一种甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测方法与试剂盒与流程

1.本发明为一种甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测方法与试剂盒，属于生物技术领域。


背景技术：

2.流行性感冒病毒（influenza virus），是正粘病毒科（orthomyxoviridae）的代表种，简称流感病毒，包括人流感病毒和动物流感病毒，其中人类流感病毒根据其核蛋白的抗原性可以分为三类：甲（a）、乙（b）、丙（c）三种型别，是流行性感冒（流感）的病原体。其中甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行。例如1918～1919年的大流行中，全世界至少有2000万～4000万人死于流感；乙型流感病毒对人类致病性也比较强，但是人们还没有发现乙型流感病毒引起过世界性大流行；丙型流感病毒只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染，很少造成流行。甲型流感病毒于1933年分离成功，乙型流感病毒于1940年获得，丙型流感病毒直到1949年才成功分离。
3.流感病毒呈球形，新分离的毒株则多呈丝状，其直径在80至120纳米之间，丝状流感病毒的长度可达4000纳米。流感病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白以及核心三部分。病毒的核心包含了存贮病毒信息的遗传物质以及复制这些信息必须的酶。流感病毒的遗传物质是单股负链rna，简写为ss-rna，ss-rna与核蛋白 (np)相结合，缠绕成核糖核蛋白体，以密度极高的形式存在。除了核糖核蛋白体，还有负责rna转录的rna多聚酶。
4.甲型和乙型流感病毒的rna由8个节段组成，丙型流感病毒则比它们少一个节段，第1、2、3个节段编码的是rna多聚集酶，第4个节段负责编码血凝素；第5个节段负责编码核蛋白，第6个节段编码的是神经氨酸酶；第7个节段编码基质蛋白，第8个节段编码的是一种能起到拼接rna功能的非结构蛋白，这种蛋白的其他功能尚不得而知。丙型流感病毒缺少的是第六个节段，其第四节段编码的血凝素可以同时行使神经氨酸酶的功能。
5.基质蛋白构成了病毒的外壳骨架，实际上骨架中除了基质蛋白 (m1)之外还有膜蛋白 (m2)。m2蛋白具有离子（主要是na ）通道和调节膜内ph值的作用，但数量很少。基质蛋白与病毒最外层的包膜紧密结合起到保护病毒核心和维系病毒空间结构的作用。当流感病毒在宿主细胞内完成其繁殖之后，基质蛋白是分布在宿主细胞细胞膜内壁上的，成型的病毒核衣壳能够识别宿主细胞膜上含有基质蛋白的部位，与之结合形成病毒结构，并以出芽的形式突出释放成熟病毒。
6.包膜是包裹在基质蛋白之外的一层磷脂双分子层膜，这层膜来源于宿主的细胞膜，成熟的流感病毒从宿主细胞出芽，将宿主的细胞膜包裹在自己身上之后脱离细胞，去感染下一个目标。包膜中除了磷脂分子之外，还有两种非常重要的糖蛋白：血凝素和神经氨酸酶。这两类蛋白突出病毒体外，长度约为10至40纳米，被称作刺突。一般一个流感病毒表面会分布有500个血凝素刺突和100个神经氨酸酶刺突。在甲型流感病毒中血凝素和神经氨酸酶的抗原性会发生变化，这是区分病毒毒株亚型的依据。
7.流感病毒感染具有自限性，但在婴幼儿、老年人和存在心肺基础疾病的患者容易
并发肺炎等严重并发症而导致死亡。一般出现于冬季，北半球通常在1、2月份达到高峰，南半球的流行时间较晚，热带地区可常年发病。世界性大流行常有2～3个流行波，一般流行3～4周会自然停止。世界卫生组织估计北半球每年1亿人感染流感，5000万次就诊，30万次住院，主要是高危人群和老年人，每年1万人死于流感，主要是虚弱的老年人。
8.新型冠状病毒肺炎是一种急性感染性肺炎，其病原体是一种先前末在人类中发现的新型冠状病毒，即2019新型状病毒。2020年2月7日，国家卫健委決定将“新型冠状病毒感染的肺炎“暂命名为“新型冠状病毒肺炎”，简称“新冠肺炎”。2月11日，世界卫生组织(who)将其英文名称为 corona virus disease 2019。2月22日，国家卫健委決定将『“新型冠状病毒肺炎”英文名称修订为＂ covid-19”，与世界卫生组织命名保持一致，中文名称保持不变。2020年1月30日，who直布将新型冠状病毒肺炎疫情列为国际关注的突发公共卫生事件(phec)。患者初始症状多为发热、乏力和干咳，并逐渐出现呼吸困难等严重表现。多数患者预后良好，部分严重病例可出现急性呼吸着迫综合征或脓毒症休克，甚至死亡。目前缺乏针对病原体的有效抗病毒药物，以隔离治疗、对正支持治疗为主。
9.本发明提供一种甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测方法与试剂盒，该方法采用多多重荧光pcr扩增进行甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒鉴别检测。根据taqman引物探针设计原则，选择在甲型流感病毒的m2基因、乙型流感病毒m2基因以及新型冠状病毒orf1ab基因、n基因为靶序列设计特异性引物和探针，通过多通道荧光pcr扩增检测甲型/乙型流感病毒和新型冠状病毒。本发明还引入内源性的内参照系统，用于监测样本取样质量以避免检测结果的假阴性。和现有流感病毒、新型冠状病毒核酸检测公开技术比较，本发明的检测结果稳定可靠，试剂盒使用方便，检测灵敏度高。


技术实现要素：

10.本发明的目的之一是提供一种甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测方法，另一目的是提供一种甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测试剂盒。
11.本发明中甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测分别基于甲型/乙型流感病毒的m2基因、新型冠状病毒的orf1ab和n基因设计引物探针，优选的靶序列分别为：seq id no.13、seq id no.14、seq id no.15、seq id no.16，并根据靶序列分别设计甲流m2基因、乙流m2基因、新型冠状病毒orf1ab和n基因特异性引物和探针序列，引物序列分别为：seq id no.1、seq id no.2、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.10、seq id no.11，探针序列分别为seq id no.3、seq id no.6、seq id no.9、seq id no.12，taqman探针5’端分别标记不同的荧光基团标记（fam、vic/joe/hex、rox/texas red或者cy5），3’端均标记相同的bhq淬灭基团。
12.本发明还提供一种人内源性内参照系统，内参引物为seq id no.17、seq id no.18，内参探针为seq id no.19，内参探针5’端均标记与目的检测探针不同的荧光基团标记（fam、vic/joe/hex、rox/ texas red或者cy5），3’端标记bhq淬灭基团。
13.本发明提供一种甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测试剂盒，采用多重荧光pcr对甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒核酸定性检测。在使用上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法纯化试剂（核酸提取及纯化试剂（产品型号：通用型））对咽拭子或痰液样本进行全自动核酸提取后，直接配制反应体系进行扩增，并通过扩增曲线进行结果分型
分析，反应体系配制方便，pcr产物无需开盖分析，并且体系中引入了dutp-ung酶系统防止pcr产物污染。
14.本发明提供了一种甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测方法，同时提供了一种甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒核酸检测试剂盒。
15.1.实时荧光pcr引物的设计通过对文献检索、ncbi下载病原体序列分析确定：分别基于甲型/乙型流感病毒的m2基因、新型冠状病毒的orf1ab和n基因设计引物探针，进行引物优化设计。荧光pcr扩增检测技术中引物设计的规则为：(1)避免引物自身或引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发夹结构；(2)典型的引物18-24个核苷酸长，引物需足够长，保证序列独特性,并降低非特异性；(3)tm值在55-65℃，gc含量在40%-60%；(4)引物之间的tm值避免相差2℃；(5)引物的3’端避免使用碱基a，引物3’端避免出现3个或者3个以上连续相同的碱基；(6) taqman探针技术要求片段长度在50-250bp之间；(7)引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的g和c。
16.按照荧光pcr设计的原则，基于基于甲型/乙型流感病毒的m2基因、新型冠状病毒的orf1ab和n基因设计引物序列如下：上游引物为：5
’-ꢀ
ggaatggctaaagacaagacc-3’如seq id no.1所示；5
’-ꢀ
gtcgctgtttggagacacaattgcc
ꢀ-3’
如seq id no.4所示；5
’-ꢀ
aatgatgatactctctgacgatgctgttg-3’如seq id no.7所示；5
’-
ggaagtcacaccttcgggaacgtggttg-3’，如seq id no.10所示；下游引物为：5
’-ꢀ
cgtctacgctgcagtcctcgctcac-3’，如seq id no.2所示；5
’-ꢀ
gtcaaattctttcccaccgaaccaacag-3’，如seq id no.5所示；5
’-
cattgttttgataataaagaactgacttaaag-3’，如seq id no.8所示；5
’-
cagcaaaatgacttgatctttgaaatttgg-3’，如seq id no.11所示。
17.2.taqman荧光探针的设计taqman探针设计原则为：(1)探针长度应在15bp-45bp(最好20-30bp)，保证结合特异性；(2)探针的dna折叠和二级结构尽量避开；(3) tm值在65-70℃,通常比引物tm值高5-10℃(至少5℃)，以确保在退火过程中探针先于引物与目的片段结合，gc含量在40%-60%；(4)探针的5’端尽量避免使用g鸟嘌呤；(5)整条探针中碱基c的含量要明显高于g含量。分别基于甲型/乙型流感病毒的m2基因、新型冠状病毒的orf1ab和n基因设计引物探针，扩增片段分别为：seq id no.13、seq id no.14、seq id no.15、seq id no.16，设计的taqman探针序列分别为：seq id no.3、seq id no.6、seq id no.9、seq id no.12。
18.甲型流感病毒探针序列为：5
’-ꢀ
gtttgttttcacgctcaccgtgcc
ꢀ-3’
，5’端标记fam(6-羧基荧光素)，3’端标记bhq1，如seq id no.3所示乙型流感病毒探针序列为：5
’-ꢀ
gacagaagatggagaaggcaaagcagaactagc-3’，5’端标记fam，3’端标记bhq1，如seq id no.6所示；
新型冠状病毒orf1ab基因探针序列为：5
’-ꢀ
gtttcaatagcacttatgcatctcaaggtctagt-3’，5’端标记joe，3’端标记bhq1，如seq id no.9所示；新型冠状病毒n基因探针序列为：5
’-
gacctacacaggtgccatcaaattggatgac-3’，5’端标记rox，3’端标记bhq2，如seq id no.12所示。
19.3.内参照系统设计本发明中按taqman探针荧光pcr原则设计了内源性内参照系统，用于监测样本的取样、提取和扩增，避免检测结果假阴性，内参照系统包括内参引物和探针，根据taqman荧光pcr设计原则，设计的引物和探针序列如下：5
’-ꢀ
catgccaattccctaaaatgtaag
ꢀ-3’
，如seq id no.17所示；5
’-ꢀ
gacctcagccagtcctccac-3’，如seq id no.18所示；5
’-ꢀ
tctgc ctatg gcttg accag gcag-3’，5’端标记cy5荧光基团，3’端标记bhq2，如seq id no.19所示。
20.4. 试剂盒制备含有上述引物和探针的甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测试剂盒 (荧光pcr法)(32人份)，其主要组分如下：(1)flua/b/ncov反应液，448μl/管配制方法：在4.34ml超纯水中依次加入10*pcr buffer（含100mm ph8.3的tris-hcl、750mm kcl）3.0ml，20mm dntps（包括datp、dgtp、dctp）3.0ml，20mm dutp 3.0ml，0.55mol/l mgcl
2 0.3ml，200pmol/μl的seq id no.1、seq id no.2、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.10、seq id no.11原料各45μl，200pmol/μl 的seq id no.3、seq id no.6、seq id no.9、seq id no.12、seq id no.13、seq id no.14、seq id no.15原料各15μl，震荡混匀后以448μl/管分装，即为试剂盒中flua/b/ncov反应液。
21.(2)rt-pcr酶，192μl/管配制方法：在5.304ml酶稀释液（从珠海宝锐生物技术有限公司外购）中加入taq-dna聚合酶（5u/μl）0.3ml、逆转录酶（200u/μl）60μl和ung酶（1u/μl）0.3ml，颠倒多次混匀，终体积为30.0ml，以192μl/管分装即为试剂盒dna聚合酶。
22.(3)阴性对照，200μl293t基因组浓度为100ng/ml的生理盐水，200μl/管分装。
23.(4)阳性对照，200μl293t基因组浓度为100ng/ml的生理盐水稀释的10
3 copies/
µ
l的甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒慢病毒。
24.将上述组分(1)～(4)分别进行抽检，检验合格后进行包装。
25.上述组装的试剂盒在-20℃保存，冻融次数应小于3次。
26.由(1)～(3)及模板配制的30μl反应体系，每个反应中加入flua/b/ncov反应液14μl、rt-pcr酶6μl，或者按比例配制公共体系后以20μl/反应进行分装，分装后每管中加入10μl提取的核酸样本。
27.3.试剂盒使用方法
本发明试剂盒在样本检测过程中使用方法之一如下：(1)样本提取取临床采集的咽拭子或痰液样本，吸取咽拭子或痰液（经消化液预处理）200μl置于上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法纯化试剂（核酸提取及纯化试剂（产品型号：通用型））96孔核酸提取板的a1-h1、a7-h7孔中，按照提取试剂盒说明书的要求设置自动提取程序进行核酸提取，提取板的a5-h5、a11-h11孔为提取的核酸用于荧光pcr扩增检测。试剂盒阴性、临界阳性对照和阳性对照处理方法和样品液相同。
28.(2)扩增检测按照发明内容中的方法，启封试剂盒，将各组分冻融振荡混匀后配制反应预混液，其配制方法如下：a 按反应样本数（反应样本数＝待检样品数＋对照品2个＋1）n配制反应液：取flua/b/ncov反应液n
×
14μl、rt-pcr酶n
×
6μl于一离心管中混匀；低速离心数秒，按20μl/管分装到反应管中，再分别加入10μl提取待检测的核酸。
29.b 取样本提取物、对照品提取物各10μl分别加入反应管中，低速离心数秒，取出置全自动荧光pcr仪上。
30.c 荧光pcr反应程序如下：[1] 50℃
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10 min[2] 95℃
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3 min[3] 93℃
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3 s[4] 60℃
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30 s[5] go to [3] ，5 cycles[6] 93℃
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3 s[7] 60℃
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30 s[8] go to [6] ，40 cycles，在第七步采集fam、joe、rox和cy5通道荧光信号end。
[0031]
注：仪器pcr程序运行完成后按仪器及软件要求进行结果保存和数据分析。cy5通道检测结果应符合下表要求：32<ct
cy5
4. 有益效果本发明分别以甲型流感病毒的m2基因、乙型流感病毒m2基因以及新型冠状病毒orf1ab基因、n基因为靶序列设计特异性引物和taqman探针，通过多通道荧光pcr扩增检测甲型/乙型流感病毒和新型冠状病毒，通过模拟验证和实验验证，最后组研制出甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测试剂盒(荧光pcr法)，其主要特点如下：(1) 采用甲型流感病毒的m2基因、乙型流感病毒m2基因以及新型冠状病毒orf1ab基因、n基因片段序列，根据文献报道优化设计引物。
[0032]
(2) 引入内源性内参照系统，可以监测采样、提取和扩增整个过程，可以尽可能的避免假阳性和假阴性结果。
[0033]
(3)扩增体系中的 dutp-ung 酶系统更进一步避免了因扩增产物污染导致的结果假阳性。
具体实施方式
[0034]
以下为该发明结合具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
[0035]
实施例1甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测试剂盒(荧光pcr法)1.引物探针合成委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成引物探针，合成的引物探针序列具体如下：上游引物为：5
’-ꢀ
ggaatggctaaagacaagacc-3’如seq id no.1所示；5
’-ꢀ
gtcgctgtttggagacacaattgcc
ꢀ-3’
如seq id no.4所示；5
’-ꢀ
aatgatgatactctctgacgatgctgttg-3’如seq id no.7所示；5
’-
ggaagtcacaccttcgggaacgtggttg-3’，如seq id no.10所示；下游引物为：5
’-ꢀ
cgtctacgctgcagtcctcgctcac-3’，如seq id no.2所示；5
’-ꢀ
gtcaaattctttcccaccgaaccaacag-3’，如seq id no.5所示；5
’-
cattgttttgataataaagaactgacttaaag-3’，如seq id no.8所示；5
’-
cagcaaaatgacttgatctttgaaatttgg-3’，如seq id no.11所示。
[0036]
甲型流感病毒探针序列为：5
’-ꢀ
gtttgttttcacgctcaccgtgcc
ꢀ-3’
，5’端标记fam(6-羧基荧光素)，3’端标记bhq1，如seq id no.3所示乙型流感病毒探针序列为：5
’-ꢀ
gacagaagatggagaaggcaaagcagaactagc-3’，5’端标记fam，3’端标记bhq1，如seq id no.6所示；新型冠状病毒orf1ab基因探针序列为：5
’-ꢀ
gtttcaatagcacttatgcatctcaaggtctagt-3’，5’端标记joe，3’端标记bhq1，如seq id no.9所示；新型冠状病毒n基因探针序列为：5
’-
gacctacacaggtgccatcaaattggatgac-3’，5’端标记rox，3’端标记bhq2，如seq id no.12所示。
[0037]
合成后用无菌双蒸水溶解至浓度为200μm或者500μm，-20℃保存。
[0038]
2. flua/b/ncov反应液，448μl/管配制方法：在4.34ml超纯水中依次加入10*pcr buffer（含100mm ph8.3的tris-hcl、750mm kcl）3.0ml，20mm dntps（包括datp、dgtp、dctp）3.0ml，20mm dutp 3.0ml，0.55mol/l mgcl
2 0.3ml，200pmol/μl的seq id no.1、seq id no.2、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.10、seq id no.11原料各45μl，200pmol/μl 的seq id no.3、seq id no.6、seq id no.9、seq id no.12、seq id no.13、seq id no.14、seq id no.15原料各15μl，震荡混匀后以448μl/管分装，即为试剂盒中flua/b/ncov反应液。
[0039]
3.rt-pcr酶，192μl/管
配制方法：在5.304ml酶稀释液（从珠海宝锐生物技术有限公司外购）中加入taq-dna聚合酶（5u/μl）0.3ml、逆转录酶（200u/μl）60μl和ung酶（1u/μl）0.3ml，颠倒多次混匀，终体积为30.0ml，以192μl/管分装即为试剂盒dna聚合酶。
[0040]
4. 阴性对照，200μl293t基因组浓度为100ng/ml的生理盐水，200μl/管分装。
[0041]
5.阳性对照，200μl293t基因组浓度为100ng/ml的生理盐水稀释的10
3 copies/
µ
l的甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒慢病毒。
[0042]
将上述组分2-5分别进行抽样检验，检验合格后进行包装。
[0043]
上述组装的试剂盒在-20℃保存，冻融次数应小于3次。
[0044]
试剂盒制备工艺简述如下：(1)合成的引物探针定量配制、浓度检测、抽样质检。
[0045]
(2)将flua/b/ncov反应液，448μl/管rt-pcr酶，192μl/管无菌分装，抽样质检。
[0046]
(3)将阴性、阳性对照品进行浓度测定、分装，抽样质检。
[0047]
(4)组装成品试剂盒，保存于-20℃。
[0048]
实施例2甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测试剂盒(荧光pcr法)的应用采用本发明所得试剂盒对200例临床样本进行测试，与临床诊断结果做对比评价试剂盒效果。
[0049]
1. 甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测试剂盒(荧光pcr法)检测临床样本(1) 试剂配制按反应样本数（反应样本数＝待检样品数＋对照品2个＋1）n配制反应液：取flua/b/ncov反应液n
×
14μl、rt-pcr酶n
×
6μl于一离心管中混匀；低速离心数秒，按20μl/管分装到反应管中。分装后反应管可在2～8℃放置3小时。
[0050]
(2) 核酸提取将取样管中的咽拭子洗脱液或痰液消化液200μl，采用上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法纯化试剂（核酸提取及纯化试剂（产品型号：通用型））进行核酸提取。
[0051]
核酸提取完成后，核酸提取液用于pcr检测，或将核酸提取液转移到离心管中于-20℃保存。
[0052]
(3) 样本及对照品加样取阴性对照、阳性对照、临界阳性对照以及待检样本核酸提取液各10μl分别加入反应管中，低速离心数秒，取出置实时荧光定量pcr仪上。
[0053]
(4) pcr扩增分析将 pcr扩增管按顺序放入pcr仪，设置如下的反应程序[1] 50℃
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3 min[3] 93℃
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3 s[4] 60℃
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30 s[5] go to [3] ，5 cycles[6] 93℃
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3 s
[7] 60℃
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30 s[8] go to [6] ，40 cycles，在第七步采集fam、joe、rox和cy5通道荧光信号end。
[0054]
结果分析2. 甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测试剂盒(荧光pcr法)检测200例临床样本，其中新型冠状病毒阳性35例，流感病毒50例，与临床诊断结果一致。