靶向抗TNF-α抗体的组合物和方法与流程

靶向抗tnf
‑
α
抗体的组合物和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年7月16日提交的pct申请号pct/cn2020/102367的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
技术领域
3.本公开大体上涉及包括用免疫抑制药物治疗的治疗学。具体而言，本公开涉及用于提高对用治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体进行的治疗的反应的组合物和方法。


背景技术：

4.近年来，治疗性单克隆抗体在治疗癌症、自身免疫性疾病和其他适应症中的用途经历了显著的扩展。与治疗性抗体相关的众所周知的副作用是产生抗药物抗体(anti
‑
drug antibody,ada)，它干扰治疗效果。ada可导致治疗性抗体的清除率提高，并阻止药物与目标结合。尽管它们很重要，但人们对ada的分子概貌及其形成所涉及的机制并不完全了解，更不用说可能的缓解策略。开发嵌合、人源化和全人抗体的努力并没有完全消除治疗性抗体的免疫原性和相关的ada诱导。
5.靶向肿瘤坏死因子α(tnf
‑
α)的治疗性单克隆抗体已被广泛用于临床治疗类风湿性关节炎、炎症性肠病和其他慢性炎症相关病症，如牛皮癣、牛皮癣性关节炎和强直性脊柱炎。目前，至少五种抗tna
‑
α单克隆抗体已被批准用于各种适应症。ada的形成与所有五种药剂有关(van schouwenburg pa等人nat rev rheumatol,2013l 9(3):164，vaisman
‑
mentesh a等人,front.immunol.,2019；10:2921)。研究表明，ada的存在损害了抗tna
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α抗体的临床反应和/或引发不良事件，导致包括增加剂量或给药频率、同时使用免疫调节药物、停止治疗或改用其他tnf
‑
α拮抗剂的医疗后果(atiqi s等人,front immunol.2020；11:312，homann a等人j transl med(2015)13:339)。因此，需要消除ada，以提高临床反应和/或消除与治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体相关的不良事件。


技术实现要素：

6.在一个方面，本公开提供了一种编码嵌合抗药物抗体受体(cadar)的多核苷酸。在一些实施方案中，嵌合抗药物抗体受体包含胞外域、跨膜域和胞内信号传导域，所述胞外域包含治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段与b细胞上表达的b细胞受体(bcr)结合，其中表达cadar的细胞与b细胞上表达的bcr结合，或诱导杀伤表达抗药物抗体的b细胞。
7.在一些实施方案中，免疫原性片段包含治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体的重链可变区或轻链可变区，与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3、4、5个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方案中，免疫原性片段包含scfv，其包含治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区，与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3、4、5个氨基酸残基差异的序列。
8.在一些实施方案中，治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体选自阿达木单抗(adalimumab)、英利昔单抗(infliximab)、阿非莫单抗(afelimomab)、戈利木单抗(golimumab)和赛妥珠单抗(certolizumab)。在一些实施方案中，免疫原性片段包含如表1中所列的重链可变区或轻链可变区，与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3、4、5个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方案中，免疫原性片段包含scfv，其包含如表1中所列的成对的重链可变区和轻链可变区，与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3、4、5个氨基酸残基差异的序列。
9.在一些实施方案中，治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体是阿达木单抗，并且免疫原性片段包含(a)一个或多个选自表2所列序列组的序列，或一个或多个与其具有至少90％同一性的序列，或一个或多个与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列；或(b)阿达木单抗的tnf
‑
α结合片段，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列；或(a)和(b)的组合。
10.在一些实施方案中，治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体是英利昔单抗，并且免疫原性片段包含(a)一个或多个选自表3所列序列组的序列，或一个或多个与其具有至少90％同一性的序列，或一个或多个与表3所列序列组中的任一个具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列；或(b)英利昔单抗的tnf
‑
α结合片段，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列；或(a)和(b)的组合。
11.在一些实施方案中，嵌合受体还包含cd8α的信号肽。在一些实施方案中，cd8α的信号域包含seq id no:20的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
12.在一些实施方案中，跨膜域包含cd8α的跨膜域。在一些实施方案中，cd8α的跨膜域包含seq id no:21的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3、4、5个氨基酸残基差异的序列。
13.在一些实施方案中，胞外域通过铰链区连接至跨膜域。在一些实施方案中，铰链区包含cd8α的铰链区。在一些实施方案中，cd8α的铰链区包含seq id no:22的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3、4、5个氨基酸残基差异的序列。
14.在一些实施方案中，胞内域包含共刺激域和信号传导域。在一些实施方案中，共刺激域包含cd137的胞内域。在一些实施方案中，cd137的胞内域包含seq id no:23的序列或与其具有至少95％同一性的序列。
15.在一些实施方案中，胞内域包含cd3ζ的信号传导域。在一些实施方案中，cd3ζ的信号传导域包含seq id no:24的序列或与其具有至少95％同一性的序列。
16.在另一个方面，本公开提供了由如本文所述的多核苷酸编码的多肽。
17.在另一个方面，本公开提供了包含如本文所述的多核苷酸的载体，其中编码cadar的多核苷酸可操作地连接于至少一个调节性多核苷酸元件以用于表达cadar。
18.在一些实施方案中，载体是质粒载体、病毒载体、转座子、定点插入载体或自杀式表达载体。在一些实施方案中，载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或aav载体。
19.在另一个方面，本公开提供了一种包含如本文所述的载体的工程细胞。
20.在一些实施方案中，工程细胞是t细胞或nk细胞。
21.在另一个方面，本公开提供了一种提高有需要的受试者对用治疗性抗tnfα单克隆
抗体进行的治疗的反应的方法，其包括施用有效量的如本文所述的工程细胞。
22.在一些实施方案中，受试者患有选自类风湿性关节炎(ra)、幼年特发性关节炎(jia)、牛皮癣性关节炎(psa)、强直性脊柱炎(as)、成人克罗恩氏病(cd)、小儿克罗恩氏病、溃疡性结肠炎(uc)、斑块状牛皮癣(ps)、化脓性汗腺炎(hs)和葡萄膜炎(uv)的病况。
23.在一些实施方案中，受试者对用治疗性抗tnfα单克隆抗体进行的治疗没有反应或失去初始反应。在一些实施方案中，治疗性抗tnfα单克隆抗体在受试者中诱导抗药物抗体。
24.在一些实施方案中，工程细胞是自体细胞。在一些实施方案中，工程细胞是同种异体细胞。
25.在一些实施方案中，所述方法还包括施用增加工程细胞的功效的药剂。在一些实施方案中，所述方法还包括施用改善与施用工程细胞相关的副作用的药剂。
26.附图简要说明
27.并入本文的附图构成本说明书的一部分。与此书面描述一起，附图进一步用于解释本公开的原理，并使相关领域的技术人员能够制造和使用本公开。
28.图1示出了在工程t细胞上表达的嵌合抗药物抗体受体(cadar)靶向在某些b细胞上表达的b细胞受体(bcr)，这些b细胞产生针对阿达木单抗的ada。
29.图2示出了示例性cadar构建体的示意图。
具体实施方式
30.在更详细地描述本公开之前，应理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，因此当然可能会有变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而无意于为限制性的，因为本公开的范围将仅由所附权利要求书限制。
31.除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料也可以用于本公开的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。
32.在本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，就如同每个单独的出版物或专利均被具体和单独指示为通过引用并入一般，并且通过引用并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。对任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内容，不应解释为承认本公开无权凭借在先公开而早于此类出版物。此外，提供的出版日期可能与可能需要独立确认的实际出版日期不同。
33.如对本领域技术人员而言，在阅读本公开后将显而易见的是，本文描述和说明的个别实施方案中的每一个具有离散的组件和特征，其可以在不脱离本公开的范围或精神的情况下，容易地与其他若干实施方案中的任何一个的特征分离或组合。任何叙述的方法可以按照叙述的事件的顺序或逻辑上可能的任何其他顺序进行。
34.定义
35.提供以下定义以帮助读者。除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他科学或医学术语旨在具有本领域技术人员通常理解的含义。在某些情况下，为了清楚和/或易于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且在本文中包括此类定义不一定应被解释为表示与本领域通常理解的术语的定义相比具有实质性差异。
36.如本文所用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一(a/an)”和“所述”包括
复数个指代物。
[0037]“抗原”是指引起免疫反应的分子。这种免疫反应可以是体液反应，或细胞介导的反应，或两者兼有。本领域技术人员应理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。显而易见，本公开包括用作抗原引发免疫反应的治疗性抗体。
[0038]“抗体”是指与抗原结合的免疫球蛋白(ig)家族的多肽。例如，天然存在的igg类型的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链的四聚体。每条重链由重链可变区(本文缩写为vh)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个域ch1、ch2和ch3构成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为vl)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个域(本文缩写为cl)构成。vh和vl区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，其间散布着更保守的区，称为框架区(fr)。每个vh和vl由三个cdr和四个fr构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。
[0039]“单克隆抗体”是指由相同的免疫细胞制造的抗体，所述免疫细胞是唯一亲本细胞的所有克隆。
[0040]“抗独特型抗体”是指与另一种抗体的独特型结合的抗体。
[0041]“独特型”是指位于抗体可变区的免疫球蛋白分子的抗原决定簇。
[0042]“抗药物抗体”或“ada”是指由治疗性药物，包括治疗性抗体在体内引发的抗体。ada针对治疗性药物的免疫原性部分，并且可能会影响用治疗性抗体进行的治疗的疗效、药代动力学和安全性。
[0043]“自体”细胞是指源自同一受试者的任何细胞，所述细胞随后将被重新引入。
[0044]“同种异体”细胞是指源自相同物种的不同受试者的任何细胞。
[0045]“b细胞受体”或“bcr”是指b细胞表面上识别特定抗原的跨膜免疫球蛋白分子。
[0046]“嵌合抗药物抗体受体”或“cadar”是指一种工程受体，能够将针对抗药物抗体的所需特异性移植到能够进行细胞介导的细胞毒性的免疫细胞中。通常，cadar是一种融合多肽，其包含胞外域、跨膜域和胞内域，胞外域引入所需特异性，胞内域在免疫细胞与抗药物抗体或特定bcr结合时，将信号传递给免疫细胞。
[0047]“共刺激配体”是指抗原呈递细胞(例如apc、树突状细胞、b细胞等)上的分子，其与t细胞上的同源共刺激分子特异性结合，从而提供信号，除了由例如tcr/cd3复合物与装载有肽的主要组织相容性复合物(mhc)分子结合而提供的初级信号外，还介导t细胞反应，包括但不限于增殖、激活、分化等。
[0048]“共刺激分子”是指t细胞上的同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性结合，从而介导t细胞的共刺激反应，例如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于mhc i类分子、btla和toll配体受体。
[0049]
在免疫细胞的上下文中使用的“效应细胞”是指可被激活以响应刺激而执行效应功能的细胞。效应细胞可包括但不限于nk细胞、细胞毒性t细胞和辅助t细胞。
[0050]“有效量”或“治疗有效量”是指有效实现所需生物学结果的在此描述的细胞、组合物、制剂或任何材料的量。此类结果可包括但不限于消除表达特定bcr的b细胞和由此产生的抗体。“表位”或“免疫原性片段”或“抗原决定簇”是指抗体或其抗原结合片段所识别的抗原的一部分。表位可以是线性的或构象的。
[0051]
多肽或多核苷酸上下文中的“同一性”或“序列同一性”的百分比是通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定的，其中多核苷酸或多肽序列在比较窗口中的部分可能包括与参考序列(不包括添加或缺失)相比的添加或缺失(即间隙)，以便对两个序列进行最佳比对。如下计算百分比：确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置数，得出匹配的位置数，用匹配的位置数除以比较窗口中的总位置数，并且将结果乘以100，得出序列同一性的百分比。
[0052]“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸序列之间的功能关系。在编码融合蛋白(如本公开的cadar的多肽链)的多核苷酸的上下文中，该术语是指两个或更多个多核苷酸序列接合，使得这些片段编码的氨基酸序列保持在读框内。在转录或翻译调节的上下文中，该术语是指调节序列与编码序列的功能关系，例如，启动子在编码序列的正确位置和方向上，以便调节转录。
[0053]“免疫原性”或“免疫原性的”是指外来物质如抗原在受试者体内引起免疫反应的能力。免疫原性反应通常包括免疫反应的细胞介导支路和体液支路。如在治疗性抗体的上下文中所使用，“免疫原性片段”是指引发宿主的免疫反应的抗体区域。这种反应可导致产生针对治疗性抗体的抗药物抗体(ada)，从而损害治疗的治疗效果。
[0054]“多核苷酸”或“核酸”是指核苷酸链。如本文所用，多核苷酸包括通过本领域可用的任何手段获得的所有多核苷酸序列，所述手段包括但不限于通过合成手段的重组手段。
[0055]“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指通过肽键共价连接的氨基酸残基链。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
[0056]“单链fv抗体”或“scfv”是指由轻链可变区直接或通过肽接头序列与重链可变区融合而成的工程抗体。
[0057]“t细胞受体”或“tcr”是指t细胞表面上的蛋白质复合物，其负责将抗原片段识别为与mhc分子结合的肽。
[0058]“肿瘤坏死因子α”或“tnf
‑
α”是一种主要由单核细胞或巨噬细胞分泌的多功能促炎性细胞因子，其对脂质代谢、凝血、胰岛素抗性和内皮功能具有影响。tnf与炎症性疾病、自身免疫性疾病、病毒、细菌和寄生虫感染、恶性肿瘤和/或神经退行性疾病有关，是特定生物疗法的有用目标。
[0059]“载体”是指可操作地插入多核苷酸，以便递送、复制或表达多核苷酸的载体。载体可以含有多种调节元件，包括但不限于复制起点、启动子、转录起始序列、增强子、可选标记基因和报告基因。载体还可以包括帮助其进入宿主细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或离子或两亲化合物。
[0060]
注意，在本公开中，如“包含(comprises/comprised/comprising)”、“含有(contains/containing)”等的术语具有美国专利法中赋予的含义；它们是包容性的或开放式的，并且不排除额外未引用的要素或方法步骤。如“基本上由
……
组成(consisting essentially of/consists essentially of)”的术语具有美国专利法赋予的含义；它们允许包括不会实质上影响要求保护的发明的基本和新颖特征的额外成分或步骤。术语“由
……
组成(consists of/consisting of)”具有美国专利法赋予它们的含义；即这些术语是封闭式的。
[0061]
嵌合抗药物抗体受体
[0062]
靶向tnf
‑
α的治疗性单克隆抗体已被广泛用于临床治疗类风湿性关节炎、炎症性肠病和其他慢性炎症相关病症，如牛皮癣、牛皮癣性关节炎和强直性脊柱炎。与治疗性抗tnf
‑
α抗体相关的众所周知的副作用是产生抗药物抗体(ada)，这导致治疗性抗体的清除率提高并阻止药物与目标结合，从而干扰治疗效果。
[0063]
在一个方面，本公开涉及嵌合抗药物抗体受体(cadar)，其与某些b细胞上表达的b细胞受体(bcr)特异性结合，这些b细胞产生针对治疗性抗tnf
‑
α抗体的ada(图1)。当cadar在效应细胞(如t细胞)上表达时，cadar使效应细胞特异性地靶向这些b细胞，诱导杀伤这些b细胞，但不表达和显示针对治疗性抗tnf
‑
α抗体的ada的b细胞则保持完整。消除产生ada的b细胞提高治疗性抗tnf
‑
α抗体的治疗功效，并减轻与ada相关的不良作用。
[0064]
在一个方面，本公开提供了一种cadar，其包含胞外域、跨膜域和胞内信号传导域，而胞外域包含治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体的免疫原性片段。
[0065]
在另一个方面，本公开提供了编码本文所述的cadar的多核苷酸。
[0066]
胞外域
[0067]
在一些实施方案中，本文所述的cadar的胞外域包含治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体的免疫原性片段。当免疫原性片段被针对治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体的ada识别时，免疫原性片段与表达这种ada的b细胞的bcr特异性结合。
[0068]
本公开的免疫原性片段可以源自本领域已知的任何治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体，例如在专利us6258562b1、us6284471b1、ep2185201a1、us8241899b2、us8603778b2、us7521206b2、us7012135b2、us7186820b2、us7402662b2和cn1289671c中公开的那些。在一些实施方案中，本公开的免疫原性片段所源自的治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体选自阿达木单抗、英利昔单抗、阿非莫单抗和戈利木单抗。应注意，当提到抗tnf
‑
α抗体，例如阿达木单抗时，除非上下文另有规定，否则也包括其片段、衍生物和修饰。
[0069]
在一些实施方案中，本公开的免疫原性片段所源自的治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体包含表1中列出的重链和轻链可变区序列。
[0070]
表1.示例性抗tnf
‑
α单克隆抗体的序列.
[0071][0072]
在某些实施方案中，治疗性抗tnf
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α单克隆抗体的免疫原性片段包括由针对治疗性抗体的ada识别的表位。已经发现，ada可以是针对治疗性单克隆抗体的抗原结合区的抗独特型抗体，从而阻止治疗性抗体与tnf
‑
α结合。
[0073]
例如，阿达木单抗中免疫原性片段的序列已由homann a等人(theranostics,2017；7(19):4699)和van schouwenburg pa等人(j biol chem.2014；289(50):34482)绘制。表2中示出了阿达木单抗的示例性免疫原性片段。
[0074]
表2.阿达木单抗的免疫原性片段.
[0075]
seq id no.序列位置11amhwvrqvh
12tavyycakvsyvh13asqgirnylawvl14vatyycqrynrvl15skltvdksrwqqgfc
[0076]
同样，英利昔单抗中免疫原性片段的序列已由homann等人(j transl med(2015)13:339)绘制。表3中示出了英利昔单抗的示例性免疫原性片段。
[0077]
表3.英利昔单抗的示例性免疫原性片段.
[0078]
seq id no.序列位置16nhwmnwvrqspekglvh17edtgvyycsrnyygsvh18qfvgssihwyqqrtnvl19ycqqshswpftfgsgvl
[0079]
在一些实施方案中，治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体是阿达木单抗，并且cadar的胞外域包含一个或多个选自表2所列序列组的序列，或一个或多个与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列，或一个或多个与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
[0080]
在一些实施方案中，治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体是英利昔单抗，并且cadar的胞外域包含一个或多个选自表3所列序列组的序列，或一个或多个与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列，或一个或多个与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
[0081]
在一些实施方案中，cadar的胞外域包含治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体的一个或多个抗原结合片段。如本文所用，“抗原结合片段”是指包含一个或多个cdr的抗体的一部分，或与抗原结合但不包含完整原生抗体结构的任何其他抗体片段。可以理解，抗tnf
‑
α单克隆上下文中的抗原结合片段是指与tnf
‑
α结合的抗体部分。可用于本公开的抗原结合片段包括但不限于scfv或其片段(例如vl、vh、cdr)。在一些实施方案中，抗原结合片段是源自表1中所列抗tnf抗体的scfv。在一些实施方案中，scfv包含如表1中所列的成对的重链可变区和轻链可变区。
[0082]
在一些实施方案中，治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体是阿达木单抗，并且cadar的胞外域包含以下的组合：(a)一个或多个选自表2所列序列组的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列，或一个或多个与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列；和(b)阿达木单抗的抗原结合片段，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列，或一个或多个与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
[0083]
在一些实施方案中，治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体是英利昔单抗，并且cadar的胞外域包含以下的组合：(a)一个或多个选自表3所列序列组的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列，或一个或多个与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列；和(b)英利昔单抗的抗原结合片段，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列，或一个或多个与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
[0084]
在一些实施方案中，胞外域还包含信号肽。如本文所用，术语“信号肽”是指存在于多肽的n端，通常具有5
‑
30个氨基酸残基的长度，是分泌途径上跨膜转位和控制多肽进入分泌途径所必需的肽。
[0085]
在一些实施方案中，信号肽包含cd8α的信号肽：在一些实施方案中，cd8α的信号肽包含seq id no:20的序列或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，信号肽包含igg的信号肽。
[0086]
跨膜域
[0087]
本文所述的cadar的跨膜域可源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白，包括但不限于baffr、blame(slamf8)、cd2、cd3ε、cd4、cd5、cd8、cd9、cd11a(cd18、itgal、lfa
‑
l)、cd11b、cd11c、cd11d、cd16、cd19、cd22、cd27、cd28、cd29、cd33、cd37、cd40、cd45、cd49a、cd49d、cd49f、cd64、cd80、cd84、cd86、cd96(tactile)、cd100(sema4d)、cd103、cd134、cd137(4
‑
1bb)、cd150(ipo
‑
3、slamf1、slam)、cd154、cd160(by55)、cd162(selplg)、cd226(dnam1)、cd229(ly9)、cd244(2b4、slamf4)、cd278(icos)、ceacam1、crt am、gitr、hyem(lightr)、ia4、il2rβ、il2rγ、il7r a、itga1、itga4、itga6、itgad、itgae、itgam、itgax、itgb1、itgb2、itgb7、kir、ltbr、ox40、nkg2c、nkg2d、nkp30、nkp44、nkp46、nkp80(klrf1)、pag/cbp、psgl1、slamf6(ntb
‑
a、ly108)、slamf7、t细胞受体的α、β或ζ链、tnfr2、vla1和vla
‑
6。
[0088]
在一个实施方案中，本文所述的cadar包含cd8α、cd28或icos的跨膜域。在某些实施方案中，cd8α的跨膜域具有seq id no:21的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
[0089]
在某些实施方案中，本文所述的cadar的跨膜域是合成的，例如主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在某些实施方案中，本文所述的cadar的跨膜域被修饰或设计为避免与相同或不同表面膜蛋白的跨膜域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
[0090]
在一些实施方案中，本文所述的cadar还包含铰链区，其形成cadar的胞外域和跨膜域之间的连接。铰链和/或跨膜域提供了cadar的胞外域的细胞表面呈现。
[0091]
铰链区可源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白，包括但不限于baffr、blame(slamf8)、cd2、cd3ε、cd4、cd5、cd8、cd9、cd11a(cd18、itgal、lfa
‑
l)、cd11b、cd11c、cd11d、cd16、cd19、cd22、cd27、cd28、cd29、cd33、cd37、cd40、cd45、cd49a、cd49d、cd49f、cd64、cd80、cd84、cd86、cd96(tactile)、cd100(sema4d)、cd103、cd134、cd137(4
‑
1bb)、cd150(ipo
‑
3、slamf1、slam)、cd154、cd160(by55)、cd162(selplg)、cd226(dnam1)、cd229(ly9)、cd244(2b4、slamf4)、cd278(icos)、ceacam1、crt am、gitr、hyem(lightr)、ia4、il2rβ、il2rγ、il7ra、itga1、itga4、itga6、itgad、itgae、itgam、itgax、itgb1、itgb2、itgb7、kir、ltbr、ox40、nkg2c、nkg2d、nkp30、nkp44、nkp46、nkp80(klrf1)、pag/cbp、psgl1、slamf6(ntb
‑
a、ly108)、slamf7、t细胞受体的α、β或ζ链、tnfr2、vla1和vla
‑
6。
[0092]
在一些实施方案中，铰链区包含cd8α的铰链区、人类免疫球蛋白(ig)的铰链区或富含甘氨酸
‑
丝氨酸的序列。
[0093]
在一些实施方案中，cadar包含cd8α、cd28、icos或igg4m的铰链区。在某些实施方案中，铰链区具有seq id no:22的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
[0094]
胞内域
[0095]
本文所述的cadar的胞内域负责激活cadar所处的免疫细胞的至少一种正常效应功能。在免疫细胞的上下文中使用的术语“效应功能”是指细胞的专门功能，例如t细胞的细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
[0096]
众所周知，t细胞的完全激活需要通过t细胞受体(tcr)产生的信号和次级或共刺激信号。因此，t细胞的激活是由两类不同的细胞质信号传导序列介导的：那些通过tcr启动抗原依赖性初级激活的信号传导序列(初级细胞质信号传导序列)和那些以抗原非依赖性方式提供次级或共刺激信号的信号传导序列(次级细胞质信号传导序列)。
[0097]
cadar的胞内域可以源自转导效应功能信号并指导细胞执行效应功能的分子，或此类分子的截短部分，只要其转导信号即可。此类蛋白质分子包括但不限于b7
‑
h3、baffr、blame(slamf8)、cd2、cd3δ、cd3ε、cd3γ、cd3ζ、cd4、cd5、cd7、cd8α、cd8β、cd11a(cd18、lfa
‑
1、itgal)、cd11b、cd11c、cd11d、cd19、cd27、cd28、cd29、cd30、cd40、cd49a、cd49d、cd49f、cd69、cd79a、cd79b、cd83、cd84、cd86、cd96(tactile)、cd100(sema4d)、cd103、cd127、cd137(4
‑
1bb)、cd150(slam、slamf1、ipo
‑
3)、cd160(by55)、cd162(selplg)、cd226(dnam1)、cd229(ly9)、cd244(slamf4、2b4)、ceacam1、crtam、dap10、dap12、常见fcrγ、fcrβ(fcεrib)、fcγriia、gads、gitr、hvem(lightr)、ia4、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、itga6、itgad、itgae、itgam、itgax、itgb1、itgb2、itgb7、icam
‑
1、icos、light、ltbr、lat、nkg2c、nkg2d,nkp44、nkp30、nkp46、nkp80(klrf1)、ox40、pd
‑
1、pag/cbp、psgl1、slp
‑
76、slamf6(ntb
‑
a、ly108)、slamf7、t细胞受体(tcr)、tnfr2、trance/rankl、vla1、vla
‑
6、其任何衍生物、变异体或片段、具有相同功能的分子的任何合成序列及其任何组合。
[0098]
在一些实施方案中，胞内域包含共刺激域和信号传导域，其中当cadar与ada结合时，共刺激域提供共刺激细胞内信号传导而不需要其原始配体，并且信号传导域提供初级激活信号传导。cadar的共刺激域和信号传导域可以随机或指定的顺序相互连接。
[0099]
共刺激域
[0100]
在一些实施方案中，共刺激域源自共刺激分子的胞内域。
[0101]
共刺激分子的实例包括b7
‑
h3、baffr、blame(slamf8)、cd2、cd4、cd8α、cd8β、cd7、cd11a、cd11b、cd11c、cd11d、cd 18、cd 19、cd27、cd28、cd29、cd30、cd40、cd49a、cd49d、cd49f、cd69、cd83、cd84、cd96(tactile)、cd100(sema4d)、cd103、cd 127、cd137(4
‑
1bb)、cd150(slam、slamf1、ipo
‑
3)、cd160(by55)、cd162(selplg)、cd226(dnam1)、cd229(ly9)、cd244(slamf4、2b4)、ceacam1、crtam、cds、ox40、pd
‑
l、icos、gads、gitr、hvem(lightr)、ia4、icam
‑
l、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、itga4、itga6、itgad、itgae、itgal、itgam、itgax、itgb1、itgb2、itgb7、lat、lfa
‑
l、light、ltbr、nkg2c、nkg2d、nkp44、nkp30、nkp46、nkp80(klrf1)、pag/cbp、psgl1、slamf6(ntb
‑
a、lyl08)、slamf7、slp
‑
76、tnfr2、trance/rankl、vla1、vla
‑
6、其任何衍生物、变异体或片段、具有相同功能的共刺激分子的任何合成序列及其任何组合。
[0102]
在一些实施方案中，cadar的共刺激域包含共刺激分子cd137(4
‑
1bb)、cd28、ox40或icos的胞内域。在一些实施方案中，cadar的共刺激域具有seq id no:23的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
[0103]
信号传导域
[0104]
tcr复合物的初级激活可以由初级细胞质信号传导序列以刺激性方式或抑制性方式调节。以刺激性方式起作用的初级细胞质信号传导序列可以含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的信号传导基序。在本公开中特别使用的含有itam的初级信号传导序列的实例包括那些源自cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd5、cd22、cd79a、cd79b、cd66d、fcrγ、fcrβ和tcrζ的初级信号传导序列。
[0105]
在一些实施方案中，本公开的cadar的信号传导域包含itam，其在cadar与ada结合后提供刺激性胞内信号传导，而不受hla限制。在一些实施方案中，cadar的信号传导域包含cd3ζ(cd247)的信号传导域。在一些实施方案中，cadar的信号传导域包含seq id no:24的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
[0106]
其他区
[0107]
在一些实施方案中，cadar还包含连接子。如本文所提供的术语“连接子”是连接cadar的各种组分的多肽。
[0108]
在一些实施方案中，连接子插入scfv的vh和vl之间。在一些实施方案中，连接子插入跨膜域和胞内域之间。在一些实施方案中，连接子在胞内域的信号传导域和共刺激域之间。
[0109]
在一些实施方案中，连接子包含长度在2至20个氨基酸残基之间的甘氨酸
‑
丝氨酸(gs)双联体。示例性gs双联体包括(g4s)3：seq id no:25。在一些实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码连接子的核苷酸序列。
[0110]
在一些实施方案中，本文提供的cadar从n端到c端包含：cd8α的信号肽、阿达木单抗的免疫原性片段(例如，选自表2的序列或源自阿达木单抗的scfv)、cd8α的铰链区、cd8α的跨膜域、cd137的胞内域和cd3ζ的信号传导域。
[0111]
在一些实施方案中，本文提供的多核苷酸编码cadar，其从n端到c端包含：cd8α的信号肽、阿达木单抗的免疫原性片段(例如，源自阿达木单抗的scfv)、cd8α的铰链区、cd8α的跨膜域、cd137的胞内域和cd3ζ的信号传导域。
[0112]
在一些实施方案中，cadar表现出对针对治疗性tnf
‑
α单克隆抗体的ada的高亲和力。如本文所用，术语“亲和力”是指免疫球蛋白分子或其片段与抗原之间的非共价相互作用的强度。结合亲和力可以用kd值，即解离常数表示，其通过本领域已知的任何方法确定，包括但不限于酶联免疫吸附测定(elisa)、表面等离子体共振或流式细胞术(如facs)。在某些实施方案中，cadar对ada的结合亲和力小于50nm、25nm、10nm、5nm、4nm、3nm、2nm或1nm。
[0113]
载体
[0114]
在另一个方面，本公开提供了一种载体，其包含编码本文所述的cadar的多核苷酸。编码cadar的多核苷酸可以插入本领域已知的不同类型的载体中，例如质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、来源于动物病毒的病毒载体、粘粒、转座子、定点插入载体(例如crispr、锌指核酸酶、talen)或自杀式表达载体。在一些实施方案中，载体是dna或rna。
[0115]
在一些实施方案中，多核苷酸可操作地连接于载体中的至少一个调节性多核苷酸元件以用于表达cadar。典型的载体含有各种调节性多核苷酸元件，例如调节插入的多核苷酸表达的元件(例如转录和翻译终止子、起始序列和启动子)，调节载体在宿主细胞中复制
的元件(例如复制起点)，以及调节载体整合到宿主基因组中的元件(例如转座子的末端重复序列)。cadar的表达可以通过将编码cadar的多核苷酸可操作地连接于启动子，并将该构建体掺入载体中来实现。组成型启动子(如cmv启动子、sv40启动子和mmtv启动子)或诱导型启动子(如金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子和孕酮启动子)都可考虑用于本公开。在一些实施方案中，载体是表达载体，表达载体包含足够的顺式作用元件用于表达；其他表达元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。
[0116]
为了评估cadar的表达，载体还可以包含可选标记基因或报告基因或两者，以用于鉴定和选择引入载体的细胞。有用的可选标记包括例如抗生素抗性基因，如neo等。有用的报告基因包括例如荧光素酶、β
‑
半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因。
[0117]
在一些实施方案中，载体是病毒载体。病毒载体可以来源于例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(aav)、疱疹病毒和慢病毒。有用的病毒载体一般含有在至少一种生物体内起作用的复制起点、启动子、限制性核酸内切酶位点和一个或多个可选标记。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体，如慢病毒载体。慢病毒载体对于将编码cadar的多核苷酸长期、稳定地整合到非增殖细胞的基因组中特别有用，从而使cadar在宿主细胞，如宿主t细胞中稳定表达。
[0118]
在一些实施方案中，载体是mrna，其可以被电穿孔到宿主细胞中。由于mrna会随着细胞分裂而被稀释，所以mrna的表达不会是永久性的。
[0119]
在一些实施方案中，载体是基于转座子的表达载体。转座子是可以改变其在基因组内位置的dna序列。在转座子系统中，编码cadar的多核苷酸侧面是由介导转座子移动的转座酶可识别的末端重复序列。转座酶可以作为蛋白质共递送、与cadar编码在同一载体上或编码在单独的载体上。转座子系统的非限制性实例包括sleeping beauty、piggyback、frog prince和prince charming。
[0120]
载体可以通过本领域已知的任何方法，例如通过物理、化学或生物手段引入宿主细胞，例如哺乳动物细胞中。将多核苷酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。生物方法包括使用病毒载体，特别是逆转录病毒载体，将基因插入哺乳动物，例如人类细胞中。化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒，以及基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。
[0121]
细胞
[0122]
在一个方面，本公开提供了一种工程细胞，其包含或表达如本文所述的cadar。在一些实施方案中，工程细胞包含编码cadar的多核苷酸或包含cadar多核苷酸的载体。在一些实施方案中，工程细胞包含多个cadar，其包含治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体的不同免疫原性片段。
[0123]
如本文所述的工程细胞是经基因修饰的免疫细胞，可用于本公开的免疫细胞包括t细胞、自然杀伤(nk)细胞、不变nk细胞或nkt细胞，以及其他效应细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是原代细胞、来源于原代细胞的扩增细胞或来源于体外分化的干细胞的细胞。
[0124]
包含或表达cadar的工程细胞对b细胞上基于ada的b细胞受体(bcr)具有高亲和力是有用的，其中ada特异性结合治疗性tnf
‑
α单克隆抗体。因此，工程细胞可以诱导直接杀伤抗治疗性tnf
‑
α单克隆抗体b细胞，或间接杀伤表达针对治疗性抗体的ada的浆细胞。在一些
实施方案中，工程细胞对与fc受体结合的ada具有低亲和力。
[0125]
在另一个方面，本公开提供了一种制造表达如本文所述的cadar的工程细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括选自以下的一个或多个步骤：从来源获得细胞、培养细胞、激活细胞、扩增细胞和工程改造细胞。
[0126]
在另一个方面，本公开提供了一种使用工程细胞进行细胞疗法的方法，其中工程细胞被引入受试者体内。在一些实施方案中，受试者是获得细胞的同一受试者。
[0127]
细胞来源
[0128]
工程细胞可以来源于从受试者，例如人类受试者分离的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是从感兴趣的受试者获得，例如疑似患有特定疾病或病况的受试者，疑似具有特定疾病或病况倾向的受试者，将接受、正在接受或已经接受特定疾病或病况治疗的受试者，作为健康志愿者或健康捐赠者的受试者，或来自血库。因此，细胞对于感兴趣的受试者可以是自体的或同种异体的。同种异体供体细胞可能与人类白细胞抗原(hla)不相容，因此可以处理同种异体细胞以降低免疫原性。
[0129]
免疫细胞可以从其在受试者体内驻留的任何位置收集，包括但不限于血液、脐带血、脾脏、胸腺、淋巴结、胸腔积液、脾脏组织和骨髓。分离的免疫细胞可以直接使用，或其可以储存一段时间，如通过冷冻。
[0130]
在一些实施方案中，工程细胞来源于t细胞。t细胞可以通过本领域技术人员已知的许多技术，如单采血液成分术从受试者采集的血液中获得。
[0131]
在一些实施方案中，一个或多个t细胞群被富集或耗尽对特定标志物(如表面标志物)呈阳性的细胞或对特定标志物呈阴性的细胞。此类标志物是在某些t细胞群上不存在或以相对较低的水平表达，但在某些其他t细胞群上存在或以相对较高的水平表达的标志物。在一些实施方案中，分离出cd4 辅助性和cd8 细胞毒性t细胞。在一些实施方案中，cd8 和cd4 t细胞被进一步富集或耗尽幼稚、中央记忆、效应记忆和/或中央记忆干细胞，例如通过基于与各自亚群相关的表面抗原的正向或负向选择。
[0132]
细胞的激活和扩增
[0133]
在一些实施方案中，免疫细胞在基因修饰之前被激活和扩增。在其他实施方案中，免疫细胞在使用前被激活但没有扩增，或者既没有激活也没有扩增。
[0134]
激活和扩增免疫细胞的方法已经在本领域中描述，并且可以用于本文描述的方法中。例如，t细胞可以通过与附接有刺激cd3/tcr复合体相关信号的药剂和刺激t细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触来激活和扩增。为了刺激cd4 t细胞或cd8 t细胞的增殖，可以使用抗cd3抗体和抗cd28抗体。
[0135]
治疗方法
[0136]
在一个方面，本公开提供了一种提高有需要的受试者对用治疗性抗tnfα单克隆抗体进行的治疗的反应或减轻与之相关的不良作用的方法，其包括施用有效量的本文所述的工程细胞。
[0137]
在一些实施方案中，受试者患有可受益于抗tnfα疗法(例如使用治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体的疗法)的病症。可受益于抗tnfα疗法的病症的非限制性实例包括类风湿性关节炎(ra)、幼年特发性关节炎(jia)、牛皮癣性关节炎(psa)、强直性脊柱炎(as)、成人克罗恩氏病(cd)、小儿克罗恩氏病、溃疡性结肠炎(uc)、斑块状牛皮癣(ps)、化脓性汗腺炎(hs)和
葡萄膜炎(uv)。
[0138]
在一些实施方案中，受试者未能从一开始就对用治疗性抗tnfα单克隆抗体进行的治疗作出反应，失去最初取得的反应，或作出不利的反应。如本文所用，术语“反应”是指受试者对治疗的充分有益反应。在一些实施方案中，治疗性抗tnfα单克隆抗体在受试者中诱导ada。
[0139]
在一些实施方案中，包含或表达cadar的工程细胞源自从受试者分离、离体扩增、工程改造以包含用于表达cadar的载体并输入受试者体内的t细胞。工程t细胞识别表达和呈递基于ada的bcr的b细胞，其中ada特异性靶向治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体，并且工程t细胞被激活，导致靶向的b细胞被杀伤。在一些实施方案中，t细胞是自体细胞。
[0140]
在某些实施方案中，治疗方法还包括施用增加工程细胞功效的药剂。例如，将促进本公开的工程细胞的生长和激活的生长因子与细胞同时或随后施用于受试者。生长因子可以是促进免疫细胞生长和活化的任何合适的生长因子。合适的免疫细胞生长因子的实例包括白细胞介素(il)
‑
2、il
‑
7、il
‑
15和il
‑
12，它们可以单独使用或以各种组合使用，如il
‑
2和il
‑
7，il
‑
2和il
‑
15，il
‑
7和il
‑
15，il
‑
2、il
‑
7和il
‑
15，il
‑
12和il
‑
7、il
‑
12和il
‑
15，或il
‑
12和il2。
[0141]
在一些实施方案中，治疗方法还包括施用减少或改善与施用工程细胞相关的副作用的药剂。示例性副作用包括细胞因子释放综合征(crs)和嗜血细胞淋巴组织细胞增生症(hlh，也称为巨噬细胞激活综合征(mas))。经施用以治疗副作用的药剂可以是中和可溶性因子如ifn
‑
γ、ifn
‑
α、il
‑
2和il
‑
6的药剂。此类药剂包括但不限于tnf
‑
α的抑制剂(例如依那西普(entanercept))和il
‑
6的抑制剂(例如托珠单抗(tocilizumab))。
[0142]
治疗有效量的工程细胞可以通过多种途径施用，包括肠胃外施用，例如静脉内、腹膜内、肌肉内、胸骨内或关节内注射或输注。
[0143]
工程细胞可以按照与治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体的免疫反应相一致的治疗方案进行施用，例如在一至数天内单次或几次给药，或在延长时间内定期给药。制剂中采用的精确剂量也将取决于施用途径和对治疗性抗tnf
‑
α单克隆抗体的免疫反应的严重程度，应根据医生的判断和每个患者的情况来决定。工程细胞的治疗有效量将取决于所治疗的受试者、病痛的严重程度和类型以及施用方式。在一些实施方案中，可用于治疗人类受试者的剂量范围为至少3.8
×
104、至少3.8
×
105、至少3.8
×
106、至少3.8
×
107、至少3.8
×
108、至少3.8
×
109或至少3.8
×
10
10
个细胞/m2。在某个实施方案中，用于治疗人类受试者的剂量范围为约3.8
×
109至约3.8
×
10
10
个细胞/m2。在另外的实施方案中，工程细胞的治疗有效量可以在每公斤体重约5
×
106个细胞至每公斤体重约7.5
×
108个细胞之间，如每公斤体重约2
×
107个细胞至约5
×
108个细胞，或每公斤体重约5
×
107个细胞至约2
×
108个细胞。本领域技术人员可以根据受试者的年龄、体重、性别和生理状况容易地确定工程细胞的精确量。有效剂量可以从体外或动物模型测试系统得出的剂量反应曲线中推算出来。
[0144]
在一些实施方案中，包含cadar的工程细胞可以在用治疗性抗tnfα单克隆抗体治疗之前、期间、之后或以与用治疗性抗tnfα单克隆抗体治疗相关的任何组合施用。
[0145]
在另一个方面，本公开还提供了一种药物组合物，其包含工程细胞和药学上可接受的稀释剂和/或载体。示例性的稀释剂和/或载体包括缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基
酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。在一个方面，本发明的组合物被配制用于静脉内施用。
[0146]
表4.cadar中包含的域的示例性序列
[0147][0148]
实施例
[0149]
虽然已经参照具体实施例(其中一些是优选实施例)特别显示和描述了本公开，但本领域的技术人员应理解，在不脱离本文所公开的本公开的精神和范围的情况下，可以在其中进行形式上和细节上的各种改变。
[0150]
实施例1.cadar在人原代t细胞中的表达.
[0151]
设计并合成了包括编码cadar的dna序列的转移质粒(结构示意图见图2)，该序列包含源自阿达木单抗的scfv(scfv
‑
adl)(genewiz,nj)。然后使用第4代包装系统将转移质粒用于产生vsv
‑
g假型慢病毒颗粒。简而言之，293t细胞在汇合度为80％时用转移质粒、包膜质粒、包装质粒和lipofectamine 30000(life technologies)的混合物进行转染。49小时后收获含有慢病毒的上清液，通过0.45微米的pes膜过滤，在4℃下以1500
×
g浓缩45分钟，并储存在
‑
80℃下。
[0152]
来自健康供体的人pbmc用cd3/cd28 dynabeads(thermo fisher scientific)以1:1的细胞/珠粒比激活24小时。2e 6个t细胞用慢病毒颗粒转导。t细胞在补充有50u/ml il
‑
2(thermo fisher scientific)的xf t细胞扩增培养基(stemcell technologies)中培养。每2至3天更换一次培养基。刺激后第5天，通过流式细胞仪(beckman cytoflex)验证阳性cadar
‑
t细胞。
[0153]
实施例2.cadar
‑
t细胞的体外功效测试.
[0154]
通过用纯化的scfv
‑
adl蛋白使balb/c小鼠免疫来产生抗阿达木单抗(adl)杂交瘤细胞。来自小鼠脾脏的b淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。用三轮elisa来筛选阳性杂交瘤克隆。将一种阳性(表达针对adl的抗体)和一种阴性(不表达针对adl的抗体)杂交瘤细胞在补充有50u/ml il
‑
2(thermo fisher scientific)和10％fbs(gibco)的xf t细胞扩增培养基(stemcell technologies)中培养。每1至2天更换一次培养基。
[0155]
阳性和阴性杂交瘤细胞首先用cfse(celltrace，目录号c34554)染色。1e 4个杂交瘤细胞/孔用cfse(2.5μm)在37℃下染色10分钟，洗涤两次并重新悬浮于补充有50u/ml il
‑
2(thermo fisher scientific)和10％fbs(gibco)的xf t细胞扩增培养基(stemcell technologies)中。
[0156]
将cadar
‑
t细胞(初始激活后8天)和无cadar的激活t细胞(模拟t)与染色的杂交瘤
细胞以不同的效应:目标(e:t)比共同培育20小时。随后，细胞在室温下以1,000rpm离心5分钟。进行可固定活力染料efluor(ebioscience，目录号65
‑
0863
‑
18)分析以标记死细胞。通过流式细胞仪(beckman,cytoflex)分析cfse

可固定活力染料efluor

杂交瘤细胞百分比。cardar
‑
t细胞的细胞毒性是根据杂交瘤细胞的裂解百分比来计算。杀伤细胞毒性(％)＝与scfv
‑
adl cadar共同培育的cfse

可固定活力染料efluor

杂交瘤细胞(％)
‑
与模拟t共同培育的cfse

可固定活力染料efluor

杂交瘤细胞(％)。细胞毒性分析的结果显示于下表5中。cadar
‑
t细胞的细胞毒性随着e:t比的增加而增加。
[0157]
表5：cadar
‑
t细胞的杀伤细胞毒性(％)
[0158][0159]
在cadar
‑
t和杂交瘤细胞共培养20小时后，通过elisa(r&d)对共培养物中的inf
‑
γ产生进行定量。结果显示于下表6中。
[0160]
表6.cadar
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t和杂交瘤共培养物中的inf
‑
γ产生
[0161] 阳性杂交瘤阴性杂交瘤cadar
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t12.8ng/ml2.77ng/ml模拟t0.27ng/ml0.3ng/ml
[0162]
实施例3.cadar
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t细胞的体内功效测试
[0163]
在用静脉内免疫球蛋白预处理小鼠以使fcyr介导的针对bcr表达细胞的毒性降至最低后，将阳性或阴性杂交瘤细胞静脉内注射到nsg小鼠体内。几天后，静脉内注射cadar
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t细胞(或模拟t细胞)。对生物发光和/或血清ada进行定量以监测cadar
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t细胞功效。cadar
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t细胞控制阳性杂交瘤细胞的生长，但不控制阴性杂交瘤细胞的生长，而模拟t细胞不控制阳性或阴性杂交瘤细胞的生长。