2小时。然后减压除去溶剂，并在真空中干燥残余物，得到呈棕色油状物的l
‑
lys
‑
beta
‑
ala tfa盐(3)。产量：18.5g(100％)。1h nmr谱(300mhz,acod
‑
d4,δ
h
)：4.24(t,j＝6.7hz,1h)；3.71
‑
3.46(m,2h)；3.09(t,j＝7.5hz,2h)；2.66(t,j＝6.6hz,2h)；2.01
‑
1.89(m,2h)；1.85
‑
1.68(m,2h)；1.60
‑
1.46(m,2h)。
[0799]
将三乙胺(14.1ml，101mmol)加入到3(15.0g，33.7mmol)在乙腈中的溶液中，得到灰白色沉淀物。过滤并干燥后，获得呈白色吸湿性粉末的l
‑
lys
‑
beta
‑
ala(4)。产量：7.30g
(100％)。1h nmr谱(300mhz,acod
‑
d4,δ
h
)：4.21(t,j＝6.4hz,1h)；3.72
‑
3.45(m,2h)；3.08(t,j＝7.4hz,2h)；2.65(t,j＝6.0hz,2h)；2.00
‑
1.88(m,2h)；1.83
‑
1.66(m,2h)；1.59
‑
1.43(m,2h)。
[0800]
将3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸琥珀酰亚胺酯5(5.00g，13.8mmol)添加到4(3.00g，13.8mmol)和三乙胺(7.74ml，55.5mmol)在无水乙腈(80ml)中的悬浮液中，并将整个混合物搅拌过夜。然后减压除去溶剂，并与甲苯共蒸发3次。之后添加乙酸乙酯(70ml)，并将混合物用水(3x50ml)洗涤。分离有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残余物溶解于二氯甲烷(2ml)中，并逐滴添加到剧烈搅拌的环己烷(100ml)中。通过过滤收集沉淀物，用环己烷洗涤，并真空干燥，得到呈白色粉末的n,n
‑
双(3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基
‑
lys
‑
beta
‑
ala(6)。产量：2.31g(47％)。1h nmr谱(300mhz,acod
‑
d4,δ
h
)：7.83
‑
7.73(m,2h)；7.71
‑
7.45(m,4h)；4.77(t,j＝7.2hz,1h)；3.61
‑
3.39(m,4h)；2.64(t,j＝6.2hz,2h)；2.00
‑
1.80(m,2h)；1.77
‑
1.47(m,4h)；1.37(s,24h)。
[0801]
将n
‑
羟基琥珀酰亚胺(hosu，0.97g，8.41mmol)加入到6(2.00g，2.80mmol)在无水乙腈(70ml)中的溶液中。将混合物冷却至0℃，然后添加n,n
‑
二环己基碳二亚胺(dcc，0.87g，4.20mmol)。30分钟后，使反应混合物升温至室温并搅拌过夜。滤出不溶性副产物，并蒸发滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯(100ml)中，并用1m盐酸水溶液(3x70ml)、水(70ml)和盐水(70ml)洗涤。分离有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残余物与频哪醇在甲苯中共蒸发五次。然后将残余物溶解于乙酸乙酯(100ml)中，并用0.1m盐酸水溶液(70ml)、水(70ml)和盐水(70ml)洗涤。分离有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残余物溶解于二氯甲烷(3ml)中，并逐滴添加到剧烈搅拌的环己烷/乙醚混合物(10:1，110ml)中。通过过滤收集沉淀物，用环己烷洗涤，并真空干燥。通过与二氯甲烷共蒸发五次除去残留的环己烷。干燥后，获得呈灰白色泡沫的o
‑
琥珀酰亚胺基n,n
‑
双(3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基
‑
lys
‑
beta
‑
ala(7)。产量：1.12g(48％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δ
h
)：7.83
‑
7.71(m,2h)；7.62
‑
7.40(m,4h)；7.19(d,j＝7.7hz,1h)；7.02(t,j＝6.1hz,1h)；6.68(t,j＝5.6hz,1h)；4.67(m,1h)；3.73
‑
3.62(m,2h)；
[0802]
3.44(q,j＝6.2hz,2h)；2.90
‑
2.78(m,6h)；2.07
‑
1.60(m,4h)；1.53
‑
1.30(m,26h)。lc
‑
ms:810.5(m h)

，计算值810.4。
[0803]
实施例4：o
‑
琥珀酰亚胺基n,n
‑
双(3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基
‑
lys
‑
gly
[0804][0805]
将2
‑
氟
‑4‑
羧基苯基硼酸(1，4.95g，27.0mmol)、频哪醇(3.21g，27.2mmol)和硫酸镁(450g)在四氢呋喃(90ml)中的混合物在室温下搅拌过夜。该悬浮液通过celite垫过滤，将滤液蒸发并真空干燥，得到呈黄色粉末的3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸(2)。产量：7.06g(98％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：7.93
‑
7.80(m,2h)；7.76(d,j＝9.4hz,1h)；1.39(s,12h)。
[0806]
将羧酸2(7.05g，26.5mmol)溶解于二氯甲烷(100ml)中。添加n
‑
羟基琥珀酰亚胺(hosu，6.10g，53.0mmol)和n
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
n'
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc.hcl，10.2g，53.0mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在乙酸乙酯(110ml)与0.1m盐酸水溶液(110ml)之间分配。有机层用0.1m盐酸水溶液(2x100ml)和盐水(1x100ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。将残余物溶解于二氯甲烷(20ml)中，并通过添加环己烷(120ml)进行沉淀。通过过滤收集产物，用环己烷洗涤，并真空干燥，得到呈白色粉末的3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸琥珀酰亚胺酯(3)。产量：9.60g(99％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δ
h
)：7.96
‑
7.89(m,2h)；7.79(d,j＝9.4hz,1h)；2.91(s,4h)；1.33(s,12h)。
[0807]
将l
‑
lys
‑
gly tfa盐4(2.67g，6.20mmol)溶解于水(20ml)中。随后添加n,n
‑
二异丙基乙胺(4.32ml，24.8mmol)、n,n
‑
二甲基甲酰胺(40ml)和2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸酯(3，4.50g，12.4mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜；然后用1m盐酸水溶液酸化。溶剂与甲苯共蒸发3次。将残余物溶解于二氯甲烷/甲苯混合物(1:1，100ml)中，并用频哪醇(1.00g，8.46mmol)处理。将混合物从甲苯中蒸发3次。将残余物溶解于乙酸乙酯(250ml)中，并用水(3x150ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残余物溶解于二氯甲烷(10ml)中，并逐滴添加到冷环己烷(200ml)中。通过过滤收集沉淀物，用环己烷洗涤，并真空干燥。将固体溶解于二氯甲烷(10ml)中。添加乙醚(10ml)和环己烷(150ml)。倾析溶剂，并真空干燥残余物，得到呈米色固体的n,n
’‑
双(3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基)
‑
l
‑
赖氨酰基甘氨酸(5)。产量：1.60g(37％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：7.91
‑
7.79(m,2h)；7.78
‑
7.64(m,2h)；7.58
‑
7.34(m,4h)；7.19
‑
7.07(m,1h)；4.86
‑
4.72(m,1h)；4.15
‑
3.88(m,2h)；3.47
‑
3.25(m,2h)；2.00
‑
1.74(m,2h)；1.66
‑
1.52(m,2h)；1.50
‑
1.37(m,2h)；1.34(s,24h)。lc
‑
ms:699.3(m h)

,617.2(m h
‑
频哪醇)

,535.0(m h
‑
2x频哪醇)

。
[0808]
将上述酸5(1.59g，2.30mmol)溶解于二氯甲烷(70ml)中。添加n
‑
羟基琥珀酰亚胺(hosu，0.31g，2.70mmol)和n
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
n'
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc.hcl，0.65g，3.40mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5小时。用0.1m盐酸水溶液(2x80ml)和盐水(1x80ml)洗涤混合物。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干，得到呈米色固体的o
‑
琥珀酰亚胺基n,n
‑
双(3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基
‑
lys
‑
gly(6)。产量：1.29g(70％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δ
h
)：8.73
‑
8.53(m,3h)；7.78
‑
7.61(m,5h)；7.54(d,j＝10.4hz,1h)；4.52
‑
4.40(m,1h)；4.36
‑
4.17(m,2h)；3.29
‑
3.17(m,2h)；2.81(s,4h)；1.87
‑
1.68(m,2h)；1.59
‑
1.47(m,2h)；1.46
‑
1.36(m,2h)；1.31(s,24h)。lc
‑
ms:796.4(m h)

，计算值796.4。
[0809]
实施例5：2
‑
((23
‑
(3,5
‑
双((3
‑
(3
‑
乙酰氧基
‑
2,2
‑
双(乙酰氧基甲基)丙氧基)丙酰胺基)甲基)苯甲酰胺基)
‑
7,16
‑
二氧代
‑
3,9,12,18,21
‑
五氧杂
‑
6,15
‑
二氮杂二十三基)氧基)
‑
n
‑
(4
‑
甲酰基苄基)乙酰胺
[0810][0811]
将季戊四醇(136g，1.00mol)、氢氧化钠(8.00g，200mmol)、二甲基亚砜(200ml)和水(18ml)的混合物在80℃下加热，直至形成澄清溶液(过夜)。添加丙烯酸丁酯(2，174ml，1.20mol)，并将所得混合物在80℃下加热24小时；然后将其冷却至室温，用水(200ml)稀释，并用乙酸乙酯(3x400ml)萃取。将合并的有机层用水(400ml)和盐水(100ml)洗涤。由于水洗液含有产物(3)，将它们合并并用乙酸乙酯(2x200ml)重新萃取。合并所有乙酸乙酯级分，经无水硫酸钠干燥，并蒸发至干。通过急骤柱色谱法(硅胶60，0.040
‑
0.063mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇99:1
‑
90:10)纯化残余物，得到呈无色油状物的3
‑
(3
‑
羟基
‑
2,2
‑
双(羟基甲基)丙氧基)丙酸叔丁酯(3)。
[0812]
产量：39.7g(15％)。rf(sio2，二氯甲烷/甲醇9:1)：0.30。
[0813]
1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：3.67(t,j＝5.6hz,2h)；3.65(s,6h)；3.52(s,2h)；2.73(bs,3h)；2.49(t,j＝5.7hz,2h)；1.46(s,9h)。lc
‑
ms:287.2(m na) 。
[0814]
在0℃下，将乙酸酐(95.6ml，350mmol)加入到上述3
‑
(3
‑
羟基
‑
2,2
‑
双(羟基甲基)丙氧基)丙酸叔丁酯(3，74.5g，281mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(88.1ml,506mmol)在无水二氯甲烷(600ml)中的溶液中。移除冷却浴，并将所得溶液在室温下搅拌过夜。在真空中除去挥发物；将残余物重新溶解于乙酸乙酯(2l)中，并用水(600ml)、0.5m盐酸水溶液(1.2l)、水(600ml)、10％碳酸氢钾水溶液(600ml)、水(600ml)和盐水(230ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，并蒸发至干。通过急骤柱色谱法(硅胶60，0.040
‑
0.063mm；洗脱液：环己烷/乙酸乙酯9:1
‑
8:2)纯化残余物，得到呈无色油状物的2
‑
(乙酰氧基甲基)
‑2‑
((3
‑
(叔丁氧基)
‑3‑
氧
代丙氧基)甲基)丙烷
‑
1,3
‑
二基二乙酸酯(4)。
[0815]
产量：86.7g(79％)。rf(sio2，己烷/乙酸乙酯3:2)：0.40。1hnmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：4.11(s,6h)；3.65(t,j＝6.2hz,2h)；3.44(s,2h)；2.45(t,j＝6.3hz,2h)；2.06(s,9h)；1.46(s,9h)。lc
‑
ms:413.2(m na) 。
[0816]
将三氟乙酸(300ml)加入到上述2
‑
(乙酰氧基甲基)
‑2‑
((3
‑
(叔丁氧基)
‑3‑
氧代丙氧基)甲基)丙烷
‑
1,3
‑
二基二乙酸酯(4，86.0g，220mmol)在二氯甲烷(100ml)中的溶液中。将所得溶液在室温下搅拌2小时，然后将其蒸发至干，并将残余物从甲苯(3x150ml)中蒸发。通过急骤柱色谱法(硅胶60，0.040
‑
0.063mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇10:0
‑
9:1)纯化残余物，蒸发含有产物的级分，得到呈浅棕色油状物的标题化合物(5)。
[0817]
产量：70.4g(96％)。rf(sio2，己烷/乙酸乙酯1:1)：0.25。1hnmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：4.10(s,6h)；3.69(t,j＝6.1hz,2h)；3.46(s,2h)；2.60(t,j＝6.1hz,2h)；2.06(s,9h)。lc
‑
ms:357.2(m na) 。
[0818]
让2
‑
氯三苯甲基树脂100
‑
200目1.5mmol/g(10.7g，16.0mmol)在无水二氯甲烷(100ml)中溶胀20分钟。将{2
‑
[2
‑
(9h
‑
芴
‑9‑
基甲氧羰基氨基)
‑
乙氧基]
‑
乙氧基}
‑
乙酸(fmoc
‑
oeg
‑
oh，4.12g，10.7mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(7.07ml，40.6mmol)在无水二氯甲烷(20ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇16小时。过滤树脂，并用n,n
‑
二异丙基乙胺(3.72ml，21.4mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(2:8，2x5min，2x50ml)中的溶液处理。然后将树脂用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x50ml)、二氯甲烷(2x50ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x50ml)洗涤。通过用n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶处理(1x5min，1x10min，1x30min，3x50ml)除去fmoc基团。树脂用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x50ml)、2
‑
丙醇(2x50ml)和二氯甲烷(2x50ml)洗涤。将{2
‑
[2
‑
(9h
‑
芴
‑9‑
基甲氧羰基氨基)
‑
乙氧基]
‑
乙氧基}
‑
乙酸(fmoc
‑
oeg
‑
oh，6.17g，16.0mmol)、5
‑
氯
‑1‑
((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)
‑
1h
‑
苯并[d][1,2,3]三唑3
‑
氧化物四氟硼酸盐(tctu，5.70g，16.0mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(5.02ml，28.8mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(50ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇1小时。然后将树脂用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x50ml)、二氯甲烷(2x50ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x50ml)洗涤。通过用n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶处理(1x5min，1x10min，1x30min，3x50ml)除去fmoc基团。树脂用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x50ml)、2
‑
丙醇(2x50ml)、二氯甲烷(2x50ml)洗涤。将{2
‑
[2
‑
(9h
‑
芴
‑9‑
基甲氧羰基氨基)
‑
乙氧基]
‑
乙氧基}
‑
乙酸(fmoc
‑
oeg
‑
oh，6.17g，16.0mmol)、5
‑
氯
‑1‑
((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)
‑
1h
‑
苯并[d][1,2,3]三唑3
‑
氧化物四氟硼酸盐(tctu，5.70g，16.0mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(5.02ml，28.8mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(50ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇1小时。然后将树脂用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x50ml)、二氯甲烷(2x50ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x50ml)洗涤。通过用n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶处理(1x5min，1x10min，1x30min，3x50ml)除去fmoc基团。树脂用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x50ml)、2
‑
丙醇(2x50ml)、二氯甲烷(2x50ml)洗涤。将3,5
‑
双(((((9h
‑
芴
‑9‑
基)甲氧基)羰基)氨基)甲基)苯甲酸(10.0g，16.0mmol)、5
‑
氯
‑1‑
((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)
‑
1h
‑
苯并[d][1,2,3]三唑3
‑
氧化物四氟硼酸盐(tctu，5.70g，16.0mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(5.02ml，28.8mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(50ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇1小时。然后将树脂用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x50ml)、二氯甲烷(2x50ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x50ml)洗涤。通过用n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶处理(1x5min，1x10min，
1x30min，3x50ml)除去fmoc基团。树脂用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x50ml)、2
‑
丙醇(2x50ml)、二氯甲烷(2x50ml)洗涤。将3
‑
(3
‑
乙酰氧基
‑
2,2
‑
双(乙酰氧基甲基)丙氧基)丙酸(5，10.7g，32.0mmol)、氰基
‑
乙醛酸乙酯
‑2‑
肟(oxyma，4.55g，32.0mmol)、2,4,6
‑
可力丁(7.68ml，6.99mmol)和n,n
‑
二异丙基碳二亚胺(dic，4.96g，32.0mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(40ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇1小时。将树脂过滤并用n,n
‑
二甲基甲酰胺(3x50ml)、二氯甲烷(4x50ml)、甲醇(4x50ml)和二氯甲烷(7x50ml)洗涤。通过用三氟乙酸/二氯甲烷混合物(1:1，50ml)处理过夜，从树脂上切下产物。滤出树脂，并用二氯甲烷(2x50ml)洗涤。减压除去溶剂。通过柱色谱法(硅胶60，0.040
‑
0.063mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇100:0至90:10)纯化残余物，得到被甲酯和部分脱乙酰化的产物污染的化合物(8)。将化合物(8)溶解于二氧杂环己烷中，并添加氢氧化锂(3.42g，81.5mmol)的水(160ml)溶液。将混合物搅拌30分钟，然后用1m盐酸(80ml)中和，并冷冻干燥。将脱乙酰化的8溶解于二氯甲烷(50ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(10ml)的混合物中，然后添加吡啶(50ml)和乙酸酐(30.5ml)。将混合物搅拌72小时，然后从n,n
‑
二甲基甲酰胺中蒸发多次，得到呈棕色油状物的所需化合物8。
[0819]
产量：13.2g(99％)。lc
‑
ms:1249(m h) 。
[0820]
将上述化合物(8，15.6g，12.5mmol)、2,4,6
‑
可力丁(14.9ml,113mmol)、[1,2,3]三唑并[4,5
‑
b]吡啶
‑1‑
醇(hoat，5.10g，37.6mmol)和n
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
n
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc.hcl，7.89g，41.3mmol)溶解于二氯甲烷(170ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(20ml)中。添加4
‑
甲酰基
‑
苄基
‑
氯化铵(7.08g，41.3mmol)。将混合物在室温下搅拌48小时并真空蒸发。通过hplc(deltapak，c18，5m，50x500mm，乙腈/水，30分钟内15:85至25:75，170分钟内25:75至50:50 0.05％tfa)纯化残余物，得到呈棕色油状物的标题化合物10。产量：1.96g(12％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：9.98(s,1h)；7.84(d,j＝8.1hz,2h)；7.56
‑
7.41(m,3h)；7.39
‑
7.33(m,1h)；7.25
‑
7.14(m,2h)；7.09
‑
7.00(m,1h)；4.56(d,j＝6.2hz,2h)；4.46
‑
4.40(m,4h)；4.09
‑
3.96(m,16h)；3.91(s,2h)；3.73
‑
3.56(m,20h)；3.52(t,j＝5.1hz,4h)；3.45
‑
3.32(m,8h)；2.49(t,j＝5.8hz,4h)；2.05(s,18h)。lc
‑
ms:1366(m h) 。
[0821]
实施例6：boc
‑
lys(boc)
‑
oeg3
‑
苯甲醛
[0822][0823]
实施例6的化合物与实施例5的化合物类似地由boc
‑
lys(boc)制备。
[0824]
实施例7：双(双(4
‑
硼酸基
‑3‑
氟苯甲酰基)
‑
3,5
‑
氨基甲基苯甲酸酯
‑
epsilon,alpha
‑
lys
‑
n
‑
beta
‑
ala
‑
osu＝(s)
‑3‑
(2,6
‑
双(3,5
‑
双((3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)甲基)苯甲酰胺基)己酰胺基)丙酸酯
[0825][0826]
将3,5
‑
二甲基苯甲酸(1，45.1g，18.4mmol)悬浮在甲醇(130ml)中，并用浓硫酸(13ml)处理。将混合物回流2天。用碳酸钠(80g)中和后，将混合物溶解于水(250ml)中，并用乙醚(2x300ml)萃取。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发至干，得到呈浅黄色油状物的3,5
‑
二甲基苯甲酸甲酯(2)。产量：46.8g(95％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：7.67(s,2h)；7.19(s,1h)；3.91(s,3h)；2.37(s,6h)。
[0827]
在加热至回流的同时，用可见光照射上述3,5
‑
二甲基苯甲酸甲酯(2，46.7g，284mmol)、n
‑
溴代琥珀酰亚胺(nbs，177g，994mmol)和一刮刀偶氮二异丁腈在甲酸甲酯(550ml)中的混合物20小时。蒸发溶剂，并将残余物溶解于二氯甲烷(300ml)中。滤出沉淀的琥珀酰亚胺，并用饱和亚硫酸钠水溶液(2x250ml)洗涤滤液。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。通过急骤柱色谱法(硅胶60，0.040
‑
0.063mm；洗脱液：己烷/乙酸乙酯15:1)纯化残余物。产物从乙酸乙酯/环己烷混合物(1:5，360ml)中结晶，得到呈白色固体的3,5
‑
双(溴甲基)苯甲酸甲酯(3)。产量：46.5g(51％)。rf(sio2，己烷/乙酸乙酯9:1)：0.50。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.03
‑
7.97(m,2h)；7.62(s,1h)；4.50(s,4h)；3.94(s,3h)。
[0828]
将上述溴化物(3，35.2g，109mmol)和二甲酰胺钠(29.1g，306mmol)在无水乙腈(200ml)中的悬浮液回流4小时。通过过滤除去白色固体后，蒸发溶剂。从乙酸乙酯/环己烷混合物中重结晶得到呈白色粉末的3,5
‑
双((n
‑
甲酰基甲酰胺基)甲基)苯甲酸甲酯(4)。
[0829]
产量：32.7g(98％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.08(s,4h)；7.72(s,2h)；
7.44(s,1h)；4.70(s,4h)；3.84(s,3h)。
[0830]
将苯甲酸酯(4，32.7g，107mmol)溶解于1,4
‑
二氧杂环己烷(340ml)和浓盐酸(430ml)的混合物中，并加热2小时至回流。冷却至室温后，使空气流通过该溶液。产物开始沉淀。1小时后，蒸发溶剂，产物从甲醇/乙醚混合物(300ml)中重结晶，得到呈白色粉末的3,5
‑
双(氨基甲基)苯甲酸二盐酸盐(5)。产量：22.2g(82％)。1h nmr谱(300mhz,d2o,δh)：8.08(s,2h)；7.72(s,1h)；4.26(s,4h)。
[0831]
将二盐酸盐(5，6.33g，25.0mmol)溶解于水(110ml)中。随后添加n,n
‑
二异丙基乙胺(17.4ml，100mmol)、n,n
‑
二甲基甲酰胺(110ml)和2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸酯(6，18.2g，50.0mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜；然后用1m盐酸水溶液中和。溶剂与甲苯共蒸发3次。将残余物溶解于二氯甲烷/甲苯混合物(1:1，100ml)中，并用频哪醇(0.60g，5.00mmol)处理。将混合物从甲苯中蒸发3次。将残余物溶解于乙酸乙酯(250ml)中，并用水(3x150ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残余物溶解于二氯甲烷(50ml)中，产物开始沉淀。添加环己烷(170ml)。通过过滤收集沉淀物，用环己烷和乙醚洗涤，并真空干燥，得到呈白色粉末的3,5
‑
双((3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)甲基)苯甲酸(7)。产量：14.5g(86％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：12.96(bs,1h)；9.33
‑
9.23(m,2h)；7.83
‑
7.67(m,6h)；7.64
‑
7.57(m,2h)；7.54(s,1h)；4.55
‑
4.46(m,4h)；1.31(s,24h)。lc
‑
ms:512.0(m h
‑
2x频哪醇) 。
[0832]
将上述酸(7，14.4g，21.3mmol)溶解于乙腈/n,n
‑
二甲基甲酰胺混合物(4:1，100ml)中。随后添加n
‑
羟基琥珀酰亚胺(hosu，2.95g，25.6mmol)和n,n
‑
二环己基碳二亚胺(dcc，5.28g，25.6mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。滤出不溶性副产物，并蒸发滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯(250ml)中，并用水(2x150ml)和盐水(1x150ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残余物溶解于乙腈(100ml)中。滤出残留的n,n
‑
二环己基脲，并蒸发滤液。将残余物溶解于四氢呋喃(150ml)中，并用频哪醇(0.60g，5.00mmol)和分子筛处理过夜。通过celite垫过滤混合物，并蒸发滤液。将残余物溶解于二氯甲烷(40ml)中。通过添加环己烷(150ml)沉淀产物。过滤沉淀物，用环己烷和乙醚洗涤，并真空干燥，得到呈白色粉末的2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基3,5
‑
双((3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)甲基)苯甲酸酯(8)。产量：13.3g(75％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.34
‑
9.21(m,2h)；7.94(s,2h)；7.79
‑
7.66(m,5h)；7.65
‑
7.56(m,2h)；4.62
‑
4.50(m,4h)；2.88(s,4h)；1.31(s,24h)。lc
‑
ms:773.4(m h) ,691.2(m h
‑
频哪醇) ,609.1(m h
‑
2x频哪醇) 。
[0833]
将2
‑
氯三苯甲基树脂100
‑
200目1.8mmol/g(9，10.9g，19.7mmol)在无水二氯甲烷(140ml)中溶胀20分钟。将3
‑
((((9h
‑
芴
‑9‑
基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸(fmoc
‑
bala
‑
oh，4.08g，13.1mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(8.68ml，49.9mmol)在无水二氯甲烷(120ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇过夜。过滤树脂，并用n,n
‑
二异丙基乙胺(4.57ml，26.2mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(1:4，10min，140ml)中的溶液处理。然后用二氯甲烷(2
×
130ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2
×
130ml)洗涤树脂。通过用在n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1x5min，1x15min，2x130ml)处理去除fmoc基团。用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x130ml)、2
‑
丙醇(2x130ml)、二氯甲烷(2x130ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x130ml)洗涤树脂。将n2,n6
‑
双
(叔丁氧羰基)
‑
l
‑
赖氨酸(boc
‑
lys(boc)
‑
oh，9.09g，26.2mmol)、5
‑
氯
‑1‑
((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)
‑
1h
‑
苯并[d][1,2,3]三唑3
‑
氧化物四氟硼酸盐(tctu，9.33g，26.2mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(8.23ml，47.2mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(110ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇3小时。将树脂过滤并用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x130ml)和二氯甲烷(10x130ml)洗涤。通过用2,2,2
‑
三氟乙醇(220ml)处理过夜，从树脂上切下产物。滤出树脂，并用二氯甲烷(2x200ml)洗涤。合并溶液；蒸发溶剂，并通过急骤柱色谱法(硅胶60，0.040
‑
063mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇90:10)纯化残余物，得到呈白色固体的(s)
‑3‑
(2,6
‑
双((叔丁氧羰基)氨基)己酰胺基)丙酸(10)。产量：4.30g(78％)。rf(sio2，二氯甲烷/甲醇90:10)：0.40。
[0834]1h nmr谱(300mhz,acod
‑
d4,δh)：4.27
‑
3.99(m,1h)；3.65
‑
3.44(m,2h)；3.17
‑
3.00(m,2h)；2.70
‑
2.56(m,2h)；1.86
‑
1.58(m,2h)；1.57
‑
1.26(m,22h)。lc
‑
ms:417.5(m h) 。
[0835]
将上述化合物(10，4.30g，10.3mmol)溶解于三氟乙酸(50ml)中，并放置1.5小时。蒸发溶剂。添加乙醚(100ml)，并将混合物搅拌过夜。倾析溶剂，并将残余物真空干燥，得到呈硬性(tough)油状物的(s)
‑6‑
((2
‑
羧基乙基)氨基)
‑6‑
氧代己烷
‑
1,5
‑
二铵2,2,2
‑
三氟乙酸盐(11)。产量：4.50g(100％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：8.58(t,j＝5.4hz,1h)；8.18(bs,2h)；7.87(bs,2h)；3.77
‑
3.62(m,1h)；3.34
‑
3.18(m,2h)；2.83
‑
2.65(m,2h)；1.74
‑
1.60(m,2h)；1.60
‑
1.44(m,2h)；1.37
‑
1.19(m,2h)。lc
‑
ms:217.2(m h) 。
[0836]
将上述盐(11，2.70g，6.06mmol)溶解于n,n
‑
二甲基甲酰胺(100ml)中。随后添加n,n
‑
二异丙基乙胺(5.30ml，30.3mmol)、水(50ml)和活化酯(8，9.36g，12.1mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜；然后用1m盐酸水溶液中和。溶剂与甲苯共蒸发3次。将残余物溶解于二氯甲烷/甲苯混合物(1:1，100ml)中，并用频哪醇(0.50g，4.23mmol)处理。将混合物从甲苯中蒸发3次。将残余物溶解于乙酸乙酯(250ml)中，并用水(1x100ml)和盐水(1x100ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。通过nmr分析观察到频哪醇酯的部分裂解。将材料用频哪醇(0.04g，0.34mmol)和硫酸镁(20.0g)在四氢呋喃(110ml)中处理过夜。将混合物过滤，并蒸发滤液。使产物从二氯甲烷/环己烷混合物(1:5，180ml)中结晶，得到呈浅棕色粉末的3,5
‑
双((3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)甲基)苯甲酰胺基)己酰胺基)丙酸(12)。产量：5.86g(63％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.31
‑
9.13(m,4h)；8.53
‑
8.43(m,1h)；8.43
‑
8.35(m,1h)；8.11
‑
7.98(m,1h)；7.78
‑
7.55(m,16h)；7.48
‑
7.38(m,2h)；4.55
‑
4.43(m,8h)；4.43
‑
4.33(m,1h)；3.31
‑
3.13(m,4h)；2.38(t,j＝6.4hz,2h)；1.79
‑
1.64(m,2h)；1.57
‑
1.44(m,2h)；1.42
‑
1.21(m,50h)。
[0837]
将羧酸(12，5.46g，3.57mmol)溶解于乙腈(50ml)中。添加n
‑
羟基琥珀酰亚胺(hosu，0.70g，6.07mmol)和n,n
‑
二环己基碳二亚胺(1.47g，7.14mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。通过过滤除去副产物。蒸发滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯(150ml)中，并用水(1x100ml)和盐水(1x100ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残余物溶解于二氯甲烷(60ml)中，并用频哪醇(0.06g，0.50mmol)和分子筛处理过夜。将混合物过滤，并蒸发滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯(10ml)中，并在添加乙醚(90ml)后沉淀。通过过滤收集产物，用乙醚洗涤并真空干燥，得到呈浅棕色粉末的标题化合物(13)。产物含有痕量的n,n
‑
二环己基脲。产量：1.55g(27％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.28
‑
9.17(m,3h)；8.52
‑
8.33(m,2h)；8.25
‑
8.15(m,1h)；7.80
‑
7.51(m,16h)；7.48
‑
7.35(m,2h)；4.58
‑
4.32(m,
9h)；3.49
‑
3.35(m,2h)；3.25
‑
3.09(m,2h)；2.91
‑
2.72(m,6h)；1.81
‑
1.65(m,2h)；1.57
‑
1.42(m,2h)；1.41
‑
1.12(m,50h)。lc
‑
ms:1631.9(m h) ,1549.0(m
‑
频哪醇 h) ,715.0(m
‑
2x h2o
‑
2x频哪醇/2 h) ,1384.5(m
‑
3x频哪醇 h) ,1302.3(m
‑
4x频哪醇 h) 。
[0838]
实施例8：(7s,18s)
‑
18
‑
(3
‑
((s)
‑
2,6
‑
双(3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)己酰胺基)丙酰胺基)
‑7‑
(3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)
‑1‑
(3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯基)
‑
1,8,12,19
‑
四氧代
‑
2,9,13,20
‑
四氮杂二十三烷
‑
23
‑
酸
[0839][0840]
将2
‑
氟
‑4‑
羧基苯基硼酸(1，15.1g，82.0mmol)、频哪醇(9.81g，83.0mmol)和硫酸镁(150g)在四氢呋喃(400ml)中的混合物在室温下搅拌一周末。该悬浮液通过celite垫过滤，将滤液蒸发并真空干燥，得到呈浅黄色粉末的3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸(2)。产量：21.5g(98％)。1h nmr谱(400mhz,dmso
‑
d6,δh)：7.95
‑
7.42(m,3h)；1.30(s,12h)。
[0841]
将羧酸(2，21.4g，81.9mmol)溶解于二氯甲烷(300ml)中。添加n
‑
羟基琥珀酰亚胺(hosu，18.8g，163mmol)和n
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
n'
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc.hcl，31.3g，163mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。反应水合物用0.5m盐酸水溶液(1x200ml)、水(1x200ml)和盐水(1x200ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。将残余物溶解于二氯甲烷(60ml)中，并通过添加环己烷(250ml)进行沉淀。通过过滤收集产物，用环己烷洗涤，并真空干燥，得到呈米色粉末的2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲
基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸酯(3)。产量：27.8g(93％)。1h nmr谱(400mhz,dmso
‑
d6,δh)：7.98
‑
7.87(m,2h)；7.80(dd,j＝9.2hz,1h)；2.90(s,4h)；1.33(s,12h)。
[0842]
将2
‑
氯三苯甲基树脂100
‑
200目1.8mmol/g(4，16.4g，29.5mmol)在无水二氯甲烷(230ml)中溶胀20分钟。将3
‑
((((9h
‑
芴
‑9‑
基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸(fmoc
‑
bala
‑
oh，6.13g，19.7mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(13.0ml，74.8mmol)在无水二氯甲烷(180ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇过夜。过滤树脂，并用n,n
‑
二异丙基乙胺(6.86ml，39.4mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(1:4，10min，200ml)中的溶液处理。然后用二氯甲烷(2
×
200ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2
×
200ml)洗涤树脂。通过用在n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1x5min，1x15min，2x200ml)处理去除fmoc基团。用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x200ml)、2
‑
丙醇(2x200ml)、二氯甲烷(2x200ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x200ml)洗涤树脂。将n2,n6
‑
双(((9h
‑
芴
‑9‑
基)甲氧基)羰基)
‑
l
‑
赖氨酸(fmoc
‑
lys(fmoc)
‑
oh，23.3g，39.4mmol)、5
‑
氯
‑1‑
((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)
‑
1h
‑
苯并[d][1,2,3]三唑3
‑
氧化物四氟硼酸盐(tctu，14.0g，39.4mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(12.3ml，70.9mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(180ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇2.5小时。将树脂过滤并用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x200ml)、二氯甲烷(2x200ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x200ml)洗涤。通过用在n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1x5min，1x15min，2x200ml)处理去除fmoc基团。用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x200ml)、2
‑
丙醇(2x200ml)、二氯甲烷(2x200ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x200ml)洗涤树脂。将3
‑
((((9h
‑
芴
‑9‑
基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸(fmoc
‑
bala
‑
oh，24.5g，78.7mmol)、5
‑
氯
‑1‑
((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)
‑
1h
‑
苯并[d][1,2,3]三唑3
‑
氧化物四氟硼酸盐(tctu，28.0g，78.7mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(24.7ml，142mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(230ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇3小时。将树脂过滤并用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x200ml)、二氯甲烷(2x200ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x200ml)洗涤。通过用在n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1x5min，1x15min，2x200ml)处理去除fmoc基团。用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x200ml)、2
‑
丙醇(2x200ml)、二氯甲烷(2x200ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x200ml)洗涤树脂。将n2,n6
‑
双(叔丁氧羰基)
‑
l
‑
赖氨酸(boc
‑
lys(boc)
‑
oh，27.3g，78.7mmol)、5
‑
氯
‑1‑
((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)
‑
1h
‑
苯并[d][1,2,3]三唑3
‑
氧化物四氟硼酸盐(tctu，28.0g，78.7mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(24.7ml，142mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(230ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇3小时。将树脂过滤并用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x200ml)、二氯甲烷(2x200ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x200ml)洗涤。通过用在n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1x5min，1x15min，2x200ml)处理去除fmoc基团。用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x200ml)、2
‑
丙醇(2x200ml)、二氯甲烷(2x200ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x200ml)洗涤树脂。通过用2,2,2
‑
三氟乙醇(350ml)处理过夜，从树脂上切下产物。滤出树脂，并用二氯甲烷(2x300ml)洗涤。合并溶液；蒸发溶剂，并通过急骤柱色谱法(硅胶60，0.040
‑
063mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇85:15)纯化残余物，得到呈白色固体的(10s,21s)
‑
21
‑
(3
‑
((s)
‑
2,6
‑
双((叔丁氧羰基)氨基)己酰胺基)丙酰胺基)
‑
10
‑
((叔丁氧羰基)氨基)
‑
2,2
‑
二甲基
‑
4,11,15,22
‑
四氧代
‑3‑
氧杂
‑
5,12,16,23
‑
四氮杂二十六烷
‑
26酸(5)。产量：11.3g(56％)。1h nmr谱(300mhz,acod
‑
d4,δh)：4.52
‑
4.43(m,1h)；4.22
‑
3.98(m,2h)；3.64
‑
3.44(m,6h)；3.27
‑
3.16(m,2h)；3.15
‑
3.03(m,4h)；2.69
‑
2.48(m,6h)；1.84
‑
1.59(m,6h)；1.58
‑
1.28(m,48h)。lc
‑
ms:1016.2(m h) 。
[0843]
将上述化合物(5，11.3g，11.1mmol)溶解于三氟乙酸(200ml)中，并放置1.5小时。然后将混合物浓缩，并添加乙醚(200ml)。搅拌过夜后，过滤沉淀物，用乙醚洗涤并真空干燥，得到呈白色粉末的(5s,12s,23s)
‑
12
‑
((2
‑
羧基乙基)氨基甲酰基)
‑
6,10,18,22
‑
四氧代
‑
7,11,17,21
‑
四氮杂二十七烷
‑
1,5,23,27
‑
四铵2,2,2
‑
三氟乙酸盐(6)。产量：9.25g(99％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：8.56
‑
8.44(m,2h)；8.27
‑
7.72(m,11h)；4.22
‑
4.08(m,1h)；3.78
‑
3.60(m,2h)；3.39
‑
3.17(m,6h)；3.07
‑
2.92(m,2h)；2.82
‑
2.66(m,4h)；2.42
‑
2.19(m,6h)；1.77
‑
1.43(m,10h)；1.42
‑
1.14(m,8h)。
[0844]
将上述盐(6，7.91g，9.37mmol)溶解于n,n
‑
二甲基甲酰胺(170ml)中。随后添加n,n
‑
二异丙基乙胺(14.7ml，84.3mmol)、水(0.50ml)和活化酯(3，13.6g，37.5mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜；然后用1m盐酸水溶液酸化。溶剂与甲苯共蒸发3次。将残余物溶解于二氯甲烷/甲苯混合物(1:1，100ml)中，并用频哪醇(1.00g，8.46mmol)处理。将混合物从甲苯中蒸发3次。将残余物溶解于乙酸乙酯(150ml)中，并用水(1x100ml)和盐水(1x100ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并浓缩至1/3体积。添加环己烷(150ml)；过滤沉淀物并用环己烷洗涤。将固体悬浮于乙腈/乙醚混合物(1:1，150ml)中。过滤沉淀物，用乙腈洗涤并真空干燥，得到呈白色固体的标题化合物(7)。产量：4.10g(27％)。
[0845]1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：8.67
‑
8.43(m,4h)；8.05
‑
7.83(m,4h)；7.82
‑
7.47(m,13h)；4.46
‑
4.27(m,2h)；4.20
‑
4.05(m,1h)；3.42
‑
3.13(m,10h)；3.05
‑
2.90(m,2h)；2.42
‑
2.27(m,4h)；2.27
‑
2.17(m,2h)；1.84
‑
1.66(m,4h)；1.63
‑
1.10(m,62h)。lc
‑
ms:1226.4(m
‑
3x h2o
‑
4x频哪醇 h) 。
[0846]
实施例9：2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基n
‑
(2
‑
(3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)乙基)
‑
n
‑
(3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基)甘氨酸酯
[0847][0848]
将3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸(2，8.85g，33.3mmol)溶解于二氯甲烷(100ml)中，然后添加1
‑
((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)
‑
1h
‑
[1,2,3]三唑并[4,5
‑
b]吡啶3
‑
氧化物六氟磷酸盐(v)(hatu，12.3g，32.4mmol)、n,n
‑
二异丙基乙胺(14.5ml，83.2mmol)和(2
‑
氨基乙基)甘氨酸叔丁酯盐酸盐(1，4.11g，16.6mmol)。将反应混合物在环境温度下搅拌18小时。用1m盐酸水溶液(2x100ml)、水
(1x100ml)和盐水(1x100ml)萃取反应混合物。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将粗产物溶解于无水四氢呋喃(50ml)中，并添加2,3
‑
二甲基
‑
2,3
‑
丁二醇(3.70g，31.5mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后蒸发反应混合物，并通过急骤色谱法(硅胶60，0.063
‑
0.200mm；洗脱液：二氯甲烷/乙酸乙酯5:2)纯化粗产物，得到呈白色泡沫的n
‑
(2
‑
(3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)乙基)
‑
n
‑
(3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基)甘氨酸叔丁酯(3)。产量：8.13g(73％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：8.78
‑
8.55(m,1h)；7.79
‑
7.44(m,4h)；7.12
‑
6.88(m,2h)；4.18
‑
3.90(m,2h)；3.67
‑
3.47(m,2h)；3.45
‑
3.29(m,2h)；1.44(s,9h)；1.30(s,24h)。
[0849]
将上述制备的化合物(3，8.13g，12.1mmol)溶解于三氟乙酸(100ml)中，并放置2.5小时。然后蒸发溶剂，并与甲苯共蒸发两次。将残余物溶解于二氯甲烷(30ml)中，并添加环己烷(250ml)。通过过滤收集产物，用环己烷洗涤，并真空干燥，得到呈白色粉末的n
‑
(2
‑
(3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)乙基)
‑
n
‑
(3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基)甘氨酸(4)。产量：6.91g(93％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,80c,δh)：8.49
‑
8.38(m,1h)；7.76
‑
7.68(m,1h)；7.67
‑
7.59(m,2h)；7.57
‑
7.45(m,1h)；7.16
‑
7.09(m,1h)；7.04
‑
6.94(m,1h)；4.20
‑
4.03(m,2h)；3.59
‑
3.40(m,4h)；1.33(s,24h)。lc
‑
ms:449.9(m
‑
2x频哪醇 h) ,532.1(m
‑
频哪醇 h) ,614.2(m h) 。
[0850]
将酸(4，6.90g，11.2mmol)溶解于二氯甲烷/四氢呋喃混合物(1:1，100ml)中，然后添加n
‑
羟基琥珀酰亚胺(1.36g，11.8mmol)和n
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
n
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(2.26g，11.8mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂。将残余物溶解于乙酸乙酯(150ml)中，并用水(2x100ml)和盐水(1x100ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。产物从二氯甲烷/环己烷混合物(25ml/250ml)中沉淀出来。通过过滤收集沉淀物，用环己烷洗涤并真空干燥，得到呈白色粉末的标题化合物(5)。产量：7.62g(96％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,80c,δh)：8.51
‑
8.38(m,1h)；7.77
‑
7.57(m,3h)；7.55
‑
7.45(m,1h)；7.18
‑
7.10(m,1h)；7.06
‑
6.97(m,1h)；4.62(bs,2h)；3.67
‑
3.41(m,4h)；2.84(s,4h)；1.33(s,24h)。lc
‑
ms:547.0(m
‑
2x频哪醇 h) ,629.1(m
‑
频哪醇 h) ,711.3(m h) 。
[0851]
实施例10：n
‑
(6
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑5‑
羰基)
‑
n
‑
(2
‑
(6
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑5‑
甲酰胺基)乙基)甘氨酸
[0852][0853]
将6
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑5‑
甲酸(1，10.0g，
51.0mmol)溶解于四氢呋喃(100ml)中。在室温下添加n,n
‑
二甲基甲酰胺(15ml)、n
‑
羟基琥珀酰亚胺(6.46g，56.1mmol)和n
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
n
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(10.8g，56.1mmol)。搅拌2小时后，减压蒸发挥发物，并将残余物重新溶解于乙酸乙酯(400ml)中，并用1m盐酸水溶液(2x100ml)洗涤。有机部分经无水硫酸钠干燥。减压蒸发挥发物，得到呈白色固体的2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基6
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑5‑
甲酸酯(2)。产量：13.8g(92％)。
[0854]1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.65(s,1h)；8.11(d,j＝5.9hz,1h)；7.71(d,j＝10.1hz,1h)；5.08(s,2h)；2.90(s,4h)。lc
‑
ms:294.4(m h) 。
[0855]
将(2
‑
氨基乙基)甘氨酸(3，1.81g，15.4mmol)溶解于n,n
‑
二甲基甲酰胺(40ml)中，在室温下添加三乙胺(12.8ml，92.1mmol)和2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基6
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑5‑
甲酸酯(2，9.00g，30.7mmol)。在室温下搅拌16小时后，将反应混合物加热至40℃，并再搅拌72小时。减压蒸发挥发物，并将残余物重新溶解于乙酸乙酯(400ml)中，并用1m盐酸水溶液(100ml)洗涤。有机部分经无水硫酸钠干燥。减压蒸发挥发物，从乙腈/水混合物中沉淀产物，通过离心收集并冷冻干燥，得到呈灰白色固体的n
‑
(6
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑5‑
羰基)
‑
n
‑
(2
‑
(6
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑5‑
甲酰胺基)乙基)甘氨酸4。
[0856]
产量：1.99g(27％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：12.87(bs,1h)；9.50
‑
9.37(m,2h)；8.52
‑
8.22(m,1h)；7.69
‑
7.30(m,4h)；5.08
‑
4.70(m,4h)；4.27
‑
3.96(m,2h)；3.74
‑
3.35(m,4h)。lc
‑
ms:475.5(m h) 。
[0857]
实施例11：2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基(s)
‑3‑
(2,6
‑
双(3,5
‑
双((4
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)甲基)苯甲酰胺基)己酰胺基)丙酸酯
[0858][0859]
将2
‑
氯三苯甲基树脂100
‑
200目1.5mmol/g(1，21.0g，31.5mmol)在无水二氯甲烷
(300ml)中溶胀20分钟。将3
‑
((((9h
‑
芴
‑9‑
基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸(fmoc
‑
bala
‑
oh，6.54g，21.0mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(13.9ml，79.8mmol)在无水二氯甲烷(250ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇一周末。过滤树脂，并用n,n
‑
二异丙基乙胺(7.32ml，42.0mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(1:4，1x15min，250ml)中的溶液处理。然后用二氯甲烷(2x250ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x250ml)洗涤树脂。通过用在n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1x10min，1x20min，2x250ml)处理去除fmoc基团。用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x250ml)、2
‑
丙醇(2x250ml)、二氯甲烷(2x250ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x250ml)洗涤树脂。将n2,n6
‑
双(((9h
‑
芴
‑9‑
基)甲氧基)羰基)
‑
l
‑
赖氨酸(fmoc
‑
lys(fmoc)
‑
oh，18.6g，31.5mmol)、5
‑
氯
‑1‑
((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)
‑
1h
‑
苯并[d][1,2,3]三唑3
‑
氧化物四氟硼酸盐(tctu，11.2g，31.5mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(9.87ml，56.7mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(250ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇过夜。将树脂过滤并用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x250ml)和二氯甲烷(3x250ml)洗涤。
[0860]
除去部分树脂(2.00mmol)。通过用n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶处理(1x5min，1x10min，1x30min，3x30ml)除去fmoc基团。用n,n
‑
二甲基甲酰胺(4x30ml)、二氯甲烷(4x30ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(4x30ml)洗涤树脂。将n,n
‑
二甲基甲酰胺(30ml)中的2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基3,5
‑
双((4
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)甲基)苯甲酸酯(2，3.65g，4.72mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(1.40ml，8.00mmol)添加至树脂，并将混合物振摇过夜。过滤树脂，并用n,n
‑
二甲基甲酰胺(4x30ml)、二氯甲烷(4x30ml)、n,n
‑
二甲基甲酰胺(4x30ml)和二氯甲烷(10x30ml)洗涤。
[0861]
通过用1,1,1,3,3,3
‑
六氟
‑2‑
丙醇/二氯甲烷混合物(1:2，30ml)处理2小时，从树脂上切下产物。滤出树脂，并用二氯甲烷(3x30ml)洗涤。合并溶液，并蒸发溶剂。将残余物溶解于二氯甲烷(5ml)中，并在添加环己烷(25ml)后沉淀。通过过滤收集产物，用环己烷洗涤，并真空干燥，得到(s)
‑3‑
(2,6
‑
双(3,5
‑
双((4
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)甲基)苯甲酰胺基)己酰胺基)丙酸(3)。产量：1.53g(52％)。
[0862]1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.20
‑
9.03(m,4h)；8.52
‑
8.42(m,1h)；8.39
‑
8.32(m,1h)；8.06
‑
7.99(m,1h)；7.94
‑
7.80(m,10h)；7.78
‑
7.65(m,10h)；7.48
‑
7.39(m,2h)；4.56
‑
4.43(m,8h)；4.43
‑
4.32(m,1h)；3.27
‑
3.14(m,4h)；2.40
‑
2.29(m,2h)；1.78
‑
1.64(m,2h)；1.56
‑
1.430(m,3h)1.37
‑
1.21(s,49h)。
[0863]
将羧酸(3，1.53g，1.00mmol)溶解于二氯甲烷(40ml)中。添加n
‑
羟基琥珀酰亚胺(hosu，148mg，1.30mmol)和n
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
n
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc.hcl，242mg，1.30mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂。将残余物溶解于乙酸乙酯(100ml)中，并用水(2x50ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残余物溶解于二氯甲烷(10ml)中，并在添加环己烷(50ml)后沉淀。通过过滤收集产物，用环己烷和乙醚洗涤并真空干燥，得到呈白色粉末的标题化合物(4)。产量：1.16g(71％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.23
‑
9.01(m,4h)；8.50
‑
8.42(m,1h)；8.41
‑
8.35(m,1h)；8.23
‑
8.16(m,1h)；7.91
‑
7.81(m,9h)；7.77
‑
7.70(m,9h)；7.70
‑
7.64(m,2h)；7.47
‑
7.40(m,2h)；4.55
‑
4.43(m,8h)；4.40
‑
4.34(m,1h)3.50
‑
3.38(m,2h)；3.26
‑
3.12(m,2h)；2.88
‑
2.77(m,6h)；1.82
‑
1.63(m,2h)；1.60
‑
1.43(m,4h)；1.31(s,48h)。lc
‑
ms:1631.9(m h) ,1549.0(m
‑
频哪醇 h) ,715.0(m
‑
2x h2o
‑
2x频哪醇/2 h) ,1384.5(m
‑
3x频哪醇 h) ,1302.3(m
‑
4x频哪醇
h) 。
[0864]
实施例12：(s)
‑3‑
(2,6
‑
双(3,5
‑
双((2
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)甲基)苯甲酰胺基)己酰胺基)丙酸
[0865][0866]
将3,5
‑
二甲基苯甲酸(1，300g，2.00mol)悬浮在甲醇(900ml)中，并用浓硫酸(90ml)处理。将混合物搅拌3天。用碳酸钠(480g)中和后，蒸发溶剂。将残余物溶解于水(1l)中，并用乙醚(3x1l)萃取。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发至干，得到呈浅黄色油状物的3,5
‑
二甲基苯甲酸甲酯(2)。产量：309g(94％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：7.65(s,2h)；7.16(s,1h)；3.88(s,3h)；2.34(s,6h)。
[0867]
在加热至回流的同时，用可见光照射上述3,5
‑
二甲基苯甲酸甲酯(2，307g，1.87mol)、n
‑
溴代琥珀酰亚胺(1.17kg，6.55mol)和一刮刀偶氮二异丁腈在甲酸甲酯(2.7l)中的混合物20小时。蒸发溶剂，并将残余物溶解于二氯甲烷(2l)中。滤出沉淀的琥珀酰亚胺，并用饱和亚硫酸钠水溶液(2x1l)洗涤滤液。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。从热的乙酸乙酯/环己烷混合物中多次结晶并用环己烷洗涤得到呈白色固体的,5
‑
双(溴甲基)苯甲酸甲酯(3)。产品分两批制备。产量：243g(40％)。rf(sio2，己烷/乙酸乙酯9:1)：0.50。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.00(s,2h)；7.62(s,1h)；4.51(s,4h)；3.94(s,3h)。
[0868]
将上述溴化物(3，122g，380mmol)和二甲酰胺钠(101g，1.06mol)在无水乙腈(900ml)中的悬浮液回流4小时。通过过滤除去白色固体后，将溶剂与乙酸乙酯共蒸发，并真空干燥，得到呈淡黄色固体的3,5
‑
双((n
‑
甲酰基甲酰胺基)甲基)苯甲酸甲酯(4)。产量：116g(100％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.07(s,4h)；7.72(s,2h)；7.43(s,1h)；4.70(s,4h)；3.82(s,3h)。
[0869]
将苯甲酸酯(4，116g，380mmol)溶解于1,4
‑
二氧杂环己烷(400ml)和浓盐酸(600ml)的混合物中，并加热3小时至回流。冷却至室温后，使空气流通过该溶液。产物开始沉淀。1小时后，蒸发溶剂，产物从甲醇/乙醚混合物中重结晶，得到呈白色粉末的3,5
‑
双(氨基甲基)苯甲酸二盐酸盐(5)。产量：89.5g(92％)。1h nmr谱(300mhz,d2o,δh)：8.10(s,2h)；7.74(s,1h)；4.28(s,4h)。
[0870]
将二盐酸盐(5，30.0g，118mmol)和氢氧化钠(14.2g，356mmol)溶解于水(240ml)中。在搅拌下添加在1，4
‑
二氧杂环己烷(480ml)中的二碳酸二叔丁酯(77.6g，356mmol)。将反应混合物搅拌过夜，然后用乙酸乙酯(400ml)和0.5m盐酸水溶液(400ml)稀释。分离各层，有机层用水(2x350ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥并蒸发。将残余物溶解于热乙酸乙酯(100ml)中，并添加环己烷(400ml)。通过过滤收集沉淀物，并用环己烷洗涤，得到呈白色固体的3,5
‑
双(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)苯甲酸(6)。产量：39.1g(87％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：7.70(s,2h)；7.45
‑
7.36(m,2h)；7.33(s,1h)；4.21
‑
4.04(m,4h)；1.39(s,18h)。
[0871]
让2
‑
氯三苯甲基氯树脂100
‑
200目1.5mmol/g(7，21.2g，31.8mmol)在无水二氯甲烷(280ml)中溶胀40分钟。将3
‑
((((9h
‑
芴
‑9‑
基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸(fmoc
‑
ala
‑
oh，6.61g，21.2mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(14.1ml，80.7mmol)在无水二氯甲烷(220ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇过夜。过滤树脂，并用n,n
‑
二异丙基乙胺(7.40ml，42.5mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(1:4，1x20min，1x250ml)中的溶液处理。然后用二氯甲烷(2x250ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x250ml)洗涤树脂。通过用在n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1x5min，1x20min，2x220ml)处理去除fmoc基团。用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x250ml)、2
‑
丙醇(2x250ml)、二氯甲烷(2x250ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x250ml)洗涤树脂。将n2,n6
‑
双(((9h
‑
芴
‑9‑
基)甲氧基)羰基)
‑
l
‑
赖氨酸(fmoc
‑
lys(fmoc)
‑
oh，18.8g，31.8mmol)、5
‑
氯
‑1‑
((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)
‑
1h
‑
苯并[d][1,2,3]三唑3
‑
氧化物四氟硼酸盐(tctu，11.3g，31.8mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(9.98ml，57.3mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(220ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇2.5小时。然后将树脂用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x250ml)、二氯甲烷(2x250ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x250ml)洗涤。通过用在n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1x5min，1x20min，2x220ml)处理去除fmoc基团。用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x250ml)、2
‑
丙醇(2x250ml)、二氯甲烷(2x250ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x250ml)洗涤树脂。将3,5
‑
双(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)苯甲酸(6，24.2g，63.7mmol)、5
‑
氯
‑1‑
((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)
‑
1h
‑
苯并[d][1,2,3]三唑3
‑
氧化物四氟硼酸盐(tctu，22.6g，63.7mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(20.0ml，115mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(220ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇2.5小时。树脂用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x250ml)和二氯甲烷(10x250ml)洗涤。通过用2,2,2
‑
三氟乙醇(400ml)处理过夜，从树脂上切下产物。滤出树脂，并用二氯甲烷(2x200ml)洗涤。蒸发溶剂，并通过急骤柱色谱法(硅胶60，0.063
‑
0.200mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇90:10)纯化残余物，得到呈白色泡沫的(s)
‑3‑
(2,6
‑
双(3,5
‑
双(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)苯甲酰胺基)己酰胺基)丙酸(8)。产量：16.3g(82％)。rf(sio2，二氯甲烷/甲醇90:10)：0.30。
[0872]1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：7.75
‑
7.35(m,6h)；7.26
‑
7.19(m,2h)；7.13(bs,1h)；5.61
‑
5.35(m,4h)；4.76
‑
4.61(m,1h)；4.25
‑
4.08(m,8h)；3.60
‑
3.26(m,4h)；2.60
‑
2.45(m,
2h)；2.02
‑
1.85(m,1h)；1.85
‑
1.69(m,1h)；1.62
‑
1.51(m,2h)；1.46
‑
1.39(m,38h)。
[0873]
lc
‑
ms:942.1(m h) 。
[0874]
将上述化合物(8，16.1g，17.3mmol)溶解于三氟乙酸(80ml)中，并放置30分钟。将溶剂浓缩至1/3体积，并添加乙醚/环己烷混合物(1:1，300ml)。将所得混合物搅拌过夜。通过过滤收集沉淀物，用乙醚洗涤并真空干燥，得到呈白色粉末的(s)
‑
((((6
‑
((2
‑
羧基乙基)氨基)
‑6‑
氧代己烷
‑
1,5
‑
二基)双(氮烷二基))双(羰基))双(苯
‑
5,1,3
‑
三基))四甲铵2,2,2
‑
三氟乙酸盐(9)。产量：16.5g(96％)。1h nmr谱(300mhz,acod
‑
d4,δh)：8.09(dd,j＝9.4和1.5hz,4h)；7.84(d,j＝10.5hz,2h)；4.76(dd,j＝8.2和6.1hz,1h)；4.36(s,4h)；4.35(s,4h)；3.60
‑
3.43(m,4h)；2.64(t,j＝6.5hz,2h)；2.00
‑
1.80(m,2h)；1.77
‑
1.65(m,2h)；
[0875]
1.57
‑
1.48(m,2h)。lc
‑
ms:541.6(m h) 。
[0876]
将4
‑
羧基
‑3‑
氟苯基硼酸(10，30.0g，163mmol)和频哪醇(21.2g，179mmol)在甲苯/乙醇混合物(1:1，480ml)中的悬浮液回流24小时。然后蒸发溶剂，并与二氯甲烷共蒸发3次，得到呈白色粉末的2
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸(11)。
[0877]
产量：43.3g(100％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：7.60(t,j＝7.3hz,1h)；7.39(d,j＝7.5hz,1h)；7.24(d,j＝10.6hz,1h)；1.29(s,12h)。
[0878]
将酸(11，35.2g，132mmol)溶解于四氢呋喃(1:1，600ml)中，然后添加1
‑
羟基
‑
吡咯烷
‑
2,5
‑
二酮(hosu，25.2g，219mmol)和n
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
n'
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc.hcl，42.0g，219mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。然后蒸发溶剂。将残余物溶解于乙酸乙酯(400ml)中，并用水(2x300ml)和盐水(1x300ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。产物从乙酸乙酯/环己烷混合物(1:4，600ml)中沉淀出来。通过过滤收集沉淀物，用环己烷洗涤，并真空干燥，得到呈白色粉末的2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基2
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸酯(12)。产量：45.2g(94％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：8.07(t,j＝7.3hz,1h)；7.71(d,j＝7.7hz,1h)；7.60(d,j＝10.8hz,1h)；2.90(s,4h)；1.32(s,12h)。
[0879]
将(s)
‑
((((6
‑
((2
‑
羧基乙基)氨基)
‑6‑
氧代己烷
‑
1,5
‑
二基)双(氮烷二基))双(羰基))双(苯
‑
5,1,3
‑
三基))四甲铵2,2,2
‑
三氟乙酸盐(9，3.91g，3.92mmol)溶解于水/n,n
‑
二甲基甲酰胺混合物(1:1，80ml)中。随后添加n,n
‑
二异丙基乙胺(6.15ml，35.3mmol)和活化酯(12，5.69g，15.7mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜；然后用1m盐酸水溶液酸化。溶剂与甲苯共蒸发3次。将残余物溶解于乙酸乙酯(150ml)中，并用水(2x100ml)和盐水(1x100ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残余物用四氢呋喃(70ml)中的频哪醇(0.06g，0.49mmol)处理，并从四氢呋喃蒸发三次。在真空中干燥残余物，得到呈米色固体的标题化合物(13)。产量：5.82g(95％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.01
‑
8.83(m,4h)；8.51
‑
8.42(m,1h)；8.39
‑
8.30(m,1h)；8.10
‑
8.00(m,1h)；7.80
‑
7.31(m,18h)；4.59
‑
4.33(m,9h)；3.30
‑
3.19(m,4h)；2.39(t,j＝6.7hz,2h)；1.80
‑
1.67(m,2h)；1.59
‑
1.49(m,2h)；1.41
‑
1.21(m,50h)。lc
‑
ms:566.6((m
‑
4x频哪醇
‑
4x h2o)/2 h) 。
[0880]
实施例13：2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基3,5
‑
双((2
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)甲基)苯甲酸酯
[0881][0882]
将3,5
‑
双(氨基甲基)苯甲酸二盐酸盐(2，1.88g，7.43mmol)溶解于水(20ml)中。随后添加n,n
‑
二异丙基乙胺(10.4ml，59.5mmol)、n,n
‑
二甲基甲酰胺(40ml)和2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸酯(1，5.40g，14.8mmol)。
[0883]
将混合物在室温下搅拌过夜；然后用1m盐酸水溶液(200ml)酸化。溶剂与甲苯共蒸发3次。将残余物溶解于二氯甲烷/甲苯混合物(1:1，100ml)中，并用频哪醇(1.24g，10.5mmol)处理。将混合物从甲苯中蒸发3次。将残余物溶解于乙酸乙酯(150ml)中，并用水(3x100ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残余物溶解于二氯甲烷(10ml)中，产物开始沉淀。然后添加环己烷(190ml)，并通过过滤收集沉淀物，用环己烷洗涤，并真空干燥，得到呈白色粉末的3,5
‑
双((3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)甲基)苯甲酸(3)。
[0884]
产量：4.38g(87％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：12.95(bs,1h)；9.05
‑
8.97(m,2h)；7.82(s,2h)；7.64(t,j＝7.3hz,2h)；
[0885]
7.56
‑
7.49(m,3h)；7.44
‑
7.37(m,2h)；4.55
‑
4.47(m,4h)；1.31(s,24h)。lc
‑
ms:677.5(m h) ,595.3(m h
‑
频哪醇) ,513.3(m h
‑
2x频哪醇) 。
[0886]
将上述酸(3，4.37g，6.48mmol)溶解于乙腈/n,n
‑
二甲基甲酰胺混合物(4:1，100ml)中，并添加n
‑
羟基琥珀酰亚胺(hosu，0.89g，7.77mmol)。将混合物冷却至0℃，然后添加n,n
‑
二环己基碳二亚胺(dcc，1.60g，7.77mmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟，并在室温下过夜。滤出不溶性副产物，并蒸发滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯(250ml)中，并用水(2x150ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残余物溶解于二氯甲烷(10ml)中，并添加环己烷(170ml)。通过过滤收集沉淀物，用环己烷洗涤。将白色粉末溶解于四氢呋喃(100ml)中。将频哪醇(0.19g，1.60mmol)和硫酸镁(10g)加入到该溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌过夜。通过celite垫过滤该悬浮液，并蒸发滤液。将残余物溶解于二氯甲烷(10ml)中，并向该溶液中添加环己烷(170ml)。通过过滤收集沉淀物，用环己烷洗涤并真空干燥，得到呈白色粉末的标题化合物(4)。产量：3.99g(80％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.07(t,j＝5.7hz,2h)；7.96(s,2h)；7.75(s,1h)；7.65(t,j＝7.2hz,2h)；7.53(d,j＝7.7hz,2h)；7.41(d,j＝10.4hz,2h)；4.61
‑
4.48(m,4h)；2.89(s,4h)；1.31(s,24h)。lc
‑
ms:774.6(m h) ,692.4(m h
‑
频哪醇) ,610.3(m h
‑
2x频哪醇) 。
[0887]
实施例14：
[0888][0889]
通过固相肽合成由β
‑
ala、fmoc
‑
lys和4
‑
羧基
‑2‑
氟苯基硼酸频哪醇酯制备
[0890]
实施例15：2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基(r)
‑3‑
(2,4
‑
双(3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)丙酸酯
[0891][0892]
将l
‑
2,4
‑
二氨基丁酸二盐酸盐(1，4.81g，25.2mmol)悬浮在碳酸氢钠(10.6g，126mmol)的水(80ml)溶液中。加热混合物，直至形成澄清溶液。冷却至室温后，添加1,4
‑
二氧杂环己烷(80ml)和n
‑
(9
‑
芴基甲氧羰基氧基)琥珀酰亚胺(20.4g，60.4mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，然后用5m盐酸水溶液酸化。蒸发1,4
‑
二氧杂环己烷，用乙酸乙酯(2x100ml)萃取水相。合并的有机层用水(3x100ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。残余物从热乙酸乙酯/环己烷混合物中重结晶两次。通过过滤收集产物，用环己烷洗涤并真空干燥，得到呈白色粉末的(r)
‑
2,4
‑
双((((9h
‑
芴
‑9‑
基)甲氧基)羰基)氨基)丁酸(2)。产量：13.3g(94％)。
[0893]1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：12.62(bs,1h)；7.94
‑
7.83(m,4h)；7.79
‑
7.55(m,5h)；7.46
‑
7.26(m,9h)；4.34
‑
4.13(m,6h)；4.08
‑
3.94(m,1h)；3.14
‑
3.02(m,2h)；1.98
‑
1.84
(m,1h)；1.84
‑
1.65(m,1h)。lc
‑
ms:562.6(m h) 。
[0894]
让2
‑
氯三苯甲基氯树脂100
‑
200目1.5mmol/g(3，5.84g，8.75mmol)在无水二氯甲烷(70ml)中溶胀20分钟。将3
‑
((((9h
‑
芴
‑9‑
基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸(fmoc
‑
ala
‑
oh，1.82g，5.84mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(3.86ml，22.2mmol)在无水二氯甲烷(50ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇过夜。过滤树脂，并用n,n
‑
二异丙基乙胺(2.03ml，11.7mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(1:4，1x10min，1x50ml)中的溶液处理。然后用二氯甲烷(2x50ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x50ml)洗涤树脂。通过用在n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1x5min，1x20min，2x50ml)处理去除fmoc基团。用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x50ml)、2
‑
丙醇(2x50ml)、二氯甲烷(2x50ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x50ml)洗涤树脂。将(r)
‑
2,4
‑
双((((9h
‑
芴
‑9‑
基)甲氧基)羰基)氨基)丁酸(2，6.57g，11.7mmol)、氰基
‑
乙醛酸乙酯
‑2‑
肟(oxyma，1.66g，11.7mmol)、n,n
‑
二异丙基碳二亚胺(dic，1.81ml，11.7mmol)和2,4,6
‑
可力丁(3.09ml，23.4mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(50ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇2.5小时。将树脂过滤并用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x50ml)、二氯甲烷(2x50ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x50ml)洗涤。通过用在n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1x5min，1x20min，2x50ml)处理去除fmoc基团。用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x50ml)、2
‑
丙醇(2x50ml)、二氯甲烷(2x50ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x50ml)洗涤树脂。将2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸酯(4，8.48g，23.4mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(7.32ml，42.0mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(50ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇2小时。将树脂过滤并用n,n
‑
二甲基甲酰胺(3x60ml)和二氯甲烷(10x60ml)洗涤。通过用1,1,1,3,3,3
‑
六氟
‑2‑
丙醇/二氯甲烷混合物(1:2，90ml)处理2小时，从树脂上切下产物。滤出树脂，并用二氯甲烷(4x50ml)洗涤。蒸发溶剂；将残余物溶解于乙酸乙酯(100ml)中，并用水(2x80ml)和盐水(1x80ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干，得到呈米色固体的(r)
‑3‑
(2,4
‑
双(3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)丙酸(5)。产量：3.25g(81％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：12.11(bs,1h)；8.69(d,j＝7.9hz,1h)；8.63
‑
8.52(m,1h)；8.14
‑
8.03(m,1h)；7.81
‑
7.61(m,5h)；7.56(d,j＝10.5hz,1h)；4.54
‑
4.39(m,1h)；3.44
‑
3.17(m,4h)；2.43
‑
2.33(m,2h)；2.14
‑
1.99(m,1h)；1.99
‑
1.85(m,1h)；1.31(s,24h)。lc
‑
ms:521.0(m
‑
2x频哪醇 h) ,603.1(m
‑
频哪醇 h) ,685.3(m h) 。
[0895]
将酸(5，3.24g，4.73mmol)溶解于二氯甲烷(50ml)中，然后添加n
‑
羟基琥珀酰亚胺(0.65g，5.67mmol)和n
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
n
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(1.09g，5.67mmol)。将混合物搅拌过夜，然后用二氯甲烷(50ml)稀释，并用水(2x80ml)和盐水(1x80ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发至干，得到呈白色固体的标题化合物(6)。产量：3.42g(92％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：8.72(d,j＝7.9hz,1h)；8.57(t,j＝5.4hz,1h)；8.22(t,j＝5.5hz,1h)；7.77
‑
7.62(m,5h)；7.56(d,j＝10.1hz,1h)；4.53
‑
4.40(m,1h)；3.48
‑
3.27(m,4h)；2.86(t,j＝7.1hz,2h)；2.80(s,4h)；2.15
‑
2.02(m,1h)；2.02
‑
1.88(m,1h)；1.31(s,24h)。lc
‑
ms:618.1(m
‑
2x频哪醇 h) ,700.2(m
‑
频哪醇 h) ,782.4(m h) 。
[0896]
实施例16：3
‑
(3
‑
氟
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸
[0897][0898]
将3
‑
溴
‑5‑
碘苯甲酸(1，16.4g，50.0mmol)悬浮在甲醇(100ml)中，并添加甲磺酸(1ml)。将所得混合物在60℃(油浴)下搅拌16小时。将所得澄清溶液在冰箱中冷却至
‑
20℃保持16小时，通过过滤收集所得固体，用冷却的(
‑
20℃)甲醇洗涤并真空干燥，得到呈灰白色固体的3
‑
溴
‑5‑
碘苯甲酸甲酯(2)。
[0899]
产量：13.9g(82％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.30(s,1h)；8.14(s,1h)；8.04(s,1h)；3.93(s,1h)。
[0900]
将1,3
‑
二溴
‑5‑
氟苯(3，6.30ml，50.0mmol)溶解于无水乙醚(150ml)中，并冷却至
‑
78℃。在搅拌下逐滴添加己烷中的2.35m正丁基锂(22.0ml，52.5mmol)。15分钟后，添加无水n,n
‑
二甲基甲酰胺(7.70ml，100mmol)，并将所得混合物搅拌15分钟，然后升温至环境温度。一小时后，用1m盐酸水溶液(150ml)猝灭反应混合物。分离各层，有机层用盐水(100ml)洗涤，经无水硫酸镁干燥并蒸发，得到呈微黄色油状物的3
‑
溴
‑5‑
氟苯甲醛(4)，其在冰箱中储存时凝固。产量：10.2g(100％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：9.92(s,1h)；7.80(bs,1h)；7.50(bs,2h)。
[0901]
在氮气氛下将3
‑
溴
‑5‑
碘苯甲酸甲酯(2，6.80g，20.0mmol)溶解于无水四氢呋喃(50ml)中，并冷却至
‑
40℃。经由加料漏斗逐滴添加在四氢呋喃中的1.3m异丙基氯化镁
‑
氯化锂络合物(16.1ml，21.0mmol)。30分钟后，在无水四氢呋喃(5ml)的帮助下加入3
‑
溴
‑5‑
氟苯甲醛(4)(4.87g，24.0mmol)。使所得混合物在一小时内升温至室温，并在环境温度下再搅拌一小时。通过添加0.5m盐酸水溶液(50ml)猝灭反应，并用乙醚(1x200ml)萃取。有机层用盐水(3x100ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。将残余物5溶解于无水二氯甲烷(100ml)中，并添加氯铬酸吡啶鎓(pcc，6.45g，30.0mmol)。然后将反应混合物搅拌过夜(16小时)，之后用2
‑
丙醇(3ml)猝灭。在室温下搅拌一小时后，将反应混合物通过顶部具有celite s的硅胶塞(100g)过滤，并用二氯甲烷(2x100ml)洗涤。在真空中除去溶剂，并通过急骤柱色谱法(硅胶60，0.063
‑
0.200mm；洗脱液：环己烷/二氯甲烷6:1至2:1)纯化残余物，得到呈无色固体的3
‑
溴
‑5‑
(3
‑
溴
‑5‑
氟苯甲酰基)苯甲酸甲酯(6)。
[0902]
产量：7.10g(85％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.43(s,1h)；8.30(s,1h)；8.11(s,1h)；7.71(s,1h)；7.53(d,j＝7.6hz,1h)；7.41(d,j＝8.3hz,1h)；3.97(s,3h)。
[0903]
lc
‑
ms：分子油和片段均未检测到。
[0904]
将乙酸钾(6.70g，68.4mmol)装入250ml反应容器中，并将盐在110℃下真空干燥1小时。冷却至室温后，将反应容器用氮气回填，并装入3
‑
溴
‑5‑
(3
‑
溴
‑5‑
氟苯甲酰基)苯甲酸甲酯(6，7.10g，481mol)、乙酸钯(77.0mg，342mol)、2
‑
二环己基膦基
‑
2,4,6
‑
三异丙基联苯(xphos，325mg，684mol)和双(频哪醇)二硼(9.53mg，37.6mmol)。然后将反应容器抽空，并用
氮气回填(该过程重复两次)，用注射器加入无水四氢呋喃(3ml)，将容器用塑料塞密封并浸入预热至60℃的加热浴中。以400rpm搅拌16小时(过夜)后，将反应混合物冷却至环境温度，用二氯甲烷(100ml)稀释，并借助二氯甲烷(3x70ml)通过顶部具有celite s的短硅胶塞(70g)过滤。减压浓缩滤液，得到呈微黄色蜡状泡沫的产物，将其与冰冷的正己烷(70ml)一起研磨以引起结晶。通过过滤收集所得固体，并真空干燥，得到呈白色固体的3
‑
(3
‑
氟
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸甲酯(7)。产量：7.10g(88％)。
[0905]1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.69(s,1h)；8.48(s,1h)；8.38(s,1h)；7.97(s,1h)；7.72(d,j＝8.5hz,1h)；7.54(d,j＝9.0hz,1h)；3.95(s,3h)；1.36(s,12h)；1.35(s,12h)。lc
‑
ms:511.6(m h) 。
[0906]
将3
‑
(3
‑
氟
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸甲酯(7，7.10g，13.9mmol)悬浮在甲醇(42ml)和水(13ml)中。添加氢氧化锂(2.91g，69.5mmol)，并将所得混合物在环境温度下剧烈搅拌16小时。将反应混合物用水(120ml)稀释，并用乙醚(70ml)萃取。弃去醚层，水层用浓盐酸(10ml)酸化并用乙酸乙酯(100ml)萃取。有机层用盐水(3x100ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。将粗产物溶解于热乙酸乙酯(80ml)中，并加入频哪醇，直至获得澄清溶液。将溶液蒸发至干，然后从二氯甲烷(2x40ml)中蒸发两次，得到呈无色固体的标题3
‑
(3
‑
氟
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸(8)。该化合物含有无法去除的残留频哪醇。
[0907]
产量：6.82g(99％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.77(s,1h)；8.54(t,j＝1.8hz,1h)；8.44(d,j＝1.1hz,1h)；7.98(s,1h)；7.80
‑
7.68(m,1h)；7.63
‑
7.50(m,1h)；1.37(s,12h)；1.35(s,12h)。lc
‑
ms:497.5(m h) ,415.4(m
‑
频哪醇 h) 。
[0908]
实施例17：(2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基)3,5
‑
双[[[4
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基]氨基]甲基]苯甲酸酯
[0909][0910]
将3,5
‑
双((4
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)甲基)苯甲酸(1，2.57g，4.00mmol)溶解于乙腈/n,n
‑
二甲基甲酰胺混合物(3:1，100ml)中。添加n
‑
羟基琥珀酰亚胺(0.55g，4.80mmol)。将混合物冷却至0℃，然后添加n,n
‑
二环己基碳二亚胺(0.99g，4.80mmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟，并在室温下过夜。滤出不溶性副产物，并蒸发滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯(250ml)中，并用水(2x150ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残余物溶解于甲苯(10ml)中，产物开始沉淀。添加环己烷(170ml)。通过过滤收集沉淀物，用环己烷洗涤并真空干燥，得到呈白色粉末的标题化合物(2)。产物含有痕量的n,n
‑
二环己基脲。
[0911]
产量：2.85g(97％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.24(t,j＝5.7hz,2h)；
7.95
‑
7.83(m,6h)；7.79
‑
7.70(m,5h)；4.60
‑
4.52(m,4h)；2.87(s,4h)；1.31(s,24h)。lc
‑
ms:737.4(m h) ,655.2(m h
‑
频哪醇) ,573.1(m h
‑
2x频哪醇) 。
[0912]
实施例18：n2,n6
‑
双(6
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑5‑
羰基)
‑
l
‑
赖氨酸
[0913][0914]
将6
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑5‑
甲酸(1，6.00g，30.6mmol)溶解于四氢呋喃(80ml)中。在室温下添加n,n
‑
二甲基甲酰胺(10ml)、n
‑
羟基琥珀酰亚胺(3.87g，33.7mmol)和n
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
n
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(6.46g，33.7mmol)。搅拌2小时后，减压蒸发挥发物，并将残余物重新溶解于乙酸乙酯(200ml)中，并用1m盐酸水溶液(2x60ml)洗涤。有机部分使用无水硫酸钠干燥。减压蒸发挥发物，得到呈白色固体的2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基6
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑5‑
甲酸酯(2)。产量：8.35g(93％)。
[0915]1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.65(s,1h)；8.11(d,j＝5.9hz,1h)；7.71(d,j＝10.1hz,1h)；5.08(s,2h)；2.90(s,4h)。lc
‑
ms:294.4(m h) 。
[0916]
将l
‑
赖氨酸盐酸盐(3，1.56g，8.50mmol)溶解于n,n
‑
二甲基甲酰胺(50ml)和水(25ml)中。在室温下添加n,n
‑
二异丙基乙胺(8.92ml，51.2mmol)和2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基6
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑5‑
甲酸酯(2，5.00g，17.0mmol)。搅拌3小时后，减压蒸发挥发物，并将残余物用1m盐酸水溶液沉淀。沉淀物用水洗涤，并通过从乙腈/水混合物中沉淀来纯化，通过离心收集，并冷冻干燥，得到呈白色固体的n2,n6
‑
双(6
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑5‑
羰基)
‑
l
‑
赖氨酸(4)。
[0917]
产量：3.25g(76％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：12.66(bs,1h)；9.41(d,j＝5.7hz,2h)；8.59(d,j＝7.2hz,1h)；8.39(t,j＝5.0hz,1h)；7.61
‑
7.53(m,2h)；7.53
‑
7.44(m,2h)；4.97(d,j＝5.7hz,4h)；4.41
‑
4.30(m,1h)；3.30
‑
3.20(m,2h)；1.90
‑
1.70(m,2h)；1.59
‑
1.38(m,4h)。lc
‑
ms:503.5(m h) 。
[0918]
实施例19：(s)
‑
2,3
‑
双(4
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)丙酸
[0919][0920]
将4
‑
(溴甲基)
‑3‑
氟
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸甲酯(1，23.0g，61.7mmol)和氢氧化钠(12.3g，0.31mol)在水(400ml)中的溶液在环境温度下搅拌过夜。将6m盐酸水溶液(60ml，6m)加入到反应混合物中，产生白色沉淀物。将带有沉淀物的烧瓶在冰箱中放置1小时。然后将其过滤，滤饼用水(200ml)洗涤并冷冻干燥，得到呈白色固体的4
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸(2)。
[0921]
产量：12.1g(100％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：13.24(bs,1h),9.58(s,1h),8.20(s,1h),7.73(d,j＝9.9hz,1h),5.14(s,2h)。
[0922]
将4
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸(2，4.00g，20.4mmol)、n
‑
羟基琥珀酰亚胺(2.35g，20.4mmol)和1
‑
乙基
‑3‑
(3'
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(3.91g，20.4mmol)在四氢呋喃(120ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(20ml)中在环境温度下搅拌3.5小时。蒸发反应混合物，并用乙酸乙酯(3x150ml)和1m盐酸水溶液(150ml)萃取。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到呈白色固体的2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基4
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸酯(3)。产量：5.68g(97％)。
[0923]
lc
‑
ms:294.3(m h) 。
[0924]
将2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基4
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸酯(3，5.10g，17.4mmol)、(s)
‑
2,3
‑
二氨基丙酸盐酸盐(4，1.22g，8.70mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(9.28ml，52.2mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(100ml)和水(10ml)中的溶液在环境温度下搅拌过夜。蒸发反应混合物，并用乙酸乙酯(2x250ml)和1m盐酸水溶液(150ml)萃取，有机层用盐水(200ml)洗涤。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到呈白色固体的(s)
‑
2,3
‑
双(4
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)丙酸(5)。产量：3.53g(88％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：12.82(bs,1h)；9.54(d,j＝6.2hz,2h)；8.86(d,j＝7.7hz,1h)；8.78(t,j＝6.0hz,1h)；8.10(s,1h)；8.04(s,1h)；7.80
‑
7.63(m,2h)；5.13(d,j＝6.2hz,4h)；4.77
‑
4.62(m,1h)；3.91
‑
3.77(m,1h)；3.77
‑
3.62(m,1h)。lc
‑
ms:461.3(m h) 。
[0925]
实施例20：2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基3
‑
(2,4
‑
二氟
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸酯
[0926][0927]
将3
‑
溴
‑5‑
碘苯甲酸(1，5.00g，15.3mmol)溶解于无水二氯甲烷(100ml)中，并添加叔丁醇(1.52ml，16.1mmol)、n,n'
‑
二环己基碳二亚胺(3.31ml，16.1mmol)和4
‑
(二甲基氨基)吡啶(1.96ml，16.1mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16小时。然后用1m盐酸水溶液(2x50ml)和盐水(1x40ml)洗涤反应混合物。有机部分经无水硫酸钠干燥。减压蒸发挥发物，并通过柱色谱法纯化残余物(硅胶60，0.063
‑
0.200mm；洗脱液：环己烷/乙酸乙酯10:1)，得到呈白色固体的3
‑
溴
‑5‑
碘苯甲酸叔丁酯(2)。产量：4.67g(80％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.22(s,1h)；8.06(s,1h)；8.00(s,1h)；1.58(s,9h)。
[0928]
在氮气氛下将3
‑
溴
‑5‑
碘苯甲酸叔丁酯(2，4.31g，11.3mmol)溶解于无水四氢呋喃(50ml)中，并冷却至
‑
40℃。缓慢逐滴添加在四氢呋喃中的1.3m异丙基氯化镁
‑
氯化锂络合物(9.52ml，12.4mmol)。40分钟后，在无水四氢呋喃(5ml)的帮助下加入5
‑
溴
‑
2,4
‑
二氟苯甲醛(3，2.86g，12.9mmol)。让所得混合物升温至室温过夜(16小时)。通过添加0.5m盐酸水溶液(15ml)猝灭反应，并用乙酸乙酯(2x100ml)萃取。有机层用盐水(3x40ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥。减压蒸发挥发物，并通过柱色谱法纯化残余物(硅胶60，0.063
‑
0.200mm；洗脱液：环己烷/乙酸乙酯10:1)，得到呈白色固体的3
‑
溴
‑5‑
((5
‑
溴
‑
2,4
‑
二氟苯基)(羟基)甲基)苯甲酸叔丁酯(4)。产量：4.38g(81％)。
[0929]1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.02(t,j＝1.6hz,1h)；7.92(s,1h)；7.77
‑
7.65(m,2h)；6.89(dd,j＝9.7和8.3,1h)；6.09(d,j＝3.9hz,1h)；2.43(d,j＝4.0hz,1h)；1.68
‑
1.58(m,9h)。
[0930]
将3
‑
溴
‑5‑
((5
‑
溴
‑
2,4
‑
二氟苯基)(羟基)甲基)苯甲酸叔丁酯(4)溶解于无水二氯甲烷(50ml)中，并添加氯铬酸吡啶(pcc，2.96g，13.7mmol)。然后将反应混合物搅拌过夜(16小时)，之后用2
‑
丙醇(1.5ml)猝灭。在室温下搅拌一小时后，将反应混合物通过的celite(5g)短塞过滤，并用二氯甲烷(50ml)洗涤。减压除去挥发物，并通过急骤柱色谱法纯化残余物(硅胶60，0.063
‑
0.200mm；洗脱液：环己烷/乙酸乙酯20:1)，得到呈无色固体的3
‑
溴
‑5‑
(5
‑
溴
‑
2,4
‑
二氟苯甲酰基)苯甲酸叔丁酯(5)。产量：4.20g(96％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.33(t,j＝1.7hz,1h)；8.28
‑
8.24(m,1h)；8.10
‑
8.07(m,1h)；7.86(t,j＝7.3hz,1h)；7.03(dd,j＝9.3和8.1hz,1h)；1.61(s,9h)。
[0931]
将3
‑
溴
‑5‑
(5
‑
溴
‑
2,4
‑
二氟苯甲酰基)苯甲酸叔丁酯(5，4.20g，8.82mmol)、乙酸钯(59.0mg，0.26mmol)、2
‑
二环己基膦基
‑
2,4,6
‑
三异丙基联苯(xphos，252mg，0.52mmol)、乙酸钾(3.46g，35.3mmol)和双(频哪醇)二硼(4.70g，18.5mmol)在反应烧瓶中混合，将所得混合物抽空，并用氩气回填(该过程重复两次)。用注射器加入无水四氢呋喃(60ml)，用橡胶隔
膜密封，并浸入预热至60℃的加热浴中。搅拌16小时后，将反应混合物冷却至环境温度，用环己烷(100ml)稀释，并借助二氯甲烷(100ml)通过celite短过滤。减压除去挥发物，并通过急骤柱色谱法纯化残余物(硅胶60，0.063
‑
0.200mm；洗脱液：环己烷/乙酸乙酯10:1)，得到呈黄色固体的3
‑
(2,4
‑
二氟
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸叔丁酯(6)。产量：4.78g(95％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.61(s,1h)；8.41(d,j＝1.5hz,1h)；8.34(s,1h)；8.05(dd,j＝8.3和6.7hz,1h)；6.96
‑
6.81(m,1h)；1.61(s,9h)；1.36(d,j＝2.2hz,24h)。
[0932]
将3
‑
(2,4
‑
二氟
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸叔丁酯(6，4.78g，8.38mmol)溶解于二氯甲烷(10ml)中，并在室温下添加三氟乙酸(40ml)。将反应混合物搅拌3小时。减压除去挥发物，并将残余物与二氯甲烷(4x50ml)共蒸发。得到的3
‑
(2,4
‑
二氟
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸(7)无需进一步纯化即用于下一步。
[0933]
产量：4.10g(96％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.75(s,1h)；8.50(t,j＝1.7hz,1h)；8.46(s,1h)；8.09(dd,j＝8.4和6.8hz,1h)；6.95
‑
6.83(m,1h)；1.37(d,j＝1.8hz,24h)。
[0934]
将3
‑
(2,4
‑
二氟
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸(7，4.10g，8.00mmol)溶解于二氯甲烷(50ml)中，并在室温下添加n
‑
羟基琥珀酰亚胺(1.29g，11.2mmol)和n
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
n
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(2.14g，11.2mmol)。搅拌6小时后，反应混合物用10％硫酸氢钾水溶液(2x100ml)和盐水(30ml)洗涤。有机部分使用无水硫酸钠干燥。减压蒸发挥发物，得到呈黄色固体的2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基3
‑
(2,4
‑
二氟
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸酯(8)。
[0935]
产量：4.84g(99％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.81
‑
8.75(m,1h)；8.57
‑
8.51(m,1h)；8.47(s,1h)；8.08(dd,j＝8.5和6.7hz,1h)；6.89(dd,j＝9.9和9.0hz,1h)；2.92(bs,4h)；1.36(s,24h)。lc
‑
ms:448.4(m
‑
2频哪醇 h) 。
[0936]
实施例21：2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基3,5
‑
双((2
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)甲基)苯甲酸酯
[0937][0938]
将3,5
‑
双(氨基甲基)苯甲酸二盐酸盐(2，1.88g，7.43mmol)溶解于水(20ml)中。随后添加n,n
‑
二异丙基乙胺(10.4ml，59.5mmol)、n,n
‑
二甲基甲酰胺(40ml)和2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸酯(1，5.40g，
14.8mmol)。
[0939]
将混合物在室温下搅拌过夜；然后用1m盐酸水溶液(200ml)酸化。溶剂与甲苯共蒸发3次。将残余物溶解于二氯甲烷/甲苯混合物(1:1，100ml)中，并用频哪醇(1.24g，10.5mmol)处理。将混合物从甲苯中蒸发3次。将残余物溶解于乙酸乙酯(150ml)中，并用水(3x100ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残余物溶解于二氯甲烷(10ml)中，产物开始沉淀。然后添加环己烷(190ml)，并通过过滤收集沉淀物，用环己烷洗涤，并真空干燥，得到呈白色粉末的3,5
‑
双((3
‑
氟
‑4‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰胺基)甲基)苯甲酸(3)。产量：4.38g(87％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：12.95(bs,1h)；9.05
‑
8.97(m,2h)；7.82(s,2h)；7.64(t,j＝7.3hz,2h)；7.56
‑
7.49(m,3h)；7.44
‑
7.37(m,2h)；4.55
‑
4.47(m,4h)；1.31(s,24h)。lc
‑
ms:677.5(m h) ,595.3(m h
‑
频哪醇) ,513.3(m h
‑
2x频哪醇) 。
[0940]
将上述酸(3，4.37g，6.48mmol)溶解于乙腈/n,n
‑
二甲基甲酰胺混合物(4:1，100ml)中，并添加n
‑
羟基琥珀酰亚胺(hosu，0.89g，7.77mmol)。将混合物冷却至0℃，然后添加n,n
‑
二环己基碳二亚胺(dcc，1.60g，7.77mmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟，并在室温下过夜。滤出不溶性副产物，并蒸发滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯(250ml)中，并用水(2x150ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残余物溶解于二氯甲烷(10ml)中，并添加环己烷(170ml)。通过过滤收集沉淀物，用环己烷洗涤。将白色粉末溶解于四氢呋喃(100ml)中。将频哪醇(0.19g，1.60mmol)和硫酸镁(10g)加入到该溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌过夜。通过celite垫过滤该悬浮液，并蒸发滤液。将残余物溶解于二氯甲烷(10ml)中，并向该溶液中添加环己烷(170ml)。通过过滤收集沉淀物，用环己烷洗涤并真空干燥，得到呈白色粉末的标题化合物(4)。产量：3.99g(80％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.07(t,j＝5.7hz,2h)；7.96(s,2h)；7.75(s,1h)；7.65(t,j＝7.2hz,2h)；7.53(d,j＝7.7hz,2h)；7.41(d,j＝10.4hz,2h)；4.61
‑
4.48(m,4h)；2.89(s,4h)；1.31(s,24h)。lc
‑
ms:774.6(m h) ,692.4(m h
‑
频哪醇) ,610.3(m h
‑
2x频哪醇) 。
[0941]
实施例22：(3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
((3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)磺酰基)苯甲酰基)甘氨酸
[0942][0943]
将1,3
‑
二溴
‑5‑
(三氟甲基)苯(1，13.1g，43.1mmol)加入到五水合硫酸铜(ii)(541mg，2.36mmol)和氢氧化钾(9.24g，216mmol)在二甲基亚砜/水混合物(10:1，70ml)中的混合物中，反应烧瓶用氮气填充，最后通过隔膜加入1,2
‑
乙二硫醇(6.00ml，90.5mmol)。将反应混合物加热至110℃过夜。然后用1m盐酸水溶液将混合物酸化至ph＝2，并用乙酸乙酯萃取。经无水硫酸钠干燥并过滤后，减压蒸发溶剂。通过柱色谱法(硅胶60，0.063
‑
0.200mm；
洗脱液：环己烷)纯化残余物，得到呈白色油状物的3
‑
溴
‑5‑
(三氟甲基)苯硫醇(2)。
[0944]
产量：5.76g(52％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：7.61(s,1h)；7.56(s,1h)；7.46(s,1h)；3.66(s,1h)。
[0945]
将3
‑
溴
‑5‑
(三氟甲基)苯硫醇(2，5.76g，22.4mmol)、3
‑
溴
‑5‑
碘代苯甲酸甲酯(3，5.09g，14.9mmol)、碳酸钾(2.95g，24.8mmol)和碘化铜(i)(410mg，2.49mmol)溶解于无水二甲氧基乙烷(44ml)中。将反应烧瓶加热至80℃保持48小时。此后用乙酸乙酯稀释混合物，并通过celite过滤，然后减压蒸发溶剂。通过柱色谱法(硅胶60，0.063
‑
0.200mm；洗脱液：环己烷/乙酸乙酯1:0至20:1)纯化残余物，得到呈黄色油状物的3
‑
溴
‑5‑
((3
‑
溴
‑5‑
(三氟甲基)苯基)硫基)苯甲酸甲酯(4)。产量：6.64g(63％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：7.82(m,1h)；7.68(m,3h)；7.52(m,1h)；2.54(s,3h)。
[0946]
将3
‑
溴
‑5‑
((3
‑
溴
‑5‑
(三氟甲基)苯基)硫基)苯甲酸甲酯(4，6.64g，14.1mmol)和硫酸氢钾(oxone)(8.20g，35.3mmol)悬浮在甲醇(30ml)中，并加水(10ml)。将反应在室温下搅拌过夜。然后将混合物用乙酸乙酯(50ml)稀释，用水(1l)洗涤，然后用盐水(100ml)洗涤。减压蒸发有机相，通过柱色谱法(硅胶60，0.063
‑
0.200mm；洗脱液：环己烷/乙酸乙酯9:1至3:1)层析残余物，得到呈白色固体的3
‑
溴
‑5‑
((3
‑
溴
‑5‑
(三氟甲基)苯基)磺酰基)苯甲酸甲酯(5)。产量：5.46g(77％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.53(m,1h)；8.43(m,1h)；8.27(m,2h)；8.15(m,1h)；8.00(m,1h)；4.00(s,3h)。
[0947]
将3
‑
溴
‑5‑
((3
‑
溴
‑5‑
(三氟甲基)苯基)磺酰基)苯甲酸甲酯(5，5.46g，10.9mmol)和一水合氢氧化锂(1.33g，31.7mmol)溶解于甲醇/水/四氢呋喃的混合物(4:2:5，35ml)中，将反应混合物在室温下搅拌过夜。此后用1m盐酸水溶液将混合物酸化至ph 2，并用乙酸乙酯萃取。蒸发所有挥发物后得到呈白色固体的3
‑
溴
‑5‑
((3
‑
溴
‑5‑
(三氟甲基)苯基)磺酰基)苯甲酸(6)。产量：5.10g(96％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：13.91(bs,1h)；8.68(s,2h)；8.50(s,1h)；8.45(s,1h)；8.41(s,1h)；8.32(s,1h)。
[0948]
将无水n,n
‑
二甲基甲酰胺(130ml)中与1
‑
((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)
‑
1h
‑
[1,2,3]三唑并[4,5
‑
b]吡啶3
‑
氧化物六氟磷酸盐(v)(hatu，4.40g，11.6mmol)混合的3
‑
溴
‑5‑
((3
‑
溴
‑5‑
(三氟甲基)苯基)磺酰基)苯甲酸(6，5.10g，10.5mmol)搅拌30分钟，然后添加三乙胺(7.5ml，52.3mmol)，并添加甘氨酸叔丁酯盐酸盐(3.51g，20.9mmol)并搅拌过夜。反应结束后加水，用乙酸乙酯(150ml)萃取反应混合物，减压蒸发所有挥发物后，通过柱色谱法(硅胶60，0.063
‑
0.200mm；洗脱液：环己烷/乙酸乙酯3:1)纯化残余物，得到呈白色固体的(3
‑
溴
‑5‑
((3
‑
溴
‑5‑
(三氟甲基)苯基)磺酰基)苯甲酰基)甘氨酸叔丁酯(7)。
[0949]
产量：6.30g(99％)。lc
‑
ms:602.3(m h) 。
[0950]
将乙酸钾(5.13g，26.1mmol)装入100ml反应烧瓶中，并将盐在110℃下真空干燥1小时。冷却至室温后，将反应烧瓶用氮气回填，并装入(3
‑
溴
‑5‑
((3
‑
溴
‑5‑
(三氟甲基)苯基)磺酰基)苯甲酰基)甘氨酸叔丁酯(7，6.30g，10.5mmol)、乙酸钯(120mg，0.52mmol)、2
‑
二环己基膦基
‑
2,4,6
‑
三异丙基联苯(xphos，500mg，1.04mmol)和双(频哪醇)二硼(5.9g，23.03mmol)。然后将反应烧瓶抽空，并用氮气回填(该过程重复两次)，用注射器加入无水四氢呋喃(50ml)，将烧瓶用塑料塞密封并加热至60℃。将反应混合物搅拌过夜，然后冷却至环境温度，用二氯甲烷(150ml)稀释，并通过顶部具有celite的短硅胶塞过滤，并用二氯甲烷(3x50ml)洗涤。减压浓缩滤液，得到呈黑色蜡状泡沫的(3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼
杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
((3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)磺酰基)苯甲酰基)甘氨酸叔丁酯(8)。产量：6.70g(92％)。lc
‑
ms:640.5(m h
‑
tbu) ,558.4(m
‑
频哪醇
‑
tbu h) ,476.3(m
‑
2频哪醇
‑
tbu h) 。
[0951]
将(3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
((3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)磺酰基)苯甲酰基)甘氨酸叔丁酯(8，6.70g，10.5mmol)与三氟乙酸(25ml)混合，并在室温下搅拌1小时，此后减压蒸发所有挥发物。然后将残余物溶解于乙酸乙酯(50ml)中，并通过顶部具有celite的硅胶短塞过滤。减压浓缩滤液，得到橙色硬质泡沫，将其压碎。获得呈淡橙色固体的(3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
((3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)磺酰基)苯甲酰基)甘氨酸(9)。产量：
[0952]
3.89g(63％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.57(m,3h)；8.47(s,1h)；8.31(s,1h)；9.26(s,1h)；7.23(t,1h)；4.35(d,2h)；1.38(s,1h)。
19
f nmr谱(282mhz,cdcl3,δf)：
‑
62.65(s)。lc
‑
ms:640.5(m h) ,558.4(m
‑
频哪醇 h) ,476.3(m
‑
2x频哪醇 h) 。
[0953]
实施例23：n
‑
(5
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
羰基)
‑
n
‑
(2
‑
(5
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)乙基)甘氨酸
[0954][0955]
将氯乙酸(1，13.0g，136mmol)分小份添加到预冷(0℃)的乙二胺(2，90ml)中。添加完成后，使反应混合物达到室温过夜(16小时)。在真空中蒸发乙二胺，并将残余物与二甲基亚砜(140ml)一起在搅拌下研磨过夜。通过过滤收集沉淀物，并用二甲基亚砜(2x60ml)、乙腈(3x100ml)和乙醚(3x100ml)洗涤，得到呈无色固体的(2
‑
氨基乙基)甘氨酸(3)。产量：13.2g(83％)。1h nmr谱(300mhz,d2o,δh)：3.27(s,2h)；3.05
‑
3.01(m,2h)；2.92
‑
2.88(m,2h)。
[0956]
将2,3,4,5,6
‑
五氟苯酚(9.39g，51.0mmol)、5
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸(4，10.0g，51.0mmol)和n,n'
‑
二环己基碳二亚胺(dcc，10.5g，51.0mmol)在乙腈(300ml)中的溶液在环境温度下搅拌过夜。过滤反应混合物，用乙腈洗涤并蒸发。通过从二氯甲烷/己烷的混合物(9:1，500ml)中结晶来纯化粗产物5，得到呈白色固体的5
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸五氟苯酯(5)。产量：6.80g(37％)。lc
‑
ms:363.2(m h) 。
[0957]
将5
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸五氟苯酯(5，6.80g，18.8mmol)、(2
‑
氨基乙基)甘氨酸(3，1.10g，9.39mmol)和三乙胺(10.5ml，75.1mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(80ml)中的溶液在环境温度下搅拌过夜。蒸发反应混合物，并用乙酸
乙酯(2x500ml)和1m盐酸水溶液(400ml)萃取，有机层用盐水(300ml)洗涤。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。粗产物6通过急骤色谱法(硅胶，0.063
‑
0.200mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇/甲酸100:2:0.5至100:10:0.5)纯化，并冷冻干燥，得到呈白色固体的n
‑
(5
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
羰基)
‑
n
‑
(2
‑
(5
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
[0958]
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)乙基)甘氨酸(6)。
[0959]
产量：2.16g(49％)。rf(sio2，二氯甲烷/甲醇/甲酸100:2:0.5)：0.30。
[0960]1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：12.86(bs,1h)；9.45
‑
9.17(m,2h)；8.48
‑
8.11(m,1h)；8.11
‑
7.88(m,1h)；7.65(d,j＝7.0hz,1h)；7.43
‑
7.15(m,2h)；4.99(d,j＝8.6hz,4h)；4.36
‑
3.90(m,2h)；3.80
‑
3.34(m,4h)。lc
‑
ms:475.4(m h) 。
[0961]
实施例24：4
‑
((3s,4s)
‑
3,4
‑
双(1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)吡咯烷
‑1‑
基)
‑4‑
氧代丁酸
[0962][0963]
将1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸(1，13.5g，54.9mmol)、n
‑
羟基琥珀酰亚胺(6.31g，54.9mmol)和1
‑
乙基
‑3‑
(3'
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(10.5g，54.9mmol)在四氢呋喃(270ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(40ml)中在环境温度下搅拌4小时。蒸发反应混合物，并用乙酸乙酯(3x300ml)和1m盐酸水溶液(200ml)萃取。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到呈白色固体的2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸酯(2)。产量：18.8g(100％)。lc
‑
ms:344.3(m h) 。
[0964]
将4
‑
((3s,4s)
‑
3,4
‑
二氨基吡咯烷
‑1‑
基)
‑4‑
氧代丁酸二盐酸盐(3，2.74mg，10.0mmol)、2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸酯(2，6.86mg,20.0mmol)
[0965]
和n,n
‑
二异丙基乙胺(11.0ml，60.0mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(240ml)和水(60ml)中的溶液在环境温度下搅拌过夜。蒸发反应混合物，通过柱色谱法(硅胶，0.063
‑
0.200mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇/甲酸100:2:0.5至100:10:0.5)纯化，并冷冻干燥，得到呈白色固体的4
‑
((3s,4s)
‑
3,4
‑
双(1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)吡咯烷
‑1‑
基)
‑4‑
氧代丁酸(4)。
[0966]
产量：2.56g(39％)。rf(sio2，二氯甲烷/甲醇/甲酸100:10:0.5)：0.3。
[0967]1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)11.73(bs,1h)；9.62(s,2h)；9.01(dd,j＝10.4和
7.2hz,2h)；8.49(s,2h)；8.24(s,2h)；5.20(s,4h)；4.94
‑
4.51(m,2h)；4.16
‑
3.94(m,1h)；3.95
‑
3.80(m,1h)；3.56
‑
3.44(m,1h)；3.41
‑
3.34(m,1h)；2.49
‑
2.40(m,4h)。lc
‑
ms:658.7(m h) 。
[0968]
实施例25：2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基3
‑
(二氟(3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)甲基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸酯
[0969][0970]
将3
‑
溴
‑5‑
碘苯甲酸甲酯(1，6.80g，20.0mmol)溶解于无水四氢呋喃(40ml)中，并冷却至
‑
30℃。在搅拌下逐滴添加异丙基氯化镁
‑
氯化锂络合物在四氢呋喃中的1.3m溶液(16.2ml，21.0mmol)。30分钟后，在四氢呋喃(3ml)的帮助下加入3
‑
溴
‑5‑
(三氟甲基)苯甲醛(2，6.00g，24.0mmol)。使所得混合物升温至环境温度，并在1小时后通过添加1m盐酸水溶液(40ml)猝灭。将反应混合物吸收在乙醚(150ml)中，用水(150ml)和盐水(100ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。将粗产物(3)溶解于无水二氯甲烷(80ml)中，并在搅拌下添加氯铬酸吡啶(6.42g，30.0mmol)。搅拌17小时后，将反应混合物通过顶部具有celite的硅胶塞(80g)过滤，并用二氯甲烷(3x120ml)洗涤床。在真空中浓缩微黄色溶液，并将残余物在甲醇(50ml)中搅拌16小时。通过过滤收集沉淀的固体，并风干，得到呈无色固体的3
‑
溴
‑5‑
(3
‑
溴
‑5‑
(三氟甲基)苯甲酰基)苯甲酸甲酯(4)。产量：6.52g(70％)。
[0971]1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.45(t,j＝1.4hz,1h)；8.29(m,1h)；8.12(t,j＝1.6hz,1h)；8.08(bs,1h)；8.04(bs,1h)；7.95(bs,1h)；3.97(s,3h)。
[0972]
将3
‑
溴
‑5‑
(3
‑
溴
‑5‑
(三氟甲基)苯甲酰基)苯甲酸甲酯(4，6.50g，13.9mmol)和deoxo
‑
fluor(13.0ml)装入100ml反应容器中。用起泡器(填充硅油)密封容器，用氮气吹扫，并加热至90℃(油浴)16小时。将反应混合物冷却至环境温度，并用二氯甲烷(100ml)稀释。将所得溶液缓慢加入到1m碳酸钾水溶液(100ml)中，并将两相混合物搅拌1小时，以分解过量的氟化试剂。分离各层，有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。通过急骤柱色谱法(硅胶60，0.040
‑
0.063mm；洗脱液：环己烷/乙酸乙酯30:1至15:1)纯化粗产物，得到呈微黄色油状物的3
‑
溴
‑5‑
((3
‑
溴
‑5‑
(三氟甲基)苯基)二氟甲基)苯甲酸甲酯(5)。产量：6902mg(99％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.30(s,1h)；8.08(s,1h)；7.88(s,1h)；7.83(s,1h)；7.81(s,1h)；7.71(s,1h)；3.96(s,3h)。
[0973]
19
f nmr谱(282mhz,cdcl3,δf)：
‑
62.87(s,3h)；
‑
90.00(s,2h)。
[0974]
将乙酸钾(6.83g，69.7mmol)装入500ml反应容器中，并将盐在110℃下真空干燥1小时。冷却至室温后，将反应容器用氮气回填，并装入3
‑
溴
‑5‑
((3
‑
溴
‑5‑
(三氟甲基)苯基)二氟甲基)苯甲酸甲酯(5，6.90g，13.9mmol)、乙酸钯(62.0mg，279mol)、2
‑
二环己基膦基
‑
2,
4,6
‑
三异丙基联苯(xphos，265mg，557mol)和双(频哪醇)二硼(838mg，30.7mmol)。然后将反应容器抽空，并用氮气回填(该过程重复两次)。用注射器加入无水四氢呋喃(50ml)，用塑料塞密封，并浸入预热至60℃的加热浴中。以400rpm搅拌16小时后，将反应混合物冷却至环境温度，用二氯甲烷(200ml)稀释，并借助二氯甲烷(3x120ml)通过顶部具有celite s的短硅胶塞(90g)过滤。减压浓缩滤液，得到呈淡褐色泡沫的3
‑
(二氟(3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)甲基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸甲酯(6)。将其悬浮在甲醇(50ml)和水(15ml)中，添加一水合氢氧化锂(2.94g，70.0mmol)，并将所得混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物吸收在水(150ml)中，并用二氯甲烷(2x30ml)和乙醚(30ml)洗涤。水层用浓盐酸水溶液酸化至ph＝2，并用乙酸乙酯(100ml)萃取。有机层用盐水(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到微黄色泡沫。向泡沫中加入频哪醇(472mg，4.00mmol)，并在乙腈(50ml)中搅拌过夜。通过过滤收集沉淀的固体，用冰冷的乙腈(2x20ml)洗涤，并风干，得到呈无色固体的标题3
‑
(二氟(3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)甲基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸(7)。产量：5.90g(77％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.64(s,1h)；8.28(s,1h)；8.22(s,1h)；8.15(s,2h)；7.85(s,1h)；1.38(s,12h)；1.37(s,12h)。lc
‑
ms:569.7(m h) 。
[0975]
将3
‑
(二氟(3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)甲基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸(7，5.11g，9.00mmol)和双(琥珀酰亚胺基)碳酸酯(3.22g，12.6mmol)悬浮在氮气下的无水乙腈(45ml)和吡啶(1.00ml，12.6mmol)中。用热风器轻轻加热反应混合物以实现溶解。搅拌16小时后，在真空中浓缩反应混合物，将残余物吸收在乙酸乙酯(100ml)中，并用0.5m碳酸氢钾水溶液(2x40ml)和盐水(50ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并减压浓缩，得到灰白色固体。添加频哪醇(354mg，3.00mmol)，并将混合物在乙腈(50ml)中搅拌过夜。通过过滤收集沉淀的固体，用冰冷的乙腈(2x20ml)洗涤，并风干，得到呈无色固体的标题2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基3
‑
(二氟(3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)甲基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸酯(8)。产量：5.36g(90％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.67(s,1h)；8.29(s,1h)；8.26(s,1h)；8.15(s,1h)；8.10(s,1h)；7.86(s,1h)；2.92(s,4h)；1.36(s,24h)。lc
‑
ms:646.8(m
‑
hf) 。
[0976]
实施例26：(s)
‑
2,3
‑
双(1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)丙酸
[0977][0978]
将2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸酯(1，14.4g，42.0mmol)、(s)
‑
2,3
‑
二氨基丙酸盐酸盐(2，2.81g，
20.0mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(21.4ml，120mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(400ml)和水(100ml)中的溶液在环境温度下搅拌过夜。将反应混合物蒸发，并通过柱色谱法(硅胶，0.063
‑
0.200mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇/甲酸100:2:0.5至100:10:0.5)纯化。蒸发含有所需产物的级分，并用1m硫酸氢钾水溶液(400ml)洗涤。过滤沉淀物，将其溶解于乙腈和水的混合物(2:1)中，并冷冻干燥，得到呈白色固体的(s)
‑
2,3
‑
双(1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)丙酸(3)。产量：4.32g(39％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：12.59(bs,1h)；9.62(d,j＝6.1hz,2h)；9.09(d,j＝7.9hz,1h)；8.98(t,j＝5.7hz,1h)；8.50(d,j＝14.5hz,2h)；8.24(d,j＝21.6hz,2h)；5.20(d,j＝5.7hz,4h)；4.87
‑
4.58(m,1h)；4.02
‑
3.80(m,1h)；3.79
‑
3.54(m,1h)。lc
‑
ms:561.6(m h) 。
[0979]
实施例27：(3
‑
((3
‑
(五氟
‑6‑
硫基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯基)磺酰基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基)甘氨酸
[0980][0981]
将(3
‑
溴
‑5‑
((3
‑
溴
‑5‑
(五氟
‑6‑
硫基)苯基)磺酰基)苯甲酰基)甘氨酸叔丁酯(1，8.00g，12.1mmol)、乙酸钯(137mg，0.61mmol)、2
‑
二环己基膦基
‑
2,4,6
‑
三异丙基联苯(xphos，577mg，1.21mol)、双(频哪醇)二硼(6.78g，26.7mmol)和乙酸钾(5.95g，60.7mmol)在无水四氢呋喃(450ml)中的混合物在氩气气氛下于60℃加热24小时。将混合物冷却至室温，并通过celite短塞过滤。减压除去溶剂，并通过急骤柱色谱法(硅胶60，0.040
‑
0.063mm；洗脱液：二氯甲烷/乙酸乙酯10:0至6:4)纯化残余物，得到呈灰白色泡沫的(3
‑
((3
‑
(五氟
‑6‑
硫基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯基)磺酰基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基)甘氨酸叔丁酯(2)。产量：6.70g(72％)。
[0982]1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.53
‑
8.49(m,2h)；8.49
‑
8.46(m,1h)；8.43(t,j＝1.9hz,1h)；8.39
‑
8.36(m,1h)；8.32(dd,j＝2.1和0.6hz,1h)；6.76(t,j＝5.0hz,1h)；4.16(d,j＝5.0hz,2h)；1.51(s,9h)；1.36(s,24h)。lc
‑
ms:754.9(m h) 。
[0983]
将(3
‑
((3
‑
(五氟
‑6‑
硫基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯基)磺酰基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基)甘氨酸叔丁酯(2，6.68g，8.87mmol)在二氯甲烷(100ml)中的溶液在室温下搅拌2小时。减压除去溶剂。在真空干燥之前，将残余物从二氯甲烷(250ml)中蒸发十次。获得呈灰白色固体的(3
‑
((3
‑
(五氟
‑6‑
硫基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯基)磺酰基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酰基)甘氨酸(3)。产量：6.15g(99％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.33(t,j＝5.8hz,1h)；8.65(t,j＝1.8hz,1h)；8.55(t,j＝1.9hz,1h)；8.47(s,1h)；8.41
‑
8.29(m,2h)；8.25
‑
8.16(m,1h)；3.96(d,j＝5.9hz,2h)；1.41
‑
1.24(m,24h)。lc
‑
ms:534.4(m
‑
2xpin h) 。
[0984]
实施例28：n
‑
(1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
羰基)
‑
n
‑
(2
‑
(1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)乙基)甘氨酸
[0985][0986]
将1
‑
溴吡咯烷
‑
2,5
‑
二酮(nbs，34.0g，191mmol)加入到3
‑
三氟甲基
‑4‑
甲基苯甲酸(1，39.0g，191mmol)在浓硫酸(400ml)中的溶液中，并将反应混合物在环境温度下搅拌16小时。然后将反应混合物倒入冰水(2l)中。滤出所得沉淀物，用水(500ml)洗涤并溶解于乙酸乙酯(400ml)中；经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到呈白色固体的3
‑
溴
‑4‑
甲基
‑5‑
三氟甲基苯甲酸(2)。产量：53.4g(98％)。1hnmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：13.71(bs,1h)；8.35(d,j＝0.4hz,1h)；8.15(d,j＝0.9hz,1h)；2.56(s,3h)。
[0987]
将浓硫酸(24ml)加入到3
‑
溴
‑4‑
甲基
‑5‑
三氟甲基苯甲酸(2，35.0g，124mmol)在甲醇(500ml)中的溶液中，并将反应混合物在回流下搅拌4小时，在环境温度下搅拌16小时。然后减压蒸发反应混合物，将其溶解于乙醚(250ml)中，用水(2x100ml)和碳酸钾饱和溶液(100ml)与盐水(100ml)的混合物洗涤。分离有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发，得到呈白色固体的3
‑
溴
‑4‑
甲基
‑5‑
三氟甲基苯甲酸甲酯(3)。产量：35.3g(96％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：8.36(d,j＝1.1hz,1h)；8.13(d,j＝1.1hz,1h)；3.90(s,3h)；2.55(d,j＝1.3hz,3h)。
[0988]
将1
‑
溴吡咯烷
‑
2,5
‑
二酮(nbs，31.7g，178mmol)和3
‑
溴
‑4‑
甲基
‑5‑
三氟甲基苯甲酸甲酯(3，35.3g，119mmol)在水(300ml)中的悬浮液在100w灯泡下于80℃搅拌6小时。用乙醚(2x200ml)萃取反应混合物。用盐水(150ml)洗涤有机层。分离有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发，得到呈黄色固体的3
‑
溴
‑4‑
溴甲基
‑5‑
三氟甲基苯甲酸甲酯(4)。产量：44.0g(98％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.47(d,j＝1.5hz,1h)；8.31(d,j＝1.3hz,1h)；4.75(s,2h)；3.98(s,3h)。
[0989]
将3
‑
溴
‑4‑
溴甲基
‑5‑
三氟甲基苯甲酸酯(4，44.0g，117mmol)和乙酸钾(22.9g，234mmol)在乙腈(0.5l)中的溶液在75℃下搅拌过夜。将悬浮液通过滤纸过滤并蒸发。将粗产物溶解于二氯甲烷中，并再次过滤。蒸发得到呈白色固体的3
‑
溴
‑4‑
(乙酰氧基甲基)
‑5‑
(三氟甲基)苯甲酸甲酯(5)。产量：37.9g(91％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.49(d,j＝1.3hz,1h)；8.34(d,j＝1.3hz,1h)；5.37(s,2h)；3.99(s,3h)；2.11(s,3h)。
[0990]
将3
‑
溴
‑4‑
(乙酰氧基甲基)
‑5‑
(三氟甲基)苯甲酸甲酯(5，37.9g，107mmol)、双(频哪醇)二硼(29.8g，117mmol)、乙酸钾(31.4g，294mmol)和[1,1
‑
双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(ii)(1.57g，1.92mmol)在无水四氢呋喃(500ml)中的溶液在氩气气氛下于75℃搅拌13天。然后将反应混合物冷却至环境温度，过滤并蒸发。通过硅胶柱(硅胶，0.063
‑
0.200mm；洗
脱液：环己烷/乙酸乙酯8:1)过滤粗产物，得到4
‑
(乙酰氧基甲基)
‑3‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯甲酸甲酯(6)。产量：31.1g(72％)。rf(sio2，环己烷/乙酸乙酯8:1)：0.40。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.65(s,1h)；8.43(s,1h)；5.48(s,2h)；3.97(s,3h)；2.05(s,3h)；1.36(s,12h)。
[0991]
将4
‑
(乙酰氧基甲基)
‑3‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯甲酸甲酯(6，31.0g，77.1mmol)和氢氧化钠(15.4g，386mmol)在水(300ml)中的溶液在环境温度下搅拌3小时。然后添加盐酸(35ml)的水(100ml)溶液以将ph降低至1。将反应混合物搅拌过夜。将沉淀物过滤并干燥，得到呈白色固体的1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸(7)。产量：16.6g(86％)。
[0992]1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：13.47(bs,1h)；9.66(s,1h)；8.62(s,1h)；8.24(s,1h)；5.22(s,2h)。
[0993]
将五氟苯酚(7.48g，40.7mmol)、1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸(7，10.0mg，40.7mmol)和n,n'
‑
二环己基碳二亚胺(dcc，8.37mg，40.7mmol)在乙腈(0.5l)中的溶液在环境温度下搅拌过夜。将反应混合物过滤，蒸发，溶解于乙腈中，再过滤并蒸发，得到呈白色固体的1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸五氟苯酯(8)。
[0994]
产量：16.7g(100％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.79(s,1h)；8.86(s,1h)；8.46(s,1h)；5.30(s,2h)。
[0995]
将1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸五氟苯酯(8，16.7g，40.6mmol)、(2
‑
氨基乙基)甘氨酸(9，2.40g，20.3mmol)和三乙胺(28.4ml，203mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(0.5l)中的溶液在环境温度下搅拌3天。然后蒸发反应混合物，通过柱色谱法(硅胶，洗脱液：二氯甲烷/甲醇/甲酸100:2:0.5至100:10:0.5)纯化粗产物10，得到呈白色固体的n
‑
(1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
羰基)
‑
n
‑
(2
‑
(1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)乙基)甘氨酸(10)。产量：7.77g(67％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：12.89(bs,1h)；9.68
‑
9.48(m,2h)；9.00
‑
8.67(m,1h)；8.56
‑
7.36(m,4h)；5.27
‑
5.03(m,4h)；4.30
‑
3.95(m,2h)；3.77
‑
3.48(m,4h)。lc
‑
ms:575.5(m h) 。
[0996]
实施例29：(2s)
‑3‑
(2,3
‑
双(1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)丙酰胺基)丙酸＝n
‑
[n
α
,n
β
‑
双
‑
(1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)
‑
l
‑
二氨基丙酰基]
‑
β
‑
丙氨酸
[0997][0998]
将l
‑
二氨基丙酸盐酸盐(别名(2s)
‑
2,3
‑
二氨基丙酸盐酸盐)(1，15.0g，107mmol)、二碳酸二叔丁酯(46.6g，214mmol)和碳酸氢钾(32.0g，320mmol)在乙腈(400ml)与水(400ml)的混合物中的溶液搅拌过夜。减压除去溶剂，并用饱和硫酸氢钾水溶液酸化残余物，直至达到ph 1。反应混合物用乙酸乙酯(3x200ml)萃取，并经无水硫酸钠干燥。减压除去溶剂，得到呈灰白色固体的(2s)
‑
2,3
‑
双((叔丁氧羰基)氨基)丙酸(2)。产量：28.2g(87％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：5.85(bs,1h)；5.17(bs,1h)；4.31(bs,1h)；3.64
‑
3.46(m,2h)；1.46(s,18h)。
[0999]
将(2s)
‑
2,3
‑
双((叔丁氧羰基)氨基)丙酸(2，27.9g，91.7mmol)、3
‑
氨基丙酸叔丁酯(3，16.7g，91.7mmol)、n
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
n
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc.hcl，21.1g，110mmol)、1
‑
羟基
‑7‑
氮杂苯并三唑(hoat，15.0g，110mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(64.0ml，367mmol)在二氯甲烷(300ml)中的溶液搅拌过夜。减压除去溶剂；将残余物溶解于乙酸乙酯(600ml)中，用1m盐酸水溶液(4x300ml)和饱和碳酸氢钠水溶液(4x300ml)洗涤，并经无水硫酸钠干燥。减压除去溶剂，得到呈灰白色固体的(s)
‑3‑
(2,3
‑
双((叔丁氧羰基)氨基)丙酰胺基)丙酸叔丁酯(4)。产量：36.1g(91％)。
[1000]1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：7.01(bs,1h)；5.75(bs,1h)；5.14(bs,1h)；4.15(bs,1h)；3.57
‑
3.39(m,4h)；2.43(t,j＝6.0hz,2h)；1.45(s,27h)。
[1001]
向(s)
‑3‑
(2,3
‑
双((叔丁氧羰基)氨基)丙酰胺基)丙酸叔丁酯(4，36.1g，83.7mmol)在二氯甲烷(50ml)中的溶液中加入95％三氟乙酸水溶液(300ml)，并将溶液搅拌3小时。减压除去溶剂，将残余物与乙腈(3x300ml)共蒸发，并用1m氯化氢在无水乙醚中的溶液(300ml)处理。滤出沉淀物，并与乙腈(2x600ml)一起研磨，得到呈白色粉末的(2s)
‑3‑
(2,3
‑
二氨基丙酰胺基)丙酸二盐酸盐(5)。
[1002]
产量：22.2g(100％)。1h nmr谱(300mhz,d2o,δh)：4.35(t,j＝5.8hz,1h)；3.63
‑
3.46(m,4h)；2.67(t,j＝6.6hz,2h)。
[1003]
将五氟苯酚(35.1g，191mmol)、1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸(1，40.8g，166mmol，如实施例28所述制备)和n,n'
‑
二环己基碳二亚胺(dcc，39.3g，191mmol)在乙腈(1l)中的溶液在环境温度下搅拌24小时。将反应混合物过滤，蒸发，溶解于乙腈中，重新过滤，并蒸发。粗产物在二氯甲烷(1l)中沉淀并过滤，得到呈白色固体的1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸五氟苯酯(6)。产量：52.8g(77％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.79(s,1h)；8.86(s,1h)；8.46
(s,1h)；5.30(s,2h)。
[1004]
向(2s)
‑3‑
(2,3
‑
二氨基丙酰胺基)丙酸二盐酸盐(5，6.41g，24.3mmol)和三乙胺(33.8mmol，243mmol)在水(50ml)中的溶液中加入1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸五氟苯酯(6，20.0g，48.6mmol)在1,4
‑
二氧杂环己烷(100ml)中的溶液，并将溶液搅拌过夜。将反应混合物在乙酸乙酯(300ml)与1m硫酸氢钾水溶液(1500ml)之间分配。用1m硫酸氢钾水溶液(1x300ml)洗涤有机层，减压除去溶剂。残余物用乙醚(2x150ml)研磨并过滤。将固体溶解于70％乙腈水溶液(600ml)中并冷冻干燥，得到呈白色粉末的3
‑
(2(s),3
‑
双(1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)丙酰胺基)丙酸(7)。产量：12.1g(80％)。
[1005]1h nmr谱(300mhz,acod
‑
d4,δh)：8.51(s,1h)；8.47(s,1h)；8.29(s,1h)；8.27(s,1h)；5.28(s,4h)；5.15(t,j＝6.1hz,1h)；4.15
‑
3.99(m,2h)；3.61(t,j＝6.4hz,2h)；2.67(t,j＝6.3hz,2h)。lc
‑
ms:632.0(m h) 。
[1006]
实施例30：(s)
‑3‑
(2,3
‑
双(4
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)丙酰胺基)丙酸
[1007][1008]
将4
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸(1，8.56g，43.7mmol)、n
‑
羟基琥珀酰亚胺(5.03g，43.7mmol)和1
‑
乙基
‑3‑
(3'
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(8.38g，43.7mmol)在四氢呋喃(250ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(20ml)中在环境温度下搅拌3.5小时。蒸发反应混合物，并用乙酸乙酯(3x150ml)和1m盐酸水溶液(150ml)萃取。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到呈白色固体的2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基4
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸酯(2)。产量：10.2g(79％)。lc
‑
ms:294.3(m h) 。
[1009]
让2
‑
氯三苯甲基氯树脂100
‑
200目1.5mmol/g(3，10.5g，15.7mmol)在无水二氯甲烷(80ml)中溶胀30分钟。将3
‑
((((9h
‑
芴
‑9‑
基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸(fmoc
‑
ala
‑
oh，3.26g，10.5mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(6.93ml，39.8mmol)在无水二氯甲烷(50ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇过夜。过滤树脂，并用n,n
‑
二异丙基乙胺(3.65ml，20.9mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(4:1，2x5min，2x80ml)中的溶液处理。然后将树脂用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x80ml)、二氯甲烷(2x80ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(3x80ml)洗涤。通过用在n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1x5min，1x20min，2x80ml)处理去除fmoc基团。树脂用n,n
‑
二甲基甲酰胺(3x80ml)、2
‑
丙醇(2x80ml)和二氯甲烷(3x80ml)洗涤。将(s)
‑
2,3
‑
双
((((9h
‑
芴
‑9‑
基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸(fmoc
‑
dap(fmoc)
‑
oh，8.61g，15.7mmol)、5
‑
氯
‑1‑
((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)
‑
1h
‑
苯并[d][1,2,3]三唑3
‑
氧化物四氟硼酸盐(tctu，5.58g，15.7mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(4.92ml，28.2mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(80ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇2小时。将树脂过滤并用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x80ml)、二氯甲烷(2x80ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x80ml)洗涤。通过用在n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1x5min，1x30min，2x80ml)处理去除fmoc基团。树脂用n,n
‑
二甲基甲酰胺(3x80ml)、2
‑
丙醇(2x80ml)和二氯甲烷(3x80ml)洗涤。将2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸酯(2，9.14g，31.4mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(9.84ml，56.5mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(80ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇1天。将树脂过滤并用n,n
‑
二甲基甲酰胺(4x80ml)和二氯甲烷(10x80ml)洗涤。通过用2,2,2
‑
三氟乙醇(80ml)处理16小时从树脂上切下产物。滤出树脂，并用二氯甲烷(4x80ml)洗涤。蒸发溶剂，并将粗产物(4)用乙酸乙酯(300ml)洗涤，过滤并真空干燥。获得呈灰白色固体的纯产物(4)。产量：4.10g(74％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.57(bs,2h)；8.78
‑
8.49(m,2h)；8.19
‑
7.93(m,3h)；7.71(dd,j＝30.8和10.8hz,2h)；5.12(d,j＝7.7hz,4h)；4.74
‑
4.55(m,1h)；3.72
‑
3.61(m,2h)；3.29
‑
3.15(m,2h)；2.36(t,j＝6.9hz,2h)。lc
‑
ms:532.6(m h) 。
[1010]
实施例31：4
‑
((3r,4r)
‑
3,4
‑
双(7
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)吡咯烷
‑1‑
基)
‑4‑
氧代丁酸
[1011][1012]
将4
‑
((3r,4r)
‑
3,4
‑
二氨基吡咯烷
‑1‑
基)
‑4‑
氧代丁酸二盐酸盐(2，2.46g，12.2mmol)、7
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸五氟苯酯(1，8.86g，24.5mmol)和三乙胺(17.0ml，122mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(300ml)中的溶液在环境温度下搅拌过夜。将反应混合物蒸发并从乙酸乙酯中沉淀，得到6.40g粗化合物3(6.4g)，将其通过hplc(ymc，c18，5m，250x50mm，乙腈/水，30分钟内2:98，180分钟内2:98至30:0)纯化，并冷冻干燥，得到呈白色固体的标题化合物4
‑
((3r,4r)
‑
3,4
‑
双(7
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)吡咯烷
‑1‑
基)
‑4‑
氧代丁酸(3)。产量：1.23g(18％)。
[1013]1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)9.35(bs,2h)；8.68(t,j＝8.4hz,2h)；7.81
‑
7.62(m,2h)；7.30(d,j＝7.3hz,2h)；5.02(s,4h)；4.66
‑
4.45(m,2h)；3.94(dd,j＝10.6和6.7hz,1h)；3.77(dd,j＝12.0和6.7hz,1h)；3.54
‑
3.41(m,1h)；3.27
‑
3.18(m,1h)；2.47
‑
2.34(m,
4h)。lc
‑
ms:558.6(m h) 。
[1014]
实施例32：n
‑
(7
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
羰基)
‑
n
‑
(2
‑
(7
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)乙基)甘氨酸
[1015][1016]
以保持内部温度低于
‑
60℃的速率，将正丁基锂(在己烷中2.38m，107ml，255mmol)插管到搅拌并氮气吹扫的2,2,6,6
‑
四甲基哌啶(43.5ml，257mmol)在无水四氢呋喃(150ml)中的溶液中(约20分钟)。将混合物搅拌60分钟(内部温度升高至
‑
40℃)。将混合物重新冷却至
‑
78℃，并以保持内部温度低于
‑
70℃的速率，通过蠕动泵将2
‑
氟
‑4‑
甲基苄腈(1，30.0g，222mmol)在无水四氢呋喃(200ml)中的溶液逐滴加入到剧烈搅拌的混合物中(约40分钟)。使混合物升温至
‑
50℃，并在该温度下保持45分钟。将混合物重新冷却至
‑
78℃，并在保持内部温度低于
‑
70℃的同时，将碘(62.0g，244mmol)在无水四氢呋喃(150ml)中的溶液(使用蠕动泵)逐滴加入到反应混合物中。用无水四氢呋喃(50ml)洗涤残留的碘，并将混合物在
‑
70℃下搅拌1小时。使搅拌的混合物升温至室温过夜，然后通过倒入搅拌的硫代硫酸钠(20g)的水(750ml)溶液中将其猝灭。将反应混合物搅拌1小时，然后用乙酸乙酯(3x300ml)萃取。合并的有机萃取物经无水硫酸钠干燥，并减压蒸发。通过柱色谱法(硅胶60，0.063
‑
0.200mm；洗脱液：环己烷/乙酸乙酯10:1)纯化残余物，然后将其从甲醇中重结晶，得到呈无色结晶固体的2
‑
氟
‑3‑
碘
‑4‑
甲基苄腈(2)。
[1017]
产量：29.6g(51％)。rf(sio2，环己烷/乙酸乙酯10:1)：0.35。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：7.48(dd,j＝7.9和6.5hz,1h)；7.17
‑
7.12(m,1h),2.56(s,3h)。
[1018]
19
f nmr谱(282mhz,cdcl3,δf)：
‑
82.34(s)。
[1019]
将2
‑
氟
‑3‑
碘
‑4‑
甲基苄腈(2，52.7g，202mmol)在75％硫酸(65ml)中的浆液在150℃下搅拌3小时。冷却至环境温度后，将混合物倒在冰/水混合物(500g)上。滤出沉淀的米色固体，用大量水洗涤并干燥，得到呈米色固体的2
‑
氟
‑3‑
碘
‑4‑
甲基苯甲酸(3)。产量：51.2g(91％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：13.30(s,1h)；7.75(t,j＝7.8hz,1h)；7.27(d,j＝8.0hz,1h)；2.47(s,3h)。
[1020]
在0℃下，将乙酰氯(23.0ml，321mmol)逐滴加入到2
‑
氟
‑3‑
碘
‑4‑
甲基苯甲酸(3，90.0g，321mmol)在无水甲醇(350ml)中的搅拌悬浮液中。将混合物回流过夜。减压除去挥发物，并将残余物吸收在乙酸乙酯(1300ml)中。用饱和碳酸氢钾水溶液(2x1000ml)和盐水(1000ml)洗涤后，有机层经无水硫酸镁干燥并真空蒸发。通过柱色谱法(硅胶60，0.063
‑
0.200mm；洗脱液：环己烷/乙酸乙酯30:1
‑
15:1)纯化残余物，得到呈无色固体的2
‑
氟
‑3‑
碘
‑4‑
甲基苯甲酸甲酯(4)。
[1021]
产量：67.6g(72％)。rf(sio2，环己烷/乙酸乙酯15:1)：0.40。1h nmr谱(300mhz,
cdcl3,δh)：7.80(t,j＝7.7hz,1h)；7.10(d,j＝8.0hz,1h)；3.93(s,3h)；2.52(s,3h)。
[1022]
将2
‑
氟
‑3‑
碘
‑4‑
甲基苯甲酸酯(4，35.0g，119mmol)、双(频哪醇)二硼(5，33.3g，131mmol)、无水乙酸钾(35.0g，357mmol)和[1,1
‑
双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(ii)络合物与二氯甲烷(1.94g，2.38mmol)在无水二甲基亚砜(500ml)中的溶液在氩气气氛下于110℃搅拌一周末。将反应混合物冷却至环境温度，在真空中蒸发溶剂，并将粗产物6用乙酸乙酯(4x500ml)和水(1.0l)萃取。合并有机层，通过celite垫过滤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。通过急骤色谱法(硅胶60，0.063
‑
0.200mm；洗脱液：环己烷/乙酸乙酯9:1)纯化粗产物，得到呈无色固体的2
‑
氟
‑4‑
甲基
‑3‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸甲酯(6)。产量：29.4g(84％)。rf(sio2，环己烷/乙酸乙酯9:1)：0.30。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：7.84(t,j＝8.0hz,1h)；7.00(d,j＝8.1hz,1h)；3.90(s,3h)；2.47(s,3h)；1.39(s,12h)。
[1023]
将2
‑
氟
‑4‑
甲基
‑3‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸甲酯(6，27.5g，93.5mmol)、1
‑
溴吡咯烷
‑
2,5
‑
二酮(nbs，18.3g，103mmol)和2,2
‑
偶氮双(2
‑
甲基丙腈)(aibn，0.77g，4.68mmol)在三氟甲苯(300ml)中的溶液在85℃下搅拌16小时。在真空中蒸发溶剂，并用乙醚(2x150ml)萃取残余物。有机层用水(100ml)和盐水(100ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到呈黄色固体的4
‑
(溴甲基)
‑2‑
氟
‑3‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸甲酯(7)。产量：33.5g(96％)。
[1024]1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：7.93(t,j＝7.8hz,1h)；7.21(d,j＝8.1hz,1h)；4.71(s,2h)；3.91(s,3h)；1.42(s,12h)。
[1025]
将4
‑
(溴甲基)
‑2‑
氟
‑3‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸甲酯(7，33.5g，89.8mmol)和乙酸钾(17.6g，180mmol)在乙腈(1l)中的溶液在75℃下搅拌过夜。将悬浮液通过棉绒过滤并蒸发。将粗产物溶解于二氯甲烷中，并再次过滤。蒸发溶剂，得到呈米色固体的4
‑
(乙酰氧基甲基)
‑2‑
氟
‑3‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸甲酯(8)。产量：30.0g(95％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：7.96(t,j＝7.8hz,1h)；7.24(d,j＝7.9hz,1h)；5.25(s,2h)；3.92(s,3h)；2.11(s,3h)；1.39(s,12h)。
[1026]
将4
‑
(乙酰氧基甲基)
‑2‑
氟
‑3‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸甲酯(8，30.0g，85.2mmol)和氢氧化钠(17.0g，426mmol)在水(250ml)中的溶液在环境温度下搅拌3小时。之后，添加盐酸(35％w/w，45ml)的水(50ml)溶液以将ph降低至1。将反应混合物搅拌16小时。将所得沉淀物过滤并冷冻干燥，得到呈灰白色固体的7
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸(9)。产量：9.76g(58％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：13.17(bs,1h)；9.38(bs,1h)；8.29(d,j＝7.7hz,1h)；7.36(d,j＝11.2hz,1h)；5.02(s,2h)。lc
‑
ms:197.3(m h) 。
[1027]
将2,3,4,5,6
‑
五氟苯酚(9.61g，52.2mmol)、7
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸(9，10.2g，52.2mmol)和n,n'
‑
二环己基碳二亚胺(dcc，10.8g，52.2mmol)在乙腈(300ml)和二氯甲烷(200ml)中的溶液在环境温度下搅拌一周末。将反应混合物过滤并真空蒸发。将残余物溶解于乙腈中，过滤并再次真空蒸发，得到呈米色固体的7
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸五氟苯酯(10)。产量：18.8g(100％)。
[1028]1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.55(bs,1h)；8.32
‑
8.20(m,1h)；7.51(d,j＝
8.1hz,1h)；5.13(s,2h)。
[1029]
将7
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸五氟苯酯(10，9.46g，26.1mmol)、(2
‑
氨基乙基)甘氨酸(11，1.54g，13.1mmol)和三乙胺(14.5ml，105mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(200ml)中的溶液在环境温度下搅拌过夜(16小时)。蒸发反应混合物，并尝试将其溶解于二氯甲烷中以进行tlc。发现粗产物不溶于二氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈。因此，将其从乙酸乙酯(0.5l)中沉淀，并通过离心收集固体。用0.5m盐酸盐溶液(2x50ml)洗涤第一沉淀物(a)，得到第二沉淀物(b)，将其滤出并保持。将滤液冷冻干燥，得到被盐污染的产物12。通过溶解于四氢呋喃中并过滤除去盐。在真空中蒸发剩余的溶液，得到第一批产物12。将沉淀物(b)溶解于乙腈和水(3:1)中，过滤，并将剩余的溶液冷冻干燥。将所得固体溶解于四氢呋喃中，滤出沉淀的盐，在真空中蒸发滤液，得到呈米色固体的第二部分n
‑
(7
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
羰基)
‑
n
‑
(2
‑
(7
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)乙基)甘氨酸(12)。产量：2.09g(34％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.41
‑
9.33(m,2h)；8.42
‑
8.18(m,1h)；7.81
‑
7.64(m,1h)；7.43
‑
7.11(m,3h)；5.07
‑
4.97(m,4h)；4.22(s,1h)；3.98(s,1h)；3.68(t,j＝6.5hz,1h)；3.60
‑
3.40(m,3h)。lc
‑
ms:475.5(m h) 。
[1030]
实施例33：2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基2
‑
((氧代双(3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)
‑
λ6‑
亚硫基)氨基)乙酸酯
[1031][1032]
在氩气下，将2
‑
((氧代双(3
‑
(三氟甲基)苯基)
‑
λ6‑
亚硫基)氨基)乙酸叔丁酯(1，2.05g，4.38mmol)、双(频哪醇)二硼(2.78g，11.0mmol)、(1,5
‑
环辛二烯)(甲氧基)铱(i)二聚体(87.0mg，0.13mmol)和4,4
‑
二叔丁基
‑
2,2
‑
二吡啶基(dtbpy，82.0mg，0.31mmol)溶解于脱气的四氢呋喃(12ml)中。使所得混合物升温至60℃，并在该温度下加热过夜。将混合物蒸发至干；通过急骤柱色谱法(硅胶60，0.040
‑
0.063mm；洗脱液：二氯甲烷/乙酸乙酯10:0至4:1)纯化残余物，得到呈灰白色泡沫的2
‑
((氧代双(3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)
‑
λ6‑
亚硫基)氨基)乙酸叔丁酯(2)。
[1033]
产量：2.92g(93％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.59(s,2h)；8.42(s,2h)；8.21(s,2h)；3.76(s,2h)；1.51(s,9h)；1.36(s,12h)；1.35(s,12h)。
[1034]
19
f nmr谱(282mhz,cdcl3,δf)：
‑
62.55(s)。lc
‑
ms:556.6(m
‑
2x频哪醇 h) ,638.8
(m
‑
频哪醇 h) ,721.0(m h) 。
[1035]
将三氟乙酸(24ml)加入到2
‑
((氧代双(3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)
‑
λ6‑
亚硫基)氨基)乙酸叔丁酯(2，2.91g，4.05mmol)在二氯甲烷(8ml)中的溶液中，并将混合物在室温下搅拌2小时。将混合物在真空中蒸发至干，并将残余物从甲苯(3x20ml)和二氯甲烷(3x20ml)中蒸发。将残余物在二氯甲烷(200ml)与0.5m氢氧化钠水溶液(250ml)之间分配。分离的水相用二氯甲烷(2x100ml)洗涤，用1m盐酸(200ml)酸化，并用乙酸乙酯(3x250ml)萃取。合并的乙酸乙酯萃取物经无水硫酸钠干燥并真空蒸发，得到呈灰白色泡沫的2
‑
((氧代双(3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)
‑
λ6‑
亚硫基)氨基)乙酸(3)。产量：2.30g(86％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.55(s,2h)；8.33(s,2h)；8.29(s,2h)；3.85(s,2h)；1.39(s,24h)。
19
f nmr谱(282mhz,cdcl3,δf)：
‑
62.69(s)。lc
‑
ms:500.5(m
‑
2x频哪醇 h) ,582.6(m
‑
频哪醇 h) ,664.8(m h) 。
[1036]
在氩气下，将无水乙腈(16.2ml)加入到2
‑
((氧代双(3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)
‑
λ6‑
亚硫基)氨基)乙酸(3，2.15g，3.24mmol)和n,n
‑
二琥珀酰亚胺基碳酸酯(dsc，1.25g，4.86mmol)中。添加吡啶(392ml，4.86mmol)，并将混合物超声处理以形成细悬浮液。将所得悬浮液搅拌4小时以得到澄清溶液。添加额外量的n,n
‑
二琥珀酰亚胺基碳酸酯(dsc，415mg，1.62mmol)和吡啶(131ml，1.62mmol)，并将混合物在室温下搅拌过夜。lc/ms分析显示完全转化为活化酯。将混合物蒸发至干，并将残余物在乙酸乙酯(200ml)与0.1m盐酸水溶液(100ml)之间分配。分离各相，有机相用0.1m盐酸水溶液(2x50ml)和盐水(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并蒸发至干。将残余物溶解于二氯甲烷(40ml)中，随后添加频哪醇(383mg，3.24mmol)。蒸发溶液，并将残余物从二氯甲烷(3x40ml)中蒸发。所得泡沫用环己烷(2x50ml)洗涤，再溶解于二氯甲烷(40ml)中，蒸发并真空干燥，得到呈灰白色泡沫的标题化合物(4)。
[1037]
产量：1.82g(74％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.57(s,2h)；8.37(s,2h)；8.24(s,2h)；4.20(s,2h)；2.83(s,4h)；1.36(s,24h)。
19
f nmr谱(282mhz,cdcl3,δf)：
‑
62.66(s)。lc
‑
ms:761.9(m h) 。
[1038]
实施例34：2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
((3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)磺酰基)苯甲酸酯
[1039][1040]
将3
‑
碘苯甲酸甲酯(2，10.5g，40.0mmol)、无水碳酸钾(11.0g，80.0mmol)、碘化铜
(1.52g，8.00mmol)和3
‑
三氟甲基苯硫醇(1，8.22ml，60.0mmol)悬浮在无水1,2
‑
二甲氧基乙烷(100ml)中，并将所得悬浮液在80℃下搅拌48小时。冷却至环境温度后，将反应混合物用环己烷(300ml)稀释，通过顶部具有celite的硅胶垫(125g)过滤(用乙酸乙酯/环己烷1:10，3x200 ml洗涤)，并真空蒸发。将残余物溶解于乙酸(120ml)中，并分批加入30％过氧化氢水溶液(16.0ml，156mmol)(放热)。在80℃(油浴)下搅拌16小时后，将反应混合物在真空中蒸发，吸收于乙酸乙酯(400ml)中，并用水(400ml)和盐水(400ml)洗涤。用无水硫酸钠干燥有机层、过滤并真空蒸发得到呈黄色油状物的甲酯4，对其进行急骤柱色谱法(硅胶300，0.063
‑
0.200mm；洗脱液：环己烷/乙酸乙酯4:1)，得到呈无色油状物的3
‑
((3
‑
(三氟甲基)苯基)磺酰基)苯甲酸甲酯(4)。产量：5.40g(39％)。lc
‑
ms:346.0(m h) 。
[1041]
在氮气下，将3
‑
((3
‑
(三氟甲基)苯基)磺酰基)苯甲酸甲酯(4，5.40g，15.7mmol)、双(频哪醇)二硼(9.97g，39.0mmol)、(1,5
‑
环辛二烯)(甲氧基)铱(i)二聚体(310mg，0.47mmol)和4,4
‑
二叔丁基
‑
2,2
‑
二吡啶基(dtbpy，295mg，1.10mmol)溶解于无水、脱气的四氢呋喃(30ml)中。将反应混合物在50℃(油浴)下搅拌16h。冷却至环境温度后，缓慢加入冰冷的水(30ml)以分解生成的频哪醇硼烷(析出氢气)。30分钟后，加入一水合氢氧化锂(6.59g，157mmol)，并将所得混合物在环境温度下搅拌三小时，然后将其吸收于水(300ml)中，并用二氯甲烷(3x60ml)萃取。弃去二氯甲烷萃取物，用浓盐酸将水层酸化至ph 2。水层用乙酸乙酯(50ml)萃取并丢弃。有机层用盐水(3x50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。将所得微黄色泡沫用频哪醇(118mg，1.00mmol)处理，并溶解于温乙腈(20ml)中。将溶液在冰箱中放置以供结晶过夜。通过过滤收集沉淀的产物，用冷乙腈洗涤并风干，得到呈无色固体的3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
((3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)磺酰基)苯甲酸(5)。产量：5.90g(65％)。lc
‑
ms:582.6(m h) 。
[1042]
将3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
((3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)磺酰基)苯甲酸(5，5.90g，10.1mmol)和双(琥珀酰亚胺基)碳酸酯(3.63g，14.2mmol)悬浮在氮气下的无水乙腈(45ml)和吡啶(1.14ml，14.2mmol)中。将反应混合物加热以实现溶解。搅拌16小时后，在真空中浓缩反应混合物，将残余物吸收在乙酸乙酯(200ml)中，并用盐水(3x200ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并减压浓缩，得到灰白色固体。添加频哪醇(473mg，4.00mmol)，并将混合物在乙腈(30ml)中搅拌1小时。在真空中蒸发乙腈。将所得白色泡沫溶解于己烷(30ml)中，并将溶液在环境温度下结晶过夜，得到呈白色固体的2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
((3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)磺酰基)苯甲酸酯(6)。产量：6.50g(94％)。
[1043]1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.76
‑
8.72(m,2h)；8.67(s,1h)；8.55(s,1h)；8.32(s,1h)；8.27(s,1h)；2.92(s,4h)；1.37(s,12h)与1.37(s,12h)重叠。
[1044]
19
f nmr谱(300mhz,cdcl3,δf)：62.64(s,3h)。lc
‑
ms:680.6(m
‑
h) 。
[1045]
实施例35：n
‑
(1
‑
羟基
‑5‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
羰基)
‑
n
‑
(2
‑
(1
‑
羟基
‑5‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)乙基)甘氨酸
[1046][1047]
将4
‑
甲基
‑2‑
(三氟甲基)苯甲酸(1，25.0g，123mmol)溶解于硫酸(183ml)中，随后添加n
‑
碘代琥珀酰亚胺(33.1g，147mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，然后倒在冰上。当冰完全融化时，用乙酸乙酯(500ml)萃取混合物。有机层用5％硫代硫酸钠水溶液(2x250ml)和水(1x250ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干，得到呈米色粉末的5
‑
碘
‑4‑
甲基
‑2‑
(三氟甲基)苯甲酸(2)。产量：37.7g(93％)。
[1048]1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：13.68(bs,1h)；8.22(s,1h)；7.76(s,1h)；2.47(s,3h)。
[1049]
将5
‑
碘
‑4‑
甲基
‑2‑
(三氟甲基)苯甲酸(2，22.2g，67.2mmol)、原甲酸三甲酯(14.7ml，134mmol)和甲磺酸(2.8ml)在甲醇(135ml)中的混合物在氮气气氛下于80℃回流过夜。蒸发溶剂。将残余物溶解于5％碳酸钠水溶液(200ml)中，并用乙酸乙酯(3x250ml)萃取。合并的有机层用水(1x300ml)和盐水(1x200ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。通过快速急骤柱色谱法(硅胶60，0.040
‑
0.063mm；洗脱液：环己烷/乙酸乙酯9:1)纯化残余物，得到呈白色晶体的5
‑
碘
‑4‑
甲基
‑2‑
(三氟甲基)苯甲酸甲酯(3)。产量：35.9g(91％)。rf(环己烷/乙酸乙酯9:1)：0.50。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.26(s,1h)；7.57(s,1h)；3.93(s,3h)；2.53(s,3h)。
[1050]
将5
‑
碘
‑4‑
甲基
‑2‑
(三氟甲基)苯甲酸甲酯(3，35.9g，104mmol)、n
‑
溴代琥珀酰亚胺(20.4g，114mmol)和2,2
‑
偶氮双(2
‑
甲基丙腈)(aibn，5.12g，31.2mmol)在三氟甲苯(95ml)中的混合物在85℃下搅拌过夜。未实现完全转化，但反应已运行。添加二氯甲烷(150ml)，并将混合物用水(3x100ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残余物溶解于乙腈(440ml)中，并添加乙酸钾(10.2g，104mmol)。将混合物在75℃下搅拌过夜。滤出不溶性物质，并蒸发滤液。通过急骤柱色谱法(硅胶60，0.040
‑
0.063mm；洗脱液：环己烷/二氯甲烷4:1至1:1.5)纯化残余物，得到呈白色粉末的4
‑
(乙酰氧基甲基)
‑5‑
碘
‑2‑
(三氟甲基)苯甲酸甲酯(4)。产量：17.5g(42％)。rf(环己烷/乙酸乙酯9:1)：0.35。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.28(s,1h)；7.70(s,1h)；5.16(s,2h)；3.95(s,3h)；2.20(s,3h)。
19
f nmr谱(282mhz,cdcl3,δf)：
‑
59.96(s)。
[1051]
将4
‑
(乙酰氧基甲基)
‑5‑
碘
‑2‑
(三氟甲基)苯甲酸甲酯(4，17.5g，43.5mmol)、双(频哪醇)二硼(14.3g，56.5mmol)和无水乙酸钾(21.3g，217mmol)在无水n,n
‑
二甲基亚砜(110ml)中的混合物脱气；然后加入[1,1
‑
双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(1.59g，2.17mmol)。将反应混合物在氮气气氛下在95℃下搅拌过夜。冷却后加入乙醚(500ml)，并通过celite垫滤出沉淀物。用5％氯化钠水溶液(3x500ml)洗涤滤液。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到呈黑色油状物的4
‑
(乙酰氧基甲基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑2‑
(三氟甲基)苯甲酸甲酯(5)。该油状物无需进一步纯化即用于下一
步。
[1052]
产量：22.5g。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.22(s,1h)；7.74(s,1h)；5.44(s,2h)；3.94(s,3h)；2.14(s,3h)；1.36(s,12h)。
19
f nmr谱(282mhz,cdcl3,δf)：
‑
60.07(s)。
[1053]
将4
‑
(乙酰氧基甲基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑2‑
(三氟甲基)苯甲酸甲酯(5，17.5g，43.5mmol)悬浮在氢氧化钠(8.70g，217mmol)的水(150ml)溶液中。将混合物在室温下搅拌6小时，然后用乙醚(2x200ml)萃取。水相用浓盐酸(18.9ml)酸化，并将所得混合物在室温下搅拌过夜。将沉淀物过滤，用水洗涤并干燥，得到呈灰色粉末的1
‑
羟基
‑5‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸(6)。产量：7.62g(71％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：13.50(bs,1h)；9.57(s,1h)；8.16(s,1h)；7.92(s,1h)；5.11(s,2h)。
19
f nmr谱(282mhz,dmso
‑
d6,δf)：
‑
57.91(s)。lc
‑
ms:245.9(m
‑
h)
‑
。
[1054]
将1
‑
羟基
‑5‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸(6，6.71g，27.3mmol)溶解于四氢呋喃/二氯甲烷混合物(1:1，50ml)中，随后添加2,3,4,5,6
‑
五氟苯酚(5.03g，27.3mmol)和n
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
n
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(5.23g，27.3mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂。将残余物溶解于乙酸乙酯(150ml)中，并用水(3x100ml)和盐水(1x100ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残余物溶解于乙醚(10ml)中，并添加正己烷(200ml)。滤出沉淀物，并蒸发滤液。对沉淀物重复相同的程序两次。将所有滤液合并在一起并蒸发至干，得到呈黄色硬性油状物的1
‑
羟基
‑5‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸五氟苯酯(7)。产量：9.76g(87％)。
[1055]1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.74(s,1h)；8.53(s,1h)；8.16(s,1h)；5.18(s,2h)。
[1056]
将1
‑
羟基
‑5‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸五氟苯酯(7，9.51g，23.1mmol)溶解于n,n
‑
二甲基甲酰胺(30ml)中。随后加入n,n
‑
二异丙基乙胺(10.1ml，57.7mmol)和(2
‑
氨基乙基)甘氨酸盐酸盐(8，1.78g，11.5mmol)的水(30ml)溶液。将所得混合物在室温下搅拌过夜。然后蒸发溶剂。将残余物溶解于乙酸乙酯(200ml)中，并用1m盐酸水溶液(1x200ml)、水(2x200ml)和盐水(1x150ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。用环己烷处理残余物。过滤沉淀物，用环己烷洗涤，并通过急骤柱色谱法(硅胶60，0.040
‑
0.063mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇/甲酸10:1:0.05)纯化。合并含有产物的级分并蒸发。用环己烷处理残余物。过滤沉淀物，用环己烷洗涤，溶解于乙腈(50ml)中并冷冻干燥，得到呈米色粉末的标题化合物(9)。产量：3.63g(55％)。
[1057]1h nmr谱(300mhz,acod
‑
d4,80c,δh)：8.04
‑
7.66(m,4h)；5.28
‑
5.04(m,4h)；4.63
‑
4.34(m,1h)；4.22
‑
3.78(m,3h)；3.72
‑
3.49(m,2h)。lc
‑
ms:574.0(m h) 。
[1058]
实施例36：n
‑
(4
‑
氯
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
羰基)
‑
n
‑
(2
‑
(4
‑
氯
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)乙基)甘氨酸
[1059][1060]
将n
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
n
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc.hcl，6.20g，23.1mmol)添加至4
‑
氯
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸(1，4.90g，23.1mmol)和五氟苯酚(pfp
‑
oh，5.53g，23.1mmol)在二氯甲烷(70ml)中的悬浮液中，并将混合物在室温下搅拌过夜。将溶剂蒸发至干。将残余物在乙酸乙酯(200ml)与10％硫酸氢钾水溶液(200ml)之间分配。分离有机层，并用水(2x100ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并真空蒸发。将残余物溶解于二氯甲烷中，并放置在冰箱中过夜。滤出固体，并用乙酸乙酯(2x20ml)洗涤。合并滤液并蒸发至干。向残余物中加入环己烷(100ml)，并将混合物在室温下搅拌15分钟。倾析混合物，并在真空中干燥沉积物，得到灰白色固体的4
‑
氯
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸五氟苯酯(2)。产量：8.29g(95％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.83(bs,1h)；8.61(s,1h)；8.26(s,1h)；5.13(s,2h)。lc
‑
ms:377.4(m
‑
h)
‑
。
[1061]
将三乙胺(10.0ml，131.6mmol)添加到1
‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸五氟苯酯(2，8.29g，21.9mmol)和n
‑2‑
氨基乙基甘氨酸(3，1.30g，1.70mmol)在溶液n,n
‑
二甲基甲酰胺/水(2:1，60ml)中的混合物中，并将所得溶液在室温下搅拌过夜。之后，将其用1m硫酸氢钾水溶液(200ml)酸化并用乙酸乙酯(3x250ml)萃取。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将残余物与甲苯(3x100ml)共蒸馏，并与乙醚(60ml)一起研磨。过滤沉淀物，用乙醚(2x50ml)洗涤并风干。将获得的粉末溶解于乙腈/水混合物(2:1，20ml)中并冷冻干燥，得到呈无色固体的化合物4。产量：1.50g(15％)。1hnmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：12.87(bs,1h)；9.59
‑
9.41(m,2h)；8.77
‑
8.54(m,5h)；5.07
‑
4.88(m,4h)；4.25
‑
3.92(m,2h)；3.60
‑
3.24(m,4h)。lc
‑
ms:507.3(m h) 。
[1062]
实施例37：(s)
‑4‑
((2s)
‑
2,3
‑
双(1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)丙酰胺基)
‑5‑
(叔丁氧基)
‑5‑
氧代戊酸
[1063][1064]
将五氟苯酚(35.1g，191mmol)、1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸(1，40.8g，166mmol)和n,n'
‑
二环己基碳二亚胺(dcc，39.3g，191mmol)在乙腈(1l)中的溶液在环境温度下搅拌24小时。将反应混合物过滤，蒸发，溶解于乙腈中，重新过滤，并蒸发。粗产物在二氯甲烷(1l)中沉淀并过滤，得到呈白色固体的1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸五氟苯酯(2)。产量：52.8g(77％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.79(s,1h)；8.86(s,1h)；8.46(s,1h)；5.30(s,2h)。
[1065]
让2
‑
氯三苯甲基氯树脂100
‑
200目1.5mmol/g(3，4.47g，6.71mmol)在无水二氯甲烷(30ml)中溶胀30分钟。将(2s)
‑5‑
(叔丁氧基)
‑2‑
{[(9h
‑
芴
‑9‑
基甲氧基)羰基]氨基}
‑5‑
氧代戊酸(fmoc
‑
glu
‑
otbu，1.90g，4.47mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(2.96ml，17.0mmol)在无水二氯甲烷(30ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇过夜。过滤树脂，并用n,n
‑
二异丙基乙胺(1.56ml，8.95mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(4:1，2x5min，2x40ml)中的溶液处理。然后将树脂用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x30ml)、二氯甲烷(2x40ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(3x40ml)洗涤。通过用在n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1x5min，1x20min，2x40ml)处理去除fmoc基团。树脂用n,n
‑
二甲基甲酰胺(3x40ml)、2
‑
丙醇(2x40ml)和二氯甲烷(3x40ml)洗涤。将(2s)
‑
2,3
‑
双((((9h
‑
芴
‑9‑
基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸(fmoc
‑
dap(fmoc)
‑
oh，3.68g，6.71mmol)、1
‑
[双(二甲基氨基)亚甲基]
‑
1h
‑
1,2,3
‑
三唑并[4,5
‑
b]吡啶鎓3
‑
氧化物六氟磷酸盐(hatu，2.55g，6.71mmol)和2,4,6
‑
三甲基吡啶(1.60ml，12.1mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(40ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇2小时。将树脂过滤并用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x40ml)、二氯甲烷(2x40ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x40ml)洗涤。通过用在n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1x5min，1x30min，2x40ml)处理去除fmoc基团。树脂用n,n
‑
二甲基甲酰胺(3x40ml)、2
‑
丙醇(2x40ml)和二氯甲烷(3x40ml)洗涤。将1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸五氟苯酯(2，5.53g，13.4mmol)和三乙胺(4.99ml，35.8mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(40ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇过夜。将树脂过滤并用n,n
‑
二甲基甲酰胺(6x40ml)和二氯甲烷(10x50ml)洗涤。通过用2,2,2
‑
三氟乙醇(60ml)处理16小时从树脂上切下产物。滤出树脂，并用二氯甲烷(4x50ml)洗涤。将粗产物(4)真空干燥，并用乙酸乙酯(2x70ml)和1m硫酸氢钾水溶液(50ml)萃取，有机相经无
水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发溶剂。然后将粗产物在乙醚(20ml)中研磨，得到呈米色固体的(s)
‑4‑
((2s)
‑
2,3
‑
双(1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)丙酰胺基)
‑5‑
(叔丁氧基)
‑5‑
氧代戊酸(4)。产量：1.89g(57％)。1h nmr谱(300mhz,acod
‑
d4,δh)：8.50(s,1h)；8.46(s,1h)；8.29(s,1h)；8.26(s,1h)；5.28(d,j＝2.6hz,4h)；5.20(t,j＝5.9hz,1h)；4.55(dd,j＝8.5和5.2hz,1h)；4.08(dd,j＝6.0和2.1hz,2h)；2.57
‑
2.42(m,2h)；2.34
‑
2.16(m,1h)；2.17
‑
2.08(m,1h)；1.47(s,9h)。lc
‑
ms:746.3(m h) 。
[1066]
实施例38：n
‑
(4
‑
(二氟甲基)
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
羰基)
‑
n
‑
(2
‑
(4
‑
(二氟甲基)
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)乙基)甘氨酸
[1067][1068]
将浓硫酸(35ml)加入到3
‑
溴
‑5‑
碘
‑4‑
甲基苯甲酸(1，55.4g，162mmol)在甲醇(1.2l)中的溶液中，并将反应混合物在回流下搅拌过夜。然后减压蒸发反应混合物，将其溶解于乙醚(700ml)中，用水(2x300ml)和饱和碳酸钾溶液(1x300ml)洗涤。分离有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发，得到呈白色固体的3
‑
溴
‑5‑
碘
‑4‑
甲基苯甲酸甲酯(2)。产量：50.0g(87％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：8.32(d,j＝1.7hz,1h)；8.09(d,j＝1.3hz,1h)；3.86(s,3h)；2.65(s,3h)。
[1069]
在惰性气氛和
‑
30℃下，向3
‑
溴
‑5‑
碘
‑4‑
甲基苯甲酸甲酯(2，37.3g，105mmol)在无水四氢呋喃(250ml)中的溶液中逐滴加入异丙基氯化镁氯化锂络合物在四氢呋喃中的1.3m溶液(89.0ml，115mmol)，并搅拌20分钟。然后在
‑
30℃下添加n,n
‑
二甲基甲酰胺(12.2ml，158mmol)。让反应混合物升温至环境温度并搅拌16小时。然后将反应混合物减压蒸发，溶解于乙酸乙酯(300ml)中，并用水(2x200ml)洗涤。分离有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发，得到呈白色固体的3
‑
溴
‑5‑
甲酰基
‑4‑
甲基苯甲酸甲酯(3)。产量：24.9g(92％)。
[1070]1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：10.27(s,1h)；8.53
‑
8.34(m,2h)；3.97(s,3h)；2.82(s,3h)。
[1071]
将3
‑
溴
‑5‑
甲酰基
‑4‑
甲基苯甲酸甲酯(3，24.8g，96.5mmol)和(二乙基氨基)三氟化硫(dast，25.5ml，193mmol)在二氯甲烷(300ml)中的溶液在环境温度下搅拌16小时。通过加水(200ml)猝灭反应，并用二氯甲烷(2x200ml)萃取。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发，得到呈白色固体的3
‑
溴
‑5‑
(二氟甲基)
‑4‑
甲基苯甲酸甲酯(4)。产量：23.3g(87％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.35(d,j＝1.1hz,1h)；8.14(d,j＝0.9hz,1h)；6.78(t,j＝54.8hz,1h)；3.93(s,3h)；2.55(t,j＝1.4hz,3h)。
[1072]
将n
‑
溴代琥珀酰亚胺(16.4g，91.9mmol)、3
‑
溴
‑5‑
(二氟甲基)
‑4‑
甲基苯甲酸甲酯(4，23.3g，83.5mmol)和2,2
‑
偶氮双(2
‑
甲基丙腈)(aibn，1.36g，8.36mmol)在α,α,α
‑
三氟甲苯(120ml)中的溶液在85℃下搅拌过夜。将反应混合物蒸发，然后用乙醚(2x300ml)萃取。用盐水(1x150ml)洗涤有机层。分离有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到粗品3
‑
溴
‑4‑
(溴甲基)
‑5‑
(二氟甲基)苯甲酸甲酯(5)，将其与乙酸钾(16.4g，167mmol)一起在乙腈(300ml)中75℃搅拌过夜。将悬浮液通过celite短垫过滤并蒸发。将粗产物溶解于二氯甲烷中，并再次过滤。将滤液蒸发，并通过柱色谱法(硅胶60，0.063
‑
0.200mm；洗脱液：环己烷/乙酸乙酯9:1)纯化，得到呈白色固体的4
‑
(乙酰氧基甲基)
‑3‑
溴
‑5‑
(二氟甲基)苯甲酸甲酯(6)。产量：17.1g(61％)。rf(sio2，己烷/乙酸乙酯9:1)：0.50。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.40(s,1h)；8.26(s,1h)；7.02(t,j＝54.7hz,1h)；5.38(s,2h)；3.97(s,3h)；2.11(s,3h)。
[1073]
将4
‑
(乙酰氧基甲基)
‑3‑
溴
‑5‑
(二氟甲基)苯甲酸甲酯(6，17.1g，50.7mmol)、双(频哪醇)二硼(14.2g，55.7mmol)、乙酸钾(14.9g，152mmol)和[1,1
‑
双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(ii)(1.24g，1.52mmol)在无水二氧杂环己烷(200ml)中的溶液在氩气气氛下于75℃搅拌2天。然后将反应混合物冷却至环境温度，过滤并蒸发。通过硅胶柱(硅胶，0.063
‑
0.200mm；洗脱液：环己烷/乙酸乙酯9:1)过滤粗产物，得到4
‑
(乙酰氧基甲基)
‑3‑
(二氟甲基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸甲酯(7)。产量：16.3g(84％)。rf(sio2，环己烷/乙酸乙酯9:1)：0.30。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.57(s,1h)；8.38(s,1h)；7.04(t,j＝55.1hz,1h)；5.54(s,2h)；3.97(s,3h)；2.06(s,3h)；1.39(s,12h)。
[1074]
将4
‑
(乙酰氧基甲基)
‑3‑
(二氟甲基)
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸甲酯(7，16.3g，42.3mmol)和氢氧化钠(8.45g，212mmol)在水(200ml)中的溶液在环境温度下搅拌3小时。然后添加浓盐酸(20ml)的水(50ml)溶液以将ph降低至1。将反应混合物在冰箱中放置过夜。将沉淀物过滤并干燥，得到呈白色固体的4
‑
(二氟甲基)
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸(8)。产量：8.55g(89％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：13.25(bs,1h)；9.54(s,1h)；8.51(s,1h)；8.20(s,1h)；7.22(t,j＝55.1hz,1h)；5.19(s,2h)。
[1075]
将五氟苯酚(8.28g，45.0mmol)、4
‑
(二氟甲基)
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸(8，8.55g，37.5mmol)和n
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
n
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc.hcl，10.1g，52.5mmol)在二氯甲烷(100ml)中的溶液在环境温度下搅拌3小时。然后将反应混合物蒸发，溶解于乙酸乙酯(200ml)中，并用1m盐酸水溶液(3x200ml)和盐水(1x200ml)洗涤。分离有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将粗产物9从热环己烷(300ml)和乙酸乙酯(30ml)中重结晶，得到呈白色固体的4
‑
(二氟甲基)
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸五氟苯酯(9)。产量：8.20g(56％)。lc
‑
ms:395.5(m h) 。
[1076]
将4
‑
(二氟甲基)
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸五氟苯酯(9，8.20g，20.8mmol)、(2
‑
氨基乙基)甘氨酸(10，1.23g，10.4mmol)和三乙胺(14.5ml，104mmol)在四氢呋喃(40ml)和水(20ml)中的溶液在环境温度下搅拌过夜。然后蒸发四氢呋喃，并向残余物中加入1m硫酸氢钾水溶液(30ml)。用乙酸乙酯(2x100ml)萃取该混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将粗产物11溶解于乙酸乙酯(10ml)中，并用环己烷(100ml)沉淀。过滤沉淀物，用环己烷(50ml)洗涤并冷冻干燥，得到呈白色固体的n
‑
(4
‑
(二氟甲基)
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
羰基)
‑
n
‑
(2
‑
(4
‑
(二氟甲基)
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)乙基)甘氨酸(11)。产量：4.59g(82％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：12.87(bs,1h)；9.66
‑
9.33(m,2h)；8.95
‑
6.68(m,7h)；5.15(d,j＝11.9hz,4h)；4.39
‑
3.94(m,2h)；3.76
‑
3.37(m,4h)。lc
‑
ms:539.1(m h) 。
[1077]
实施例39：1
‑
(叔丁基)
‑5‑
(2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基)
‑
(2
‑
((氧代双(3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)
‑
λ6‑
亚硫基)氨基)乙酰基)
‑
l
‑
谷氨酸酯
[1078][1079]
随后将无水二氯甲烷(37ml)和三乙胺(1.53ml，11.0mmol)添加到在实施例33中制备的2,5
‑
二氧代吡咯烷
‑1‑
基
‑2‑
((氧代双(3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)
‑
λ6‑
亚硫基)氨基)乙酸酯(1，2.78g，3.66mmol)和(s)
‑4‑
氨基
‑5‑
(叔丁氧基)
‑5‑
氧代戊酸(2，h
‑
glu
‑
otbu，891mg，4.39mmol)中。将混合物超声处理以得到溶液，将该溶液在室温下搅拌6小时。真空除去挥发物，并将残余物重新溶解于乙酸乙酯(200ml)中。所得溶液用0.5m盐酸水溶液(3x50ml)和盐水(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并蒸发至干。将残余物重新溶解于乙酸乙酯(50ml)中，并添加频哪醇(432mg，3.66mmol)在乙酸乙酯(20ml)中的溶液。真空蒸发所得溶液，得到呈淡黄色泡沫的(s)
‑5‑
(叔丁氧基)
‑5‑
氧代
‑4‑
(2
‑
((氧代双(3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)
‑
λ6‑
亚硫基)氨基)乙酰胺基)戊酸(3)。产量：3.07g(99％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.57(d,j＝12.7hz,2h)；8.40(dd,j＝8.3和0.7hz,2h)；8.25(s,2h)；7.96(d,j＝8.1hz,1h)；4.57(m,1h)；3.71(dd,j＝22.9和17.4hz,2h)；2.53
‑
2.43(m,2h)；2.37
‑
2.24(m,1h)；2.15
‑
2.02(m,1h)；1.47(s,9h)；1.37(s,24h)。
19
fnmr谱(282mhz,cdcl3,δf)：
‑
62.64(s)。lc
‑
ms:683.4(m
‑
2x频哪醇
‑
h)
‑
。
[1080]
随后将n,n
‑
二琥珀酰亚胺基碳酸酯(dsc，1.84g，7.19mmol)和吡啶(0.58ml，7.19mmol)加入到(s)
‑5‑
(叔丁氧基)
‑5‑
氧代
‑4‑
(2
‑
((氧代双(3
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑5‑
(三氟甲基)苯基)
‑
λ6‑
亚硫基)氨基)乙酰胺基)戊酸(3，3.05g，
3.59mmol)在无水乙腈(18ml)中的溶液中，然后将混合物超声处理以形成细悬浮液。将所得悬浮液在室温下搅拌过夜以得到澄清溶液。将溶液蒸发至干，并将残余物在乙酸乙酯(250ml)与0.5m盐酸水溶液(100ml)之间分配。分离各相；有机相用0.5m盐酸水溶液(4x100ml)和盐水(70ml)洗涤；经无水硫酸钠干燥并蒸发至干。将残余物溶解于二氯甲烷(40ml)中，随后添加频哪醇(636mg，5.39mmol)。真空除去溶剂，并将残余物从二氯甲烷(50ml)中蒸发。将所得泡沫与环己烷(3x50ml)一起研磨；倾析所得半固体，溶解于二氯甲烷(50ml)中，并真空蒸发至干。将残余物从二氯甲烷(3x50ml)中蒸发并真空干燥，得到呈白色泡沫的标题化合物(4)。产量：2.82g(83％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.57(s,1h)；8.51(s,1h)；8.43(s,1h)；8.31(s,1h)；8.25(s,1h)；8.24(s,1h)；7.77(d,j＝7.9hz,1h)；4.60(m,1h)；3.73(dd,j＝39.6和17.3hz,2h)；2.82(s,4h)；2.79
‑
2.62(m,2h)；2.43
‑
2.30(m,1h)；2.20
‑
2.06(m,1h)；1.49(s,9h)；1.36(s,24h)。
[1081]
19
f nmr谱(282mhz,cdcl3,δf)：
‑
62.63(s)。lc
‑
ms:864.5(m
‑
频哪醇 h) ,946.7(m h) 。
[1082]
实施例40：(s)
‑5‑
(叔丁氧基)
‑4‑
(2
‑
(1
‑
羟基
‑
n
‑
(2
‑
(1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)乙基)
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)乙酰胺基)
‑5‑
氧代戊酸
[1083][1084]
让2
‑
氯三苯甲基氯树脂100
‑
200目1.5mmol/g(1，4.39g，6.59mmol)在无水二氯甲烷(30ml)中溶胀30分钟。将(s)
‑2‑
(9h
‑
芴
‑9‑
基甲氧羰基氨基)戊二酸1
‑
叔丁酯(fmoc
‑
glu
‑
otbu，1.87g，4.39mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(2.91ml，16.7mmol)在无水二氯甲烷(30ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇过夜。过滤树脂，并用n,n
‑
二异丙基乙胺(1.53ml，8.78mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(4:1，2x5min，2x40ml)中的溶液处理。然后将树脂用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x30ml)、二氯甲烷(2x40ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(3x40ml)洗涤。通过用在n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1x5min，1x20min，2x40ml)处理去除fmoc基团。树脂用n,n
‑
二甲基甲酰胺(3x40ml)、2
‑
丙醇(2x40ml)和二氯甲烷(3x40ml)洗涤。将n
‑
(((9h
‑
芴
‑9‑
基)甲氧基)羰基)
‑
n
‑
(2
‑
((((9h
‑
芴
‑9‑
基)甲氧基)羰基)氨基)乙基)甘氨酸(fmoc
‑
aeg(fmoc)
‑
oh，3.71g，6.59mmol)、1
‑
((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)
‑
1h
‑
[1,2,3]三唑并[4,5
‑
b]吡啶3
‑
氧化物六氟磷酸盐(hatu，2.50g，6.59mmol)和2,4,6
‑
三甲基吡啶(1.57ml，11.9mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(40ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇2小时。将树脂过滤并用n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x40ml)、二氯甲烷(2x40ml)和n,n
‑
二甲基甲酰胺(2x40ml)洗涤。通过用在n,n
‑
二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1x5min，1x30min，2x40ml)处理去除fmoc
基团。树脂用n,n
‑
二甲基甲酰胺(3x40ml)、2
‑
丙醇(2x40ml)和二氯甲烷(3x40ml)洗涤。将1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸五氟苯酯(2，5.43g，13.2mmol)和三乙胺(4.90ml，35.1mmol)在n,n
‑
二甲基甲酰胺(40ml)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇过夜。将树脂过滤并用n,n
‑
二甲基甲酰胺(6x40ml)和二氯甲烷(10x50ml)洗涤。通过用2,2,2
‑
三氟乙醇(60ml)处理16小时从树脂上切下产物。滤出树脂，并用二氯甲烷(4x50ml)洗涤。蒸发溶剂；残余物用1m硫酸氢钾水溶液(50ml)和乙酸乙酯(2x70ml)萃取，有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发溶剂。将粗产物从乙酸乙酯/环己烷(1:10，40ml)中沉淀，通过柱色谱法(硅胶60，0.063
‑
0.200mm；洗脱液：乙腈/水10:1)纯化，并冷冻干燥，得到呈白色固体的(s)
‑5‑
(叔丁氧基)
‑4‑
(2
‑
(1
‑
羟基
‑
n
‑
(2
‑
(1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)乙基)
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酰胺基)乙酰胺基)
‑5‑
氧代戊酸(3)。产量：1.50g(45％)。1h nmr谱(300mhz,acod
‑
d4,δh)：8.44(s,1h)；8.24(s,1h)；8.05(s,1h)；7.77(s,1h)；5.25(d,j＝17.1hz,4h)；4.70
‑
4.25(m,3h)；4.03
‑
3.67(m,4h)；2.49(bs,2h)；2.22(bs,1h)；1.49(s,9h)。
[1085]
lc
‑
ms:760.3(m h) 。
[1086]
实施例41：1
‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸
[1087][1088]
将n
‑
溴代琥珀酰亚胺(nbs，88.1g，495mmol)加入到4
‑
甲基苄腈(58.6g，500mmol)在50％硫酸水溶液(270ml)中的冷悬浮液(10℃)中。将反应混合物在黑暗中于10℃搅拌40小时。过滤悬浮液后，滤饼用水(100ml)洗涤并溶解于乙酸乙酯(800ml)中。将粗产物在乙酸乙酯中的溶液用水(400ml)、饱和碳酸氢钠水溶液(2x400ml)和盐水(200ml)洗涤。有机溶液经无水硫酸镁干燥并蒸发至干，得到黄色晶体的粗品3
‑
溴
‑4‑
甲基苄腈。该产物无需纯化即用于下一步。产量：90.70g(92％)。rf(sio2，己烷/乙酸乙酯9:1)：0.45。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：7.82(d,j＝1.5hz,1h)；7.50(dd,j＝7.9和1.7hz,1h)；7.34(d,j＝7.9,1h)；2.47(s,3h)。
[1089]
将过氧化苯甲酰(1g)和n
‑
溴代琥珀酰亚胺(nbs，96.3g，541mmol)加入到3
‑
溴
‑4‑
甲基苄腈(90.7g，463mmol)在四氯甲烷(1.00l)中的溶液中。将混合物回流过夜。之后将反应混合物冷却，用二氯甲烷(500ml)稀释，并用水(2x500ml)萃取。有机溶液经无水硫酸镁干燥并蒸发至干，得到呈棕色油状物的粗品3
‑
溴
‑4‑
(溴甲基)苄腈。产量：135g。rf(sio2，己烷/乙酸乙酯9:1)：0.45。
[1090]
将乙酸钾(98.1g，1.00mol)加入到上述粗品3
‑
溴
‑4‑
(溴甲基)苄腈(135g)在乙腈(700ml)中的冷(4℃)溶液中。将混合物在70℃下搅拌24小时。蒸发混合物，并将残余物用乙酸乙酯(800ml)稀释并用水(2x500ml)萃取。有机相经硫酸镁干燥并蒸发至干。通过急骤柱色谱法(硅胶60，0.040
‑
0.060mm；洗脱液：己烷/乙酸乙酯20:1至5:1)纯化残余物，得到呈白色晶体的2
‑
溴
‑4‑
氰基苄基乙酸酯。产量：60.90g(两步52％)。rf(sio2，己烷/乙酸乙酯4:1)：.0.30。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：7.87(d,j＝1.5hz,1h)；7.64(dd,j＝8.1和1.7hz,
1h)；7.53(d,j＝8.1hz,1h)；5.22(s,2h)；2.19(s,3h)。
[1091]
在氩气气氛下，将2
‑
溴
‑4‑
氰基苄基乙酸酯(60.0g，236mmol)、乙酸钾(46.3g，472mmol)、双(频哪醇)二硼(65.9g，259mmol)和[1,1
‑
双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(ii)络合物与二氯甲烷(5g)溶解于脱气的1,4
‑
二氧杂环己烷(800ml)中，并将混合物回流18小时。之后将混合物过滤，并蒸发滤液，并将残余物重新溶解于乙酸乙酯(800ml)中。该溶液用水(2x400ml)和盐水(400ml)洗涤。有机相经硫酸镁干燥并蒸发至干。通过柱色谱法(硅胶60，0.040
‑
0.060mm；洗脱液：己烷/乙酸乙酯8:1)纯化残余物，得到4
‑
氰基
‑2‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苄基乙酸酯白色晶体。产量：48.80g(69％)。rf(sio2，己烷/乙酸乙酯4:1)：0.35。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：8.13(d,j＝1.7hz,1h)；7.71(dd,j＝7.9和1.9hz,1h)；7.49(d,j＝8.1hz,1h)；5.42(s,2h)；2.13(s,3h)。
[1092]
在30℃下，将氢氧化钠(13.1g，327mmol)在甲醇(300ml)中的溶液逐滴加入到4
‑
氰基
‑2‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苄基乙酸酯(44.8g，149mmol)在甲醇(300ml)中的溶液中。将反应混合物再搅拌2小时。蒸发溶剂，并将残余物溶解于四氢呋喃(200ml)中。添加2m盐酸水溶液(660ml)，并将所得悬浮液搅拌10分钟。将悬浮液冷却至10℃并过滤。滤饼用水(100ml)和正己烷(100ml)洗涤，得到呈白色粉末的1
‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲腈。产量：20.15g(85％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：9.55(bs,1h)；8.09(s,1h)；7.90(d,j＝8.1hz,1h)；7.63(d,j＝7.9hz,1h)；5.07(s,2h)。
[1093]
将1
‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲腈(20.15g，127mmol)在浓盐酸(1.50l)中的悬浮液回流24小时，并冷却至10℃。将悬浮液过滤，并用水(300ml)洗涤滤饼。将滤饼悬浮在水(500ml)中并冷冻干燥。将残余物悬浮在二氯甲烷(500ml)中并过滤。滤饼用二氯甲烷(200ml)洗涤真空干燥，得到呈白色粉末的1
‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸。产量：12.30g(55％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：12.92(s,1h)；9.36(s,1h)；8.37(s,1h)；8.04(dd,j＝7.9和0.9hz,1h)；7.52(d,j＝8.1hz,1h)；5.05(s,2h)。lc
‑
ms m/z:178.2(m h)。
[1094]
实施例42：1
‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸
[1095][1096]1‑
羟基
‑4‑
(三氟甲基)
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸如实施例28所述制备。
[1097]
实施例43：4
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸
[1098][1099]
通过外部冰水浴冷却强烈搅拌的3
‑
氟
‑4‑
甲基苯甲酸(1，61.7g，400mmol)在硫酸(96％，400ml)中的溶液，并在20分钟内分三批加入和n
‑
溴代琥珀酰亚胺(72.0g，405mmol)。将混合物在室温下搅拌4小时，然后立即加入另一份n
‑
溴代琥珀酰亚胺(72.0g，405mmol)，并将整个混合物在室温下搅拌过夜。将所得悬浮液用冰水(3.00l)稀释并搅拌10分钟。滤出固体，用水(200ml)洗涤，与水(3x600ml)一起研磨，并尽可能多地吸出。将湿固体悬浮在水(400ml)中，在室温下搅拌，并加入氢氧化钠溶液(50.0g，在200ml水中1.25mol)。将所得溶液加热至40℃过夜。过滤略微混浊的溶液得到澄清的微黄色滤液，向其中加入硫酸氢钾溶液(180g，在400ml水中1.32mol)。将白色沉淀物用二氯甲烷/四氢呋喃4:1混合物(2x500ml)萃取。有机萃取物经无水硫酸钠干燥并蒸发至干，得到白色固体残余物。将亚硫酰氯(30.0ml，413mmol)加入到该残余物在无水甲醇(500ml)中的搅拌冷却(
‑
78℃)悬浮液中。让反应混合物升温至室温，然后加热至60℃过夜。将溶液冷却至室温并保持4℃过夜。滤出结晶物质，用甲醇(2x50ml)、叔丁基甲基醚(2x50ml)洗涤并真空干燥，得到呈无色晶体的2,3
‑
二溴
‑5‑
氟
‑4‑
甲基苯甲酸甲酯(2)。产量：78.2g(60％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：7.37(d,j＝9.0hz,1h)；3.94(s,3h)；2.46(d,j＝2.3hz,3h)。lc
‑
ms m/z:327.2(m h) 。
[1100]
将铜细粉(44.0g，692mmol)和2,3
‑
二溴
‑5‑
氟
‑4‑
甲基苯甲酸甲酯(2，75.2g，231mmol)在丙酸(100ml)中的悬浮液在85
‑
90℃下搅拌并加热6小时，冷却至室温，并用环己烷/甲苯的混合物(3:1，800ml)稀释。反应混合物用水(3x200ml)、10％硫酸氢钾水溶液(2x200ml)和盐水(2x300ml)洗涤。有机溶液经无水硫酸钠干燥并蒸发至干，得到微黄色油状物，将其通过急骤柱色谱法(硅胶60，0.040
‑
0.060mm；洗脱液：环己烷/甲苯3:1)纯化，得到呈无色晶体的3
‑
溴
‑5‑
氟
‑4‑
甲基苯甲酸甲酯(3)。产量：52.5g(92％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,δh)：7.51(s,1h)；7.37(d,j＝9.0hz,1h)；3.86(s,3h)；2.37(d,j＝2.4hz,3h)。lc
‑
ms m/z:347.3(m h) 。
[1101]
将3
‑
溴
‑5‑
氟
‑4‑
甲基苯甲酸甲酯(3，51.9g，210mmol)溶解于无水1,4
‑
二氧杂环己烷(400ml)中，在室温下加入无水乙酸钾(65.3g，666mmol)和双(频哪醇)二硼(4，75.1g，296mmol)，并将该混合物脱气。添加1,1
‑
双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(ii)(1.88g，2.57mmol)，并将混合物在氩气气氛中加热至75℃保持40小时。将混合物减压浓缩，溶解于甲苯(1.1l)中并用水(2x200ml)萃取。将有机溶液使用无水硫酸钠进行干燥，减压蒸发，然后通过急骤柱色谱法(硅胶60，0.040
‑
0.063mm；洗脱液：甲苯/乙酸乙酯9:1)纯化，得到呈白色固体的3
‑
氟
‑4‑
甲基
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸甲酯(5)。产量：50.0g(81％)。1h nmr谱(300mhz,cdcl3,dh)：8.20(s,1h)；7.70(d,j＝10.0hz,1h)；3.85(s,3h)；2.50(s,3h)；1.36(s,12h)。lc
‑
ms m/z:295.4(m h) 。
[1102]
将偶氮二异丁腈(aibn，0.86g，5.20mmol)和n
‑
溴代琥珀酰亚胺(mbs，25.4g，143mmol)添加到3
‑
氟
‑4‑
甲基
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸
甲酯(5，40.0g，136mmol)在1,2
‑
二氯乙烷(200ml)中的溶液中。将混合物回流过夜。将反应混合物冷却至室温，用二氯甲烷(500ml)稀释并用水(2x500ml)萃取。有机溶液经无水硫酸镁干燥并蒸发至干，得到呈微黄色晶体的4
‑
(溴甲基)
‑3‑
氟
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸甲酯(6)。该产物无需进一步纯化即用于下一步。产量：35.5g(70％)。lc
‑
ms m/z:373.4(m h) 。
[1103]
将4
‑
(溴甲基)
‑3‑
氟
‑5‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧硼杂环戊烷
‑2‑
基)苯甲酸甲酯(6，7.46g，20.0mmol)与2.5m氢氧化钠水溶液(40.0ml，100mmol)一起在室温下搅拌过夜。添加6m盐酸水溶液(20.0ml，120mmol)，将混合物搅拌30分钟并保持4℃过夜。通过过滤收集白色沉淀物，用水(2x100ml)洗涤并风干，得到呈白色固体的4
‑
氟
‑1‑
羟基
‑
1,3
‑
二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯
‑6‑
甲酸(7)，其无需进一步纯化即用于下一步。产量：3.76g(96％)。1h nmr谱(300mhz,dmso
‑
d6,δh)：12.8(s,1h)；9.57(s,1h)；8.20(s,1h)；7.72(d,j＝7.1hz,1h)；5.14(s,2h)。lc
‑
ms m/z:197.4(m h) 。
[1104]
胰岛素衍生物的制备
[1105]
使用c18柱，以0.1％tfa水溶液作为缓冲液a并以0.1％tfa乙腈溶液作为缓冲液b，进行lcms分析。
[1106]
硼
‑
胰岛素衍生物的lcms通常将脱水物质显示为主峰：
[1107]
对于离子化状态“n”和“m”个数目的硼酸为[m nh
‑
2x m m
水
]
n
[1108]
对于离子化状态“n”和“m”个数目的硼氧杂环戊烯为[m nh
‑
1x m m
water
]
n
[1109]
例如，对于具有4个硼酸的衍生物的五离子状态，为[m 5h
‑
2x(4x18.015)]
5
[1110]
[m 4h
–
x(水)]
4
和[m 5h
–
x(水)]
5
的测量值和计算值显示在表2中(在实施例b下显示)。
[1111]
实施例中的胰岛素缀合物使用氨基酸的标准单字母缩写绘制。半胱氨酸残基的硫原子被特别绘出，以说明二硫键。绘出通过缀合修饰的残基，以准确显示相关氨基酸中发生修饰的位置。胰岛素的n末端用小号h
‑
表示，c末端用小号
‑
oh表示，这是肽化学中的标准。当末端残基通过缀合修饰时不使用h
‑
和
‑
oh，在这种情况下，将残基放大绘出，如上所述。在一些情况下，人胰岛素中的置换用小号星号(*)示出。
[1112]
在与胰岛素缀合之前，在乙腈或thf中使用honsu/dic或tstu激活还不是琥珀酰亚胺酯的结构单元。
[1113]
实施例101：
[1114][1115]
将a22k desb30人胰岛素(500mg，0.086mmol)溶解于0.1m碳酸钠(5ml)(ph 10.5)中。将实施例2的结构单元(146mg，0.189mmol)溶解于mecn(5ml)中，并加入到提及的胰岛素溶液中。监测ph值并保持在10.5附近。30分钟后，lcms显示所需产物的形成。将混合物用20％mecn水溶液(11ml)稀释，并使用tfa将ph调节至1.5。将产物通过c18柱上的反相hplc(rp
‑
hplc)纯化，其中使用0.1％tfa的水溶液作为缓冲液a，0.1％tfa的乙腈溶液作为缓冲液b。通过冻干分离产物。lcms测量值为1670.4[m 4h
‑
8x水]
4
，计算值为1670.6，参见表2(在实施例b下显示)。
[1116]
实施例102：
[1117]
[1118]
实施例102的胰岛素衍生物与实施例101的胰岛素衍生物类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例3的结构单元制备。产物的lcms测量值为1689.0[m 4h
‑
8x水]
4
，计算值为1689.2。
[1119]
实施例103：
[1120][1121]
实施例103的胰岛素衍生物如下制备：将desb30人胰岛素(232mg，0.041mmol)溶解于dmso中，并加入dmso中的实施例4的结构单元(35.6mg，0.045mmol)以及nmm(1.22mmol，135.5ul)。将产物通过c18柱上的反相hplc(rp
‑
hplc)纯化，其中使用0.1％tfa的水溶液作为缓冲液a，0.1％tfa的乙腈溶液作为缓冲液b，并通过冻干分离。产物的lcms测量值为1663.0[m 4h
‑
4x水]
4
，计算值为1664.1。
[1122]
实施例104：
[1123][1124]
实施例104的胰岛素衍生物与实施例103的胰岛素衍生物类似地由desb30人胰岛素和实施例4的结构单元的类似物制备，该类似物是使用4
‑
羧基
‑
苯并硼氧杂环戊烯、赖氨酸和β
‑
丙氨酸制备的。
[1125]
实施例105：
[1126][1127]
将desb30人胰岛素(400mg)溶解于0.1m acoh(5ml)中，并使用0.1n naoh将ph调节至3.5。将实施例6的醛连接体(200mg)的溶液溶解于dmf(0.5ml)中并添加。搅拌30分钟后，加入溶解于nmp(0.5ml)中的甲基吡啶硼烷(44mg)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加水(20ml)，并使用0.1m hcl将ph调节至1，产物通过hplc进行纯化。使用tfa除去延伸中lys上的boc基团。将双
‑
lys胰岛素中间体(33mg)溶解于0.2m na2co3(0.400ml)中，并将ph调节至10.5。将实施例2的二硼酸琥珀酰亚胺酯(2.5当量，0.6mg)溶解于乙腈(340ul)中，并加入到混合物中。将反应搅拌10分钟，通过lcms监测反应进程，产物与实施例101类似地通过hplc分离。lcms测量值为1827.3[m 4h
‑
4x水]
4
，计算值为1827.3。
[1128]
实施例106：
[1129][1130]
实施例106与实施例105类似地使用实施例7的结构单元制成。lcms测量值为1724.3，计算值为1724.2。
[1131]
实施例107：
[1132][1133]
实施例107与实施例105类似地使用实施例7的结构单元制成。lcms测量值1640.8，计算值1640.9。
[1134]
实施例108：
[1135][1136]
实施例109与实施例107类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例7的结构单元制成。lcms测量值1987.5，计算值1987.5。
[1137]
实施例109：
[1138][1139]
将a22k desb30人胰岛素(500mg，0.086mmol)溶解于0.2m碳酸钠缓冲液(6ml)(ph 10.8)中。将实施例7的结构单元(307mg，0.189mmol)溶解于mecn(6ml)中。10分钟后的lcms显示预期产物，其通过hplc纯化。
[1140]
实施例110：
[1141][1142]
将a22k desb30人胰岛素(435mg，0.075mmol)溶解于0.2m碳酸钠缓冲液(10ml)(ph 10.8)中。将(使用mecn中的tstu/diea)活化为琥珀酰亚胺酯的实施例8的结构单元(279mg，0.164mmol)溶解于mecn(6ml)中。10分钟后的lcms显示预期产物，其通过hplc纯化。lcms测
量值1643.7[m 5h
‑
8x水]
5
，计算值1643.7。
[1143]
实施例111：
[1144][1145]
实施例111与实施例103类似地由desb30人胰岛素和实施例7的结构单元制成。
[1146]
实施例112：
[1147][1148]
实施例112与实施例105类似地由a22k b29r desb30人胰岛素和实施例7的结构单元制成。
[1149]
实施例113：
[1150][1151]
实施例113与实施例101类似地由desb30人胰岛素和实施例9的结构单元制成。
[1152]
实施例114：
[1153][1154]
实施例114与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例9的结构单元制成。
[1155]
实施例115：
[1156][1157]
实施例115与实施例101类似地由b1
‑
gkprgffytpggggsggggs desb30人胰岛素和实施例3的结构单元制成。
[1158]
实施例116：
[1159][1160]
实施例116与实施例101类似地由b1
‑
gkprgffytpggggsggggs desb30人胰岛素和实施例9的结构单元制成。
[1161]
实施例117：
[1162][1163]
实施例117与实施例101类似地由b1
‑
tyffgrkpdggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例10的结构单元制成。
[1164]
实施例118：
[1165][1166]
实施例118与实施例101类似地由b1
‑
tyffgrkpdggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例9的结构单元制成。
[1167]
实施例119：
[1168][1169]
实施例119与实施例101类似地由b1
‑
tyffgrkpdggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例2的结构单元制成。
[1170]
实施例120：
[1171][1172]
实施例120与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例11的结构单元制成。
[1173]
实施例121：
[1174][1175]
实施例121与实施例101类似地由b1
‑
tyffgrkpdggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例10的结构单元制成。
[1176]
实施例122：
[1177][1178]
实施例122与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例12的结构单元制成。
[1179]
实施例123：
[1180][1181]
实施例123与实施例101类似地由b1
‑
gkprgffytpggggsggggs desb30人胰岛素和实施例10的结构单元制成。
[1182]
实施例124：
[1183][1184]
实施例124与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例13的结构单元制成。
[1185]
实施例125：
[1186][1187]
实施例125与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例14的结构单元制成。
[1188]
实施例126：
[1189][1190]
实施例126与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例15的结构单元制成。
[1191]
实施例127：
[1192][1193]
实施例127与实施例101类似地由a14e b1k b2p b25h desb27desb30人胰岛素通过首先用γ
‑
氨基丁酸酰化胰岛素，及随后的实施例15的结构单元制成。
[1194]
实施例128：
[1195][1196]
实施例128与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例15的结构单元制成。
[1197]
实施例129：
[1198][1199]
实施例129与实施例101类似地由a14e b1k b2p b25h desb27desb30人胰岛素和实施例3的结构单元制成。
[1200]
实施例130：
[1201][1202]
实施例130与实施例101类似地由a22k b22k b29r desb30人胰岛素和实施例9的结构单元制成。
[1203]
实施例131：
[1204][1205]
实施例131与实施例101类似地由a22k b22k b29r desb30人胰岛素通过首先用γ
‑
氨基丁酸酰化胰岛素，及随后的实施例9的结构单元制成。
[1206]
实施例132：
[1207][1208]
实施例132与实施例101类似地由b1
‑
tyffgrkpdggggsggggsggggs desb30人胰岛素通过首先用γ
‑
氨基丁酸酰化胰岛素，及随后的实施例15的结构单元制成。
[1209]
实施例133：
[1210][1211]
实施例133与实施例101类似地由a21q(ges)3k desb30人胰岛素和实施例15的结构单元制成。
[1212]
实施例134：
[1213][1214]
实施例134与实施例101类似地由a14e b1k b2p b25h desb27desb30和实施例10的结构单元制成。
[1215]
实施例135：
[1216][1217]
实施例135与实施例101类似地由b1
‑
tyffgrkpdggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1218]
实施例136：
[1219][1220]
实施例136与实施例101类似地由a21q(ges)3k desb30人胰岛素和实施例9的结构单元制成。
[1221]
实施例137：
[1222][1223]
实施例137与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制
成。
[1224]
实施例138：
[1225][1226]
实施例138与实施例101类似地由a14e b1k b2p b25h desb27desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1227]
实施例139：
[1228][1229]
实施例139与实施例101类似地由a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素和实施例9的结构单元制成。
[1230]
实施例140：
[1231][1232]
实施例140与实施例101类似地由a21q(ges)3k desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1233]
实施例141：
[1234][1235]
实施例141与实施例101类似地由a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素和实施例2的结构单元制成。
[1236]
实施例142：
[1237][1238]
实施例142与实施例101类似地由a21q(ges)3k desb30人胰岛素和实施例2的结构单元制成。
[1239]
实施例143：
[1240]
[1241]
实施例143与实施例101类似地由a14e b1k b2p b25h desb27desb30人胰岛素和实施例10的结构单元制成。
[1242]
实施例144：
[1243][1244]
实施例144与实施例101类似地由a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素和实施例10的结构单元制成。
[1245]
实施例145：
[1246][1247]
实施例145与实施例101类似地由a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素和实施例10的结构单元制成。
[1248]
实施例146：
[1249][1250]
实施例146与实施例101类似地由a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1251]
实施例147：
[1252][1253]
实施例147与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例10的结构单元制
成。
[1254]
实施例148：
[1255][1256]
实施例148与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例17的结构单元制成。
[1257]
实施例149：
[1258]
[1259]
实施例149与实施例101类似地由a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素和实施例15的结构单元制成。
[1260]
实施例150：
[1261][1262]
实施例150与实施例101类似地由a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素和实施例18的结构单元制成。
[1263]
实施例151：
[1264][1265]
实施例151与实施例101类似地由a14e a22k b25h b27p b28gdesb30人胰岛素和实施例9的结构单元制成。
[1266]
实施例152：
[1267][1268]
实施例152与实施例101类似地由a14e a22k b25h b27p b28gdesb30人胰岛素和实施例15的结构单元制成。
[1269]
实施例153：
[1270][1271]
实施例153与实施例101类似地由a14e a22k b25h b27p b28gdesb30人胰岛素和实施例9的结构单元制成。
[1272]
实施例154：
[1273][1274]
实施例154与实施例101类似地由a14e a22k b25h b27p b28gdesb30人胰岛素和实施例19的结构单元制成。
[1275]
实施例155：
[1276][1277]
实施例155与实施例101类似地由a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素和实施例19的结构单元制成。
[1278]
实施例156：
[1279][1280]
实施例156与实施例103类似地由a22k b22k b29r desb30人胰岛素和实施例15的
结构单元制成。
[1281]
实施例157：
[1282][1283]
实施例157与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例19的结构单元制成。
[1284]
实施例158：
[1285][1286]
实施例158与实施例101类似地由a14e a22k b25h b27p b28gdesb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1287]
实施例159：
[1288][1289]
实施例159与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例20的结构单元制成。
[1290]
实施例160：
[1291][1292]
实施例160与实施例101类似地由
[1293]
b1
‑
tyffgrkpdggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例20的结构单元制成。
[1294]
实施例161：
[1295][1296]
实施例161与实施例101类似地由a
‑
2k a
‑
1p desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1297]
实施例162：
[1298][1299]
实施例162与实施例105类似地由a22k b29r desb30人胰岛素和实施例2的结构单元制成。
[1300]
实施例163：
[1301][1302]
实施例163与实施例105类似地由a22k b29r desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1303]
实施例164：
[1304][1305]
实施例164与实施例105类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例2的结构单元制成。
[1306]
实施例165：
[1307][1308]
实施例165与实施例105类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1309]
实施例166：
[1310][1311]
实施例166与实施例101类似地由a14e a22k b25h desb27 desb30和实施例20的结构单元制成。
[1312]
实施例167：
[1313][1314]
实施例167与实施例101类似地由a21q(ges)3k desb30人胰岛素和实施例20的结构单元制成。
[1315]
实施例168：
[1316][1317]
实施例168与实施例101类似地由a21q(ges)6k desb30人胰岛素和实施例2的结构单元制成。
[1318]
实施例169：
[1319][1320]
实施例169与实施例101类似地由a21q(ges)6k desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1321]
实施例170：
[1322][1323]
实施例170与实施例101类似地由a21q(ges)6k desb30人胰岛素和实施例9的结构单元制成。
[1324]
实施例171：
[1325][1326]
实施例171与实施例105类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例9的结构单元制成。
[1327]
实施例172：
[1328][1329]
实施例172与实施例101类似地由a22k b22k b29r desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1330]
实施例173：
[1331][1332]
实施例173与实施例105类似地由desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1333]
实施例174：
[1334][1335]
实施例174与实施例105类似地由desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1336]
实施例175：
[1337][1338]
实施例175与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1339]
实施例176：
[1340][1341]
实施例176与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b4k b5p desb30人胰岛素和实施例20的结构单元制成。
[1342]
实施例177：
[1343][1344]
实施例177与实施例103类似地由desb30人胰岛素和实施例20的结构单元制成。
[1345]
实施例178：
[1346][1347]
实施例178与实施例103类似地由desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1348]
实施例179：
[1349][1350]
实施例179与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例22的结构单元制成。
[1351]
实施例180：
[1352][1353]
实施例180与实施例101类似地由desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1354]
实施例181：
[1355][1356]
实施例181与实施例101类似地由desb30人胰岛素和实施例22的结构单元制成。
[1357]
实施例182：
[1358][1359]
实施例182与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b4k b5p desb30人胰岛素和实施例22的结构单元制成。
[1360]
实施例183：
[1361][1362]
实施例183与实施例105类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例20的结构单元制成。
[1363]
实施例184：
[1364][1365]
实施例184与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b4k b5p desb30人胰岛素和实施例19的结构单元制成。
[1366]
实施例185：
[1367][1368]
实施例185与实施例105类似地由desb30人胰岛素和实施例20的结构单元制成。
[1369]
实施例186：
[1370][1371]
实施例186与实施例105类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例20的结构单元制成。
[1372]
实施例187：
[1373][1374]
实施例187与实施例105类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例24的结构单元制成。
[1375]
实施例188：
[1376][1377]
实施例188与实施例101类似地由b1
‑
kpggggsggggsggggsdesb30人胰岛素和实施例25的结构单元制成。
[1378]
实施例189：
[1379][1380]
实施例189与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b4k b5p desb30人胰岛素和实施例25的结构单元制成。
[1381]
实施例190：
[1382][1383]
实施例190与实施例105类似地由desb30人胰岛素和实施例25的结构单元制成。
[1384]
实施例191：
[1385][1386]
实施例191与实施例105类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例25的结构单元制成。
[1387]
实施例192：
[1388][1389]
实施例192与实施例105类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例25的结构单元制成。
[1390]
实施例193：
[1391][1392]
实施例193与实施例101类似地由a21q(ges)3k desb30人胰岛素和实施例19的结构单元制成。
[1393]
实施例194：
[1394][1395]
实施例194与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1396]
实施例195：
[1397][1398]
实施例195与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例25的结构单元制成。
[1399]
实施例196：
[1400][1401]
实施例196与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例26的结构单元制
成。
[1402]
实施例197：
[1403][1404]
实施例197与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例25的结构单元制成。
[1405]
实施例198：
[1406][1407]
实施例198与实施例105类似地由desb30人胰岛素和实施例24的结构单元制成。
[1408]
实施例199：
[1409][1410]
实施例199与实施例105类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例24的结构单元制成。
[1411]
实施例200：
[1412][1413]
实施例200与实施例101类似地由a14e b1k b2p b25h desb27desb30人胰岛素和实施例25的结构单元制成。
[1414]
实施例201：
[1415][1416]
实施例201与实施例101类似地由a14e b1k b2p b25h desb27desb30人胰岛素和实施例25的结构单元制成。
[1417]
实施例202：
[1418][1419]
实施例202与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例27的结构单元制成。
[1420]
实施例203：
[1421][1422]
实施例203与实施例101类似地由b1
‑
kpggggsggggsggggs a14e b25h desb30人胰岛素和实施例23的结构单元制成。
[1423]
实施例204：
[1424][1425]
实施例204与实施例101类似地由b1
‑
kpggggsggggsggggs a14e b25h desb30人胰岛素和实施例28的结构单元制成。
[1426]
实施例205：
[1427][1428]
实施例205与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b4k b5p desb30人胰岛素和实施例28的结构单元制成。
[1429]
实施例206：
[1430][1431]
实施例206与实施例101类似地由desb30人胰岛素和实施例22的结构单元制成。
[1432]
实施例207：
[1433][1434]
实施例207与实施例101类似地由desb30人胰岛素和实施例27的结构单元制成。
[1435]
实施例208：
[1436][1437]
实施例208与实施例101类似地由b1
‑
kpggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例22的结构单元制成。
[1438]
实施例209：
[1439][1440]
实施例209与实施例101类似地由b1
‑
kpggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例24的结构单元制成。
[1441]
实施例210：
[1442][1443]
实施例210与实施例101类似地由b1
‑
kpggggsggggsggggs a14e b25h desb30人胰
岛素和实施例26的结构单元制成。
[1444]
实施例211：
[1445][1446]
实施例211与实施例101类似地由a14e b1k b2p b25h desb27desb30和实施例28的结构单元制成。
[1447]
实施例212：
[1448][1449]
实施例212与实施例101类似地由b1
‑
kpggggsggggsggggs a14e b25h desb30人胰岛素和实施例24的结构单元制成。
[1450]
实施例213：
[1451][1452]
实施例213与实施例101类似地由a14e b1k b2p b25h desb27desb30和实施例22的结构单元制成。
[1453]
实施例214：
[1454][1455]
实施例214与实施例105类似地由desb30人胰岛素和实施例29的结构单元制成。
[1456]
实施例215：
[1457][1458]
实施例215与实施例101类似地由b1
‑
kpggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例29的结构单元制成。
[1459]
实施例216：
[1460][1461]
实施例216与实施例105类似地由desb30人胰岛素和实施例29的结构单元制成。
[1462]
实施例217：
[1463][1464]
实施例217与实施例105类似地由desb30人胰岛素和实施例28的结构单元制成。
[1465]
实施例218：
[1466][1467]
实施例218与实施例101类似地由b1
‑
kpggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例28的结构单元制成。
[1468]
实施例219：
[1469][1470]
实施例219与实施例105类似地由desb30人胰岛素和实施例28的结构单元制成。
[1471]
实施例220：
[1472][1473]
实施例220与实施例105类似地由desb30人胰岛素和实施例30的结构单元制成。
[1474]
实施例221：
[1475][1476]
实施例221与实施例101类似地由b1
‑
kpggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例30的结构单元制成。
[1477]
实施例222：
[1478][1479]
实施例222与实施例105类似地由desb30人胰岛素和实施例30的结构单元制成。
[1480]
实施例223：
[1481][1482]
实施例223与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例30的结构单元制成。
[1483]
实施例224：
[1484][1485]
实施例224与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例30的结构单元制
成。
[1486]
实施例225：
[1487][1488]
实施例225与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例30的结构单元制成。
[1489]
实施例226：
[1490][1491]
实施例226与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例30的结构单元制成。
[1492]
实施例227：
[1493]
[1494]
实施例227与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例29的结构单元制成。
[1495]
实施例228：
[1496][1497]
实施例228与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例29的结构单元制成。
[1498]
实施例229：
[1499][1500]
实施例229与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例28的结构单元制成。
[1501]
实施例230：
[1502][1503]
实施例230与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b4k b5p desb30人胰岛素和实施例30的结构单元制成。
[1504]
实施例231：
[1505][1506]
实施例231与实施例101类似地由b1
‑
kpggggsggggsggggs a14e b25h desb30人胰岛素和实施例30的结构单元制成。
[1507]
实施例232：
[1508][1509]
实施例232与实施例101类似地由a14e b1k b2p b25h desb27desb30人胰岛素和
实施例20的结构单元制成。
[1510]
实施例233：
[1511][1512]
实施例233与实施例101类似地由b1
‑
kpggggsggggsggggs a14e b25h desb30人胰岛素和实施例29的结构单元制成。
[1513]
实施例234：
[1514][1515]
实施例234与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b4k b5p desb30人胰岛素和实施例29的结构单元制成。
[1516]
实施例235：
[1517][1518]
实施例235与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b4k b5p desb30人胰岛素和实施例24的结构单元制成。
[1519]
实施例236：
[1520][1521]
实施例236与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b4k b5p desb30人胰岛素和实施例31的结构单元制成。
[1522]
实施例237：
[1523][1524]
实施例237与实施例101类似地由b1
‑
kpggggsggggsggggs a14e b25h desb30人胰岛素和实施例31的结构单元制成。
[1525]
实施例238：
[1526][1527]
实施例238与实施例101类似地由a21q(ges)3k desb30人胰岛素和实施例31的结构单元制成。
[1528]
实施例239：
[1529][1530]
实施例239与实施例101类似地由a21q(ges)3k desb30人胰岛素和实施例30的结构单元制成。
[1531]
实施例240：
[1532][1533]
实施例240与实施例101类似地由a21q(ges)3k desb30人胰岛素和实施例29的结构单元制成。
[1534]
实施例241：
[1535][1536]
实施例241与实施例101类似地由a21q(ges)3k desb30人胰岛素和实施例28的结构单元制成。
[1537]
实施例242：
[1538][1539]
实施例242与实施例101类似地由a21q(ges)3k desb30人胰岛素和实施例24的结构单元制成。
[1540]
实施例243：
[1541][1542]
实施例243与实施例105类似地由desb30人胰岛素和实施例22的结构单元制成。
[1543]
实施例244：
[1544][1545]
实施例244与实施例101类似地由b1
‑
kpggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例33的结构单元制成。
[1546]
实施例245：
[1547][1548]
实施例245与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例29的结构单元制成。
[1549]
实施例246：
[1550][1551]
实施例246与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例29的结构单元制成。
[1552]
实施例247：
[1553][1554]
实施例247与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例28的结构单元制成。
[1555]
实施例248：
[1556][1557]
实施例248与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例28的结构单元制成。
[1558]
实施例249：
[1559][1560]
实施例249与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例28的结构单元制成。
[1561]
实施例250：
[1562][1563]
实施例250与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例33的结构单元制
成。
[1564]
实施例251：
[1565][1566]
实施例251与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例33的结构单元制成。
[1567]
实施例252：
[1568][1569]
实施例252与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例22的结构单元制成。
[1570]
实施例253：
[1571][1572]
实施例253与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例22的结构单元制成。
[1573]
实施例254：
[1574][1575]
实施例254与实施例101类似地由b1
‑
kpggggsggggsggggs a14e b25h desb30人胰岛素和实施例33的结构单元制成。
[1576]
实施例255：
[1577][1578]
实施例255与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b4k b5p desb30人胰岛素和实施例33的结构单元制成。
[1579]
实施例256：
[1580][1581]
实施例256与实施例101类似地由a21q(ges)3k desb30人胰岛素和实施例33的结构单元制成。
[1582]
实施例257：
[1583][1584]
实施例257与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例26的结构单元制成。
[1585]
实施例258：
[1586][1587]
实施例258与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例26的结构单元制成。
[1588]
实施例259：
[1589][1590]
实施例259与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例33的结构单元制成。
[1591]
实施例260：
[1592][1593]
实施例260与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例33的结构单元制成。
[1594]
实施例261：
[1595][1596]
实施例261与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例22的结构单元制成。
[1597]
实施例262：
[1598][1599]
实施例262与实施例101类似地由b1
‑
kpggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例34的结构单元制成。
[1600]
实施例263：
[1601][1602]
实施例263与实施例105类似地由desb30人胰岛素和实施例34的结构单元制成。
[1603]
实施例264：
[1604][1605]
实施例264与实施例101类似地由a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素和实施例28的结构单元制成。
[1606]
实施例265：
[1607][1608]
实施例265与实施例101类似地由a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素和实施例28的结构单元制成。
[1609]
实施例266：
[1610][1611]
实施例266与实施例101类似地由a14e b1k b2p b25h desb27 des b30人胰岛素和实施例29的结构单元制成。
[1612]
实施例267：
[1613]
[1614]
实施例267与实施例101类似地由a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素和实施例33的结构单元制成。
[1615]
实施例268：
[1616][1617]
实施例268与实施例101类似地由a21q(ges)3k desb30人胰岛素和实施例34的结构单元制成。
[1618]
实施例269：
[1619][1620]
实施例269与实施例101类似地由a14e a22k b25h desb27 des b30人胰岛素和实施例33的结构单元制成。
[1621]
实施例270：
[1622][1623]
实施例270与实施例101类似地由a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素和实施例33的结构单元制成。
[1624]
实施例271：
[1625][1626]
实施例271与实施例101类似地由a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素和实施例22的结构单元制成。
[1627]
实施例272：
[1628][1629]
实施例272与实施例101类似地由a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素和实施例29的结构单元制成。
[1630]
实施例273：
[1631][1632]
实施例273与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b3g b4k b5p desb30人胰岛素
和实施例33的结构单元制成。
[1633]
实施例274：
[1634][1635]
实施例274与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b3g b4k b5p desb30人胰岛素和实施例28的结构单元制成。
[1636]
实施例275：
[1637][1638]
实施例275与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b3g b4k b5pdesb30人胰岛素和实施例29的结构单元制成。
[1639]
实施例276：
[1640][1641]
实施例276与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b3g b4k b5p desb30人胰岛素和实施例30的结构单元制成。
[1642]
实施例277：
[1643][1644]
实施例277与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例33的结构单元制成。
[1645]
实施例278：
[1646][1647]
实施例278与实施例101类似地由a14e b1k b2p b25h desb27 desb30人胰岛素和实施例33的结构单元制成。
[1648]
实施例279：
[1649][1650]
实施例279与实施例101类似地由a14e b1k b2p b25h desb27desb30人胰岛素和实施例34的结构单元制成。
[1651]
实施例280：
[1652][1653]
实施例280与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例29的结构单元制成。
[1654]
实施例281：
[1655][1656]
实施例281与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例30的结构单元制成。
[1657]
实施例282：
[1658][1659]
实施例282与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例28的结构单元制成。
[1660]
实施例283：
[1661][1662]
实施例283与实施例101类似地由a14e b1k b2p b25h desb27desb30和实施例30的结构单元制成。
[1663]
实施例284：
[1664][1665]
实施例284与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例34的结构单元制成。
[1666]
实施例285：
[1667][1668]
实施例285与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b3g b4k b5p desb30和实施例34的结构单元制成。
[1669]
实施例286：
[1670][1671]
实施例286与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggs desb30人胰岛素和实施例28
的结构单元制成。
[1672]
实施例287：
[1673][1674]
实施例287与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggs desb30人胰岛素和实施例28的结构单元制成。
[1675]
实施例288：
[1676][1677]
实施例288与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggs desb30人胰岛素和实施例34的结构单元制成。
[1678]
实施例289：
[1679][1680]
实施例289与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggs desb30人胰岛素和实施例34的结构单元制成。
[1681]
实施例290：
[1682][1683]
实施例290与实施例101类似地由a22k desb30人胰岛素和实施例34的结构单元制成。
[1684]
实施例291：
[1685][1686]
实施例291与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggs desb30人胰岛素和实施例33的结构单元制成。
[1687]
实施例292：
[1688][1689]
实施例292与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggs desb30人胰岛素和实施例33的结构单元制成。
[1690]
实施例293：
[1691][1692]
通过类似于实施例101的缀合将boc
‑
oeg与a21q(ges)3k desb30人胰岛素的两个赖氨酸残基缀合，然后使用95％tfa去除boc
‑
基团，并类似于实施例101中的缀合将oeg的氨基与实施例29的结构单元缀合，制得实施例293。
[1693]
实施例294：
[1694][1695]
实施例294与实施例101类似地由a21q(ges)6k desb30人胰岛素和实施例29的结构单元制成。
[1696]
实施例295：
[1697][1698]
实施例295与实施例101类似地由a21q(ges)3k desb30人胰岛素和实施例27的结构单元制成。
[1699]
实施例296：
[1700][1701]
实施例296与实施例101类似地由a21q(ges)6k desb30人胰岛素和实施例33的结构单元制成。
[1702]
实施例297：
[1703][1704]
实施例297与实施例101类似地由a21q(ges)3k desb30人胰岛素和实施例22的结构单元制成。
[1705]
实施例298：
[1706][1707]
实施例298与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggs desb30人胰岛素和实施例30的结构单元制成。
[1708]
实施例299：
[1709][1710]
实施例299与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggs desb30人胰岛素和实施例30的结构单元制成。
[1711]
实施例300：
[1712][1713]
实施例300与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggs desb30人胰岛素和实施例29的结构单元制成。
[1714]
实施例301：
[1715][1716]
实施例301与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggs desb30人胰岛素和实施例29的结构单元制成。
[1717]
实施例302：
[1718][1719]
实施例302与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b3g b4k b5pdesb30和实施例16的结构单元制成。
[1720]
实施例303：
[1721][1722]
实施例303与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1723]
实施例304：
[1724][1725]
实施例304与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggs desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1726]
实施例305：
[1727][1728]
实施例305与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggs desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1729]
实施例306：
[1730][1731]
实施例306与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例35的结构单元制成。
[1732]
实施例307：
[1733]
[1734]
实施例307与实施例101类似地由a14e b
‑
1g b1k b2p desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1735]
实施例308：
[1736][1737]
实施例308与实施例101类似地由a14e b
‑
1g b1k b2p desb30人胰岛素和实施例30的结构单元制成。
[1738]
实施例309：
[1739][1740]
实施例309与实施例101类似地由a14e b
‑
1g b1k b2p desb30人胰岛素和实施例28的结构单元制成。
[1741]
实施例310：
[1742][1743]
实施例310与实施例101类似地由a14e b
‑
1g b1k b2p desb30人胰岛素和实施例29的结构单元制成。
[1744]
实施例311：
[1745][1746]
实施例311与实施例101类似地由a14e b
‑
1g b1k b2p desb30人胰岛素和实施例22的结构单元制成。
[1747]
实施例312：
[1748][1749]
实施例312与实施例101类似地由a14e b
‑
1g b1k b2p desb30人胰岛素和实施例16的结构单元制成。
[1750]
实施例313：
[1751][1752]
实施例313与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b3g b4k b5pdesb30人胰岛素和实施例35的结构单元制成。
[1753]
实施例314：
[1754][1755]
实施例314与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggs desb30人胰岛素和实施例35的结构单元制成。
[1756]
实施例315：
[1757][1758]
实施例315与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggs desb30人胰岛素和实施例35的结构单元制成。
[1759]
实施例316：
[1760][1761]
实施例316与实施例101类似地由a21q(ges)12k desb30人胰岛素和实施例29的结构单元制成。
[1762]
实施例317：
[1763][1764]
实施例317与实施例101类似地由a14e b1k b2p b25h desb27 desb30人胰岛素和实施例35的结构单元制成。
[1765]
实施例318：
[1766][1767]
实施例318与实施例101类似地由b1
‑
kpggggsggggsggggs a14e b25h desb30人胰岛素和实施例35的结构单元制成。
[1768]
实施例319：
[1769][1770]
实施例319与实施例101类似地由b1
‑
kpggggsggggsggggs a14e b25h desb30人胰岛素和实施例36的结构单元制成。
[1771]
实施例320：
[1772][1773]
实施例320与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b3g b4k b5pdesb30人胰岛素和实施例36的结构单元制成。
[1774]
实施例321：
[1775][1776]
实施例321与实施例101类似地由a21q(ges)12k desb30人胰岛素和实施例34的结构单元制成。
[1777]
实施例322：
[1778][1779]
实施例322与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggs desb30人胰岛素和实施例36的结构单元制成。
[1780]
实施例323：
[1781][1782]
实施例323与实施例101类似地由b1
‑
gkpg desb30人胰岛素和实施例34的结构单元制成。
[1783]
实施例324：
[1784][1785]
实施例324与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例37的结构单元制成。通过在室温下用95％tfa/水处理30
‑
60分钟来去除胰岛素衍生物的γ
‑
glu残基上的叔丁基保护基。
[1786]
实施例325：
[1787][1788]
实施例325与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例38的结构单元制成。
[1789]
实施例326：
[1790][1791]
实施例326与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggs desb30人胰岛素和实施例36的结构单元制成。
[1792]
实施例327：
[1793][1794]
实施例327与实施例101类似地由a14e b
‑
1g b1k b2p desb30人胰岛素和实施例37的结构单元制成。通过在室温下用95％tfa/水处理30
‑
60分钟来去除胰岛素衍生物的γ
‑
glu残基上的叔丁基保护基。
[1795]
实施例328：
[1796][1797]
实施例328与实施例101类似地由a14e b1k b2p b25h desb27desb30人胰岛素和实施例36的结构单元制成。
[1798]
实施例329：
[1799][1800]
实施例329与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b3g b4k b5pdesb30人胰岛素和实施例37的结构单元制成。通过在室温下用95％tfa/水处理30
‑
60分钟来去除胰岛素衍生物的γ
‑
glu残基上的叔丁基保护基。
[1801]
实施例330：
[1802][1803]
实施例330与实施例101类似地由a21q(ges)12k desb30人胰岛素和实施例28的结构单元制成。
[1804]
实施例331：
[1805][1806]
实施例331与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggs desb30人胰岛素和实施例37的结构单元制成。通过在室温下用95％tfa/水处理30
‑
60分钟来去除胰岛素衍生物的γ
‑
glu残基上的叔丁基保护基。
[1807]
实施例332：
[1808][1809]
实施例332与实施例101类似地由b1
‑
kpggggsggggsggggs a14e b25h desb30人胰岛素和实施例37的结构单元制成。通过在室温下用95％tfa/水处理30
‑
60分钟来去除胰岛素衍生物的γ
‑
glu残基上的叔丁基保护基。
[1810]
实施例333：
[1811][1812]
实施例333与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggs desb30人胰岛素和实施例37的结构单元制成。通过在室温下用95％tfa/水处理30
‑
60分钟来去除胰岛素衍生物的γ
‑
glu残基上的叔丁基保护基。
[1813]
实施例334：
[1814][1815]
实施例334与实施例101类似地由a14e b1k b2p b25h desb27desb30人胰岛素和
实施例37的结构单元制成。通过在室温下用95％tfa/水处理30
‑
60分钟来去除胰岛素衍生物的γ
‑
glu残基上的叔丁基保护基。
[1816]
实施例335：
[1817][1818]
实施例335与实施例101类似地由a14e b1k b2p b25h desb27desb30人胰岛素和实施例39的结构单元制成。通过在室温下用95％tfa/水处理30
‑
60分钟来去除胰岛素衍生物的γ
‑
glu残基上的叔丁基保护基。
[1819]
实施例336：
[1820]
[1821]
实施例336与实施例101类似地由b1
‑
gkpg desb30人胰岛素和实施例29的结构单元制成。
[1822]
实施例337：
[1823][1824]
实施例337与实施例101类似地由a21q(ges)3k desb30人胰岛素和实施例36的结构单元制成。
[1825]
实施例338：
[1826][1827]
实施例338与实施例101类似地由a21q(ges)3k desb30人胰岛素和实施例39的结构单元制成。通过在室温下用95％tfa/水处理30
‑
60分钟来去除胰岛素衍生物的γ
‑
glu残基上的叔丁基保护基。
[1828]
实施例339：
[1829]
[1830]
实施例339与实施例101类似地由a21q(ges)3k desb30人胰岛素和实施例37的结构单元制成。通过在室温下用95％tfa/水处理30
‑
60分钟来去除胰岛素衍生物的γ
‑
glu残基上的叔丁基保护基。
[1831]
实施例340：
[1832][1833]
实施例340与实施例101类似地由a21q(ges)12k desb30人胰岛素和实施例30的结构单元制成。
[1834]
实施例341：
[1835][1836]
实施例341与实施例101类似地由a21q(ges)12k desb30人胰岛素和实施例38的结构单元制成。
[1837]
实施例342：
[1838][1839]
实施例342与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggs desb30人胰岛素和实施例38的结构单元制成。
[1840]
实施例343：
[1841][1842]
实施例343与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggs desb30人胰岛素和实施例38的结构单元制成。
[1843]
实施例344：
[1844][1845]
实施例344与实施例101类似地由b1
‑
kpggggsggggsggggs a14e b25h desb30人胰岛素和实施例38的结构单元制成。
[1846]
实施例345：
[1847][1848]
实施例345与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b3g b4k b5pdesb30人胰岛素和实施例39的结构单元制成。通过在室温下用95％tfa/水处理30
‑
60分钟来去除胰岛素衍生物的γ
‑
glu残基上的叔丁基保护基。
[1849]
实施例346：
[1850][1851]
实施例346与实施例101类似地由a14e b1k b2p b25h desb27desb30人胰岛素和实施例38的结构单元制成。
[1852]
实施例347：
[1853][1854]
实施例347与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例39的结构单元制成。通过在室温下用95％tfa/水处理30
‑
60分钟来去除胰岛素衍生物的γ
‑
glu残基上的叔丁基保护基。
[1855]
实施例348：
[1856][1857]
实施例348与实施例101类似地由a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素和实施例39的结构单元制成。通过在室温下用95％tfa/水处理30
‑
60分钟来去除胰岛素衍生物的γ
‑
glu残基上的叔丁基保护基。
[1858]
实施例349：
[1859][1860]
实施例349与实施例101类似地由a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素和实施例38的结构单元制成。
[1861]
实施例350：
[1862][1863]
实施例350与实施例101类似地由a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素和实施例37的结构单元制成。通过在室温下用95％tfa/水处理30
‑
60分钟来去除胰岛素衍生物的γ
‑
glu残基上的叔丁基保护基。
[1864]
实施例351：
[1865][1866]
实施例351与实施例101类似地由b1
‑
gkpggggsggggsggggs desb30人胰岛素和实施例40的结构单元制成。通过在室温下用95％tfa/水处理30
‑
60分钟来去除胰岛素衍生物的γ
‑
glu残基上的叔丁基保护基。
[1867]
实施例352：
[1868][1869]
实施例352与实施例101类似地由a14e a22k b25h desb27 desb30人胰岛素和实施例40的结构单元制成。通过在室温下用95％tfa/水处理30
‑
60分钟来去除胰岛素衍生物的γ
‑
glu残基上的叔丁基保护基。
[1870]
实施例353：
[1871][1872]
实施例353与实施例101类似地由a21q(ges)3k desb30人胰岛素和实施例38的结构单元制成。
[1873]
实施例354：
[1874][1875]
实施例354与实施例101类似地由a14e desb1
‑
b2 b3g b4k b5pdesb30人胰岛素和实施例40的结构单元制成。通过在室温下用95％tfa/水处理30
‑
60分钟来去除胰岛素衍生物的γ
‑
glu残基上的叔丁基保护基。
[1876]
实施例a：碳水化合物和二硼酸酯结合亲和力，茜素测定(ars)
[1877]
茜素红结合测定是用于确定硼酸酯/硼氧杂环戊烯化合物对葡萄糖的抑制亲和力的比色测定。该测定基于茜素红与硼酸酯结合后的颜色变化，该变化后可以是在330
‑
340nm区域的吸光度变化。
[1878]
硼化合物对茜素的解离常数(k
d
)的测定
[1879]
为了测定茜素红钠(ars)与硼酸酯化合物之间的解离常数(kd)，将200μm ars溶解于20mm磷酸盐缓冲液ph7.4中，并一式三份滴定到具有1、0.5、0.25、0.125、62.5、31.25、15.625、7.812、3.906、1.953、0.9767、0.488和0.244mm硼酸的96孔板中。以4000rpm离心5分钟后，将板置于多孔光谱仪(spectramax，molecular devices)中进行吸光度检测。
[1880]
该分析在室温下进行，分别在330、340和520nm处进行吸光度读取。然后用s形函数拟合(prism 7，graphpad)获得的吸光度相对于硼酸酯浓度的数据，以获得硼酸酯和ars的kd值。
[1881]
葡萄糖对硼化合物的置换常数(k
d
)的测定
[1882]
为了测定硼酸酯与碳水化合物之间的抑制常数(ki)，在轻轻搅拌下将400μm硼酸溶解于20mm磷酸盐缓冲液ph7.4中。在化合物完全溶解后，将200μm茜素红(ars)添加到该溶液中。然后将ars
‑
硼酸酯溶液与适当的碳水化合物以1:1等分到96多孔板(黑色、平底和透明底)中。特别地，d
‑
葡萄糖和l
‑
乳酸溶液在ph 7.4的20mm磷酸盐缓冲液中分别制备为以下浓度：1000、500、250、100、50、25、10、5、2.5、1、0.25、0.1mm和2500、1000、500、100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01mm。将含有与碳水化合物混合的ars
‑
硼酸酯的板在室温下孵育20分钟。以4000rpm离心5分钟后，将板置于多孔光谱仪(spectramax，molecular devices)中进行吸光度检测。
[1883]
该分析在室温下进行，分别在330、340和520nm处进行吸光度读取。然后用单位点ki方程拟合(prism 7，graphpad)获得的吸光度相对于碳水化合物浓度的数据，该方程对ars
‑
硼酸酯获得的kd值和ars浓度(100μm)进行约束，以获得硼酸酯对所选碳水化合物的ki值。
[1884]
表1.对于本发明化合物中使用的二硼化合物和作为比较所包括的单硼化合物，通过实施例a中描述的茜素测定确定的葡萄糖和乳酸kd值。
[1885]
[1886][1887]
表1中的数据表明，在本发明化合物中使用的二硼化合物以低毫摩尔范围(0.8至4.2mm)的kd值结合葡萄糖，并且给定的二硼化合物对葡萄糖的亲和力高于对乳酸的亲和力。表1中的数据还表明，单硼化合物(实施例41、42、43)对葡萄糖的亲和力比本发明化合物中使用的二硼化合物更弱。单硼化合物对葡萄糖浓度生理范围的波动反应不佳。
[1888]
实施例b：在不存在或存在葡萄糖的情况下测定对人胰岛素受体(hir
‑
a)的亲和力的测定
[1889]
胰岛素受体制备
[1890]
在50mm hepes ph 8.0，150mm nacl，1％triton x
‑
100，2mm edta和10％甘油中裂解过表达人胰岛素受体a(hir
‑
a)的bhk细胞。将澄清的细胞裂解物用小麦胚芽凝集素(wga)
‑
琼脂糖(来自triticum vulgaris
‑
agarose的凝集素，l1394，sigma
‑
aldrich steinheim，德国)分批吸收90分钟。用20倍体积的50mm hepes ph 8.0，150mm nacl和0.1％triton x
‑
100洗涤受体，之后用50mm hepes ph 8.0，150mm nacl，0.1％triton x
‑
100、0.5m正乙酰基葡萄糖胺和10％甘油洗脱受体。所有缓冲液均含有如andersen等人.2017plos one 12所述的complete(roche diagnostic gmbh，mannheim，德国)。
[1891]
胰岛素受体闪烁迫近测定(spa)结合试验
[1892]
将spa pvt抗小鼠珠(perkin elmer)在spa结合缓冲液中稀释，该结合缓冲液由100mm hepes，ph 7.4或ph 7.8，100mm nacl，10mm mgso4、0.025％(v/v)吐温
‑
20组成。将spa珠与ir特异性抗体83
‑
7(soos等人.1986biochem j.235,199
‑
208)和溶解的半纯化的hir
‑
a一起孵育。调节受体浓度，以达到5000cpm 125
i
‑
(tyr31)
‑
胰岛素(novo nordisk a/s)的10％结合。将冷配体的稀释系列添加到96孔optiplate中，随后添加示踪剂(
125
i
‑
胰岛素，5000cpm/孔)，最后添加受体/spa混合物。为了测试葡萄糖敏感性，在不存在或存在20mm葡萄糖的情况下建立结合实验。将板在22℃下轻轻摇动22.5小时，以1000rpm离心5分钟，并在
topcounter(perkin elmer)中计数。将数据点拟合至四参数逻辑模型，由此确定了类似物与人胰岛素(在同一板内)相比的相对亲和力。将类似物与人胰岛素相比的相对亲和力确定为变化倍数，并且从0到20mm葡萄糖的相对亲和力的增加(hir葡萄糖因子)反映了类似物的葡萄糖敏感性。实验在1.5％hsa的存在下进行。数据在表2中示出。
[1893]
表2.本发明化合物在1.5％hsa存在下的胰岛素受体亲和力、葡萄糖因子和lcms数据
[1894]
[1895]
[1896]
[1897]
[1898]
[1899]
[1900]
[1901]
[1902]
[1903]
[1904]
[1905]
[1906]
[1907][1908]
表1中的数据表明，与不存在葡萄糖时相比，存在1.5％hsa时本发明的二硼胰岛素缀合物在20mm葡萄糖的存在下具有更高的胰岛素受体亲和力。葡萄糖可将二硼胰岛素缀合物从与白蛋白的结合中置换出来，从而提供更高游离分数的非白蛋白结合的二硼胰岛素缀合物，从而导致更高的胰岛素受体亲和力。
[1909]
实施例c：确定葡萄糖敏感性信号传导(低/高葡萄糖中的akt磷酸化)的测定，表3。
[1910]
当胰岛素与胰岛素受体(ir)结合时，它诱导下游信号通路的激活。下游信号分子之一是akt，因此akt磷酸化可以用来监测胰岛素信号通路的激活。
[1911]
akt测定
[1912]
将过表达hir
‑
a的中国仓鼠卵巢细胞在37℃下培养，并接种在葡萄糖浓度为3mm或20mm的96孔板中。添加渐增量的本发明的人胰岛素或胰岛素衍生物，以生成浓度
‑
响应曲线，并孵育10分钟。弃去培养基，并将细胞置于冰上。akt活化测定使用按照供应商的描述进行。使用envision仪器(envision，perkin elmer)测量信号。测定葡萄糖敏感性类似物(相对于人胰岛素)在20mm和3mm葡萄糖浓度下的效力之间的变化倍数。
[1913]
实施例d：确定细胞中碳水化合物敏感性葡萄糖摄取的测定(大鼠脂肪生成测定)
[1914]
当胰岛素与胰岛素受体结合时，它诱导下游信号通路的激活。胰岛素信号传导的一个代谢终点是脂质代谢，而脂肪生成测定用来测量终点读数，因为在胰岛素的存在下，细胞对3h
‑
葡萄糖的吸收得到刺激并被并入脂质中。
[1915]
大鼠脂肪生成测定(rffc)
[1916]
来自sprague dawley大鼠的附睾脂肪垫在hepes krebs ringer缓冲液中用胶原酶在36.5℃和剧烈摇动下降解1
‑
1.5小时。悬浮液通过2层纱布过滤。通过在室温下静置5分钟，从而使脂肪细胞收集在上相中来分离各相。用注射器除去下相。脂肪细胞用20ml hepes krebs ringer缓冲液洗涤两次。将细胞转移到96孔板中含有1.5％hsa、0.5mm葡萄糖、0.1μci/孔葡萄糖(d
‑
[3
‑3h]葡萄糖(20.0ci/mmol)perkin elmer)、 /
‑
10mm山梨醇的hepes krebs ringer缓冲液中。添加渐增量的本发明的人胰岛素或胰岛素衍生物以生成浓度
‑
响应曲线，并在36.5℃下孵育2小时。通过添加100μl microscient e(目录号6013661perkin elmer)终止反应。将板静置3小时，然后在top计数器中计数。确定葡萄糖敏感性类似物的ec50无山梨醇/ec50 10mm山梨醇之间的比率。
[1917]
表3.
[1918]
[1919]
[1920][1921]
表3中的akt数据表明，本发明的二硼胰岛素缀合物在较高葡萄糖浓度(20mm)的存在下与较低葡萄糖浓度(3mm)相比产生较高水平的akt磷酸化。表3中的脂肪生成数据表明，与不添加糖(0mm山梨醇)相比，本发明的二硼胰岛素缀合物在较高水平的糖(10mm山梨醇)的存在下产生更高水平的脂肪生成(即更多的葡萄糖转运)。
[1922]
细胞需要葡萄糖才能生存，因此使用3mm葡萄糖作为较低水平，使用20mm作为较高水平。rffc测定本身对葡萄糖水平是敏感的，因此在rffc测定中使用山梨醇(其本身不影响葡萄糖转运)作为糖来从hsa上置换二硼
‑
胰岛素衍生物。
[1923]
实施例e：pk和pd数据
[1924]
在65
‑
100kg的幼稚雌性家猪中进行正常血糖和高血糖钳夹。给动物配备两根静脉导管，一根用于输注，一根用于血液采样。通过持续输注促生长素抑制素、胰高血糖素和人胰岛素进行基础替代。输注开始后，通过调整葡萄糖输注将血浆葡萄糖水平改变为10mm或3.5
‑
4mm。血浆葡萄糖稳态(90或120分钟)后，静脉内团注胰岛素类似物。对于药代动力学(pk)分析，在选定的时间点采集血浆360至510分钟，并专门分析类似物。对于药效学(pd)分析，使用葡萄糖输注速率相比于稳态的变化。
[1925]
通过以3.5
‑
4或10mm葡萄糖向钳夹实验的猪静脉内给药，本发明的胰岛素衍生物以及对照的葡萄糖敏感性pk数据显示在图1
‑
9中，而对于3.5
‑
4mm葡萄糖与10mm葡萄糖的钳夹实验，作为基线调整的葡萄糖输注速率曲线下面积的pd数据显示在图10中。
[1926]
猪pk数据表明，与较低血糖水平(3.5
‑
4mm)相比，本发明的二硼胰岛素缀合物在较高血糖水平(10mm)时被更快地清除。葡萄糖从白蛋白结合中置换出二硼胰岛素缀合物产生
了较大比例的未结合的胰岛素，因此可用于胰岛素受体结合和激活。猪pd数据表明，与低葡萄糖水平相比，本发明的二硼胰岛素缀合物在高血糖水平下产生更多的葡萄糖处理。相反，非葡萄糖敏感性胰岛素对照(门冬胰岛素和德谷胰岛素)在高血糖和低血糖水平的钳夹实验的猪中显示相同的pk和pd。
[1927]
虽然本文已经阐述并描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、改变和等同方案。因此，应当理解，意欲以所附权利要求书涵盖所有这些落入本发明真正范围内的修改和改变。