降低单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种降低抗人干扰素α受体1单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法。


背景技术：

2.抗体药物生产过程中亲和纯化是非常关键的一个工艺步骤，该过程对发酵液中的抗体进行捕获浓缩，实现抗体粗纯化的第一步。在中国仓鼠卵巢细胞(cho)等基因工程细胞株大批量发酵过程中，细胞在不同的生理周期会有凋亡裂解，释放宿主细胞蛋白(host cell protein，hcp)。hcp是指来源于宿主细胞的蛋白成分，包括宿主细胞结构蛋白和转化蛋白(细胞分泌的促生长蛋白)。hcp不仅有可能诱导机体产生抗hcp抗体，引起过敏反应，还有可能有“佐剂效应”引起机体对蛋白质药物产生抗体，影响药物治疗效果，定量测定基因工程药物中残留的hcp是质量控制的一种重要手段，有助于保持纯化工艺的有效性和一致性。在抗体亲和纯化中，保证高效率的抗体回收率的同时，要对发酵过程中工程细胞所产生的hcp进行有效去除。因此，研究出一种能广泛应用于抗体大规模发酵后较为经济可行的抗体亲和纯化工艺，对于抗体药物的进一步产业化推广是极其有意义的。目前能够进行hcp残留去除的方法较多，各有特点：1)层析方式：包括protein a亲和层析，阴、阳离子层析，三种层析工艺中对hcp的去除能力，protein a亲和层析为基础，去除能力较强，是hcp去除的主要步骤，阴、阳离子层析则主要作为后续hcp的进一步再去除工艺。层析方式去除hcp的工艺在不断完善过程中，各种层析工艺在不断的提出应用实际生产，是hcp去除的主要手段；2)切向流超滤方式：对于hcp的去除能力有限，且不易控制残留量，工艺控制系数不高，只能作为去除hcp的辅助工艺；3)聚合物沉淀方式：peg、聚丙烯酸等高聚合物在较广的ph范围内带正电荷，通过电荷作用同抗体结合形成沉淀，而hcp由于等电点较低，不易发生沉淀。沉淀抗体样品的hcp含量明显降低，但该工艺不适于工艺放大，且沉淀对抗体的活性可能有一定影响。因此，去除hcp的工艺方法众多，由于各项目的抗体的样品发酵工艺及抗体性质的不同，需进行综合考虑选择工艺。


技术实现要素：

3.为了解决抗体生产中宿主细胞蛋白(hcp)残留问题，本发明提供了一种抗体纯化生产中有效降低cho宿主细胞蛋白(hcp)的新方法，可以广泛适用于抗体亲和纯化工艺中，且所使用的材料成本价格较低，易于工艺放大。在本发明中，主要通过抗体亲和层析中间预洗脱淋洗来有效降低hcp含量，满足抗体药物的大规模高质量纯化制备要求，保证抗体药物的临床使用的安全。
4.本发明具体技术方案如下：
5.1.一种降低单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法，其包括下述步骤：
6.使用第一平衡缓冲液平衡亲和层析介质得到平衡好的亲和层析介质，并将单克隆
抗体发酵液与所述平衡好的亲和层析介质结合；
7.然后进行中间预洗脱淋洗，接着进行终洗脱以除去宿主细胞蛋白得到单克隆抗体；
8.所述单克隆抗体为分离的抗人干扰素α受体1(ifnar1)单克隆抗体，其包含三个重链互补决定区(cdr
‑
h1、cdr
‑
h2和cdr
‑
h3)和三个轻链互补决定区(cdr
‑
l1、cdr
‑
l2和cdr
‑
l3)，其中：
9.(a)cdr
‑
h1的氨基酸序列如seq id no：1所示；
10.(b)cdr
‑
h2的氨基酸序列如seq id no：2所示；
11.(c)cdr
‑
h3的氨基酸序列如seq id no：3所示；
12.(d)cdr
‑
l1的氨基酸序列如seq id no：4所示；
13.(e)cdr
‑
l2的氨基酸序列如seq id no：5所示；且
14.(f)cdr
‑
l3的氨基酸序列如seq id no：6所示。
15.2.根据项1所述的亲和纯化方法，其中，所述抗人干扰素α受体1(ifnar1)单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，
16.所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no：7所示；且，
17.所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：8所示。
18.3.根据项2所述的亲和纯化方法，其中，所述抗人干扰素α受体1(ifnar1)单克隆抗体的重链的氨基酸序列如seq id no：10所示；轻链的氨基酸序列如seq id no：11所示。
19.4.根据项1
‑
3中任一项所述的亲和纯化方法，其中，所述亲和层析介质为配基交联到琼脂糖、聚乙烯醚、羟基化聚醚树脂、聚丙烯酸树脂、聚苯乙烯二乙烯苯基树脂、聚甲基丙烯酸树脂、聚苯乙烯树脂、羟基磷灰石或玻璃基质上的层析介质，优选的，所述亲和层析介质为配基交联到聚乙烯醚的层析介质；
20.优选的，所述配基为protein a、protein g或protein l，优选为protein a。
21.5.根据项1
‑
4中任一项所述的亲和纯化方法，其中，所述第一平衡缓冲液为磷酸盐缓冲液、tris
‑
hcl缓冲液或硼酸
‑
硼砂缓冲液，所述第一平衡缓冲液中的盐浓度为5mm
‑
0.25m，ph为5.5
‑
8.0。
22.6.根据项1
‑
5中任一项所述的亲和纯化方法，其中，中间预洗脱缓冲液为中性缓冲液和/酸性缓冲液；优选的，所述中性缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液或甘氨酸缓冲液；所述酸性缓冲液为柠檬酸
‑
磷酸氢二钠缓冲液、醋酸
‑
醋酸钠缓冲液或柠檬酸
‑
柠檬酸三钠缓冲液。
23.7.根据项6所述的亲和纯化方法，其中，所述中间预洗脱缓冲液的ph为5.0
‑
7.5。
24.8.根据项6所述的亲和纯化方法，其中，在所述中间预洗脱缓冲液中加入预洗脱活性剂，优选的，所述预洗脱活性剂为盐酸胍、聚山梨酯80或氯化钠，进一步优选的，所述预洗脱活性剂为盐酸胍。
25.9.根据项8所述的亲和纯化方法，其中，所述盐酸胍的浓度为0.01
‑
1m。
26.10.根据项1
‑
9中任一项所述的亲和纯化方法，其中，在中间预洗脱淋洗后，在进行终洗脱之前还包括下述步骤：
27.使用第二平衡缓冲液进行平衡，优选的，所述第二平衡缓冲液为磷酸盐缓冲液、tris
‑
hcl缓冲液或硼酸
‑
硼砂缓冲液。
28.11.根据项1
‑
10中任一项所述的亲和纯化方法，其中，终洗脱缓冲液选自柠檬酸
‑
磷酸氢二钠缓冲液、醋酸缓冲液、甘氨酸
‑
hcl缓冲液和柠檬酸
‑
柠檬酸钠缓冲液中的一种或两种以上，优选为柠檬酸
‑
磷酸氢二钠缓冲液。
29.12.根据项11所述的亲和纯化方法，其中，所述柠檬酸
‑
磷酸氢二钠缓冲液的ph为2.0
‑
7.0。
30.发明的效果
31.本发明所述的亲和工艺简单易行，能够进行放大纯化生产，细胞发酵上清液无需进行前预处理，洗脱样品得率较高，同时hcp残留量也保持在较低水平(残留控制量不高于0.1％)，从而减轻之后纯化步骤中去除hcp的压力，从而保证抗体最终样品的hcp残留量处于极低水平。同时，发明中经过对不同批次发酵上清液进行亲和纯化工艺验证，证明本发明中的亲和纯化工艺具有良好的稳定性。
32.所述的抗人干扰素α受体1(ifnar1)单克隆抗体，其与现有的抗人干扰素α受体1单克隆抗体(anifrolumab)相比，结合ifnar1的亲和力相当，在细胞水平的中和活性与anifrolumab相当。
33.所述的单克隆抗体在细胞水平显示出与anifrolumab(根据专利公开序列表达制备)相当的中和活性，其有望在预防和治疗相关疾病方面展现出良好的临床效果。
附图说明
34.图1是显示构建hzd1203
‑
45瞬转表达质粒的核酸电泳结果的图。其中，m：marker；条带1：pcr产物362vh
‑
hu6；条带2：phzdch，hindiii/nhei；条带3：pcr产物362vk
‑
hu20；条带4：phzdck，hindiii/bsiwi。
35.图2是瞬转表达流程图。
36.图3是qx006n(hzd1203
‑
45
‑
igg4.1)的电泳检测图。
具体实施方式
37.下面结合附图对本发明做以详细说明，其中所有附图中相同的数字表示相同的特征。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
38.需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
39.本发明提供了一种降低单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法，其包括下述步骤：
40.使用第一平衡缓冲液平衡亲和层析介质得到平衡好的亲和层析介质，并将单克隆
抗体发酵液与所述平衡好的亲和层析介质结合；
41.然后进行中间预洗脱淋洗，接着进行终洗脱以除去宿主细胞蛋白得到单克隆抗体；
42.所述单克隆抗体为分离的抗人干扰素α受体1(ifnar1)单克隆抗体，其包含三个重链互补决定区(cdr
‑
h1、cdr
‑
h2和cdr
‑
h3)和三个轻链互补决定区(cdr
‑
l1、cdr
‑
l2和cdr
‑
l3)，其中：
43.(a)cdr
‑
h1(在本说明书中cdr
‑
h1表示重链cdr1)的氨基酸序列如seq id no：1所示；
44.(b)cdr
‑
h2(在本说明书中cdr
‑
h2表示重链cdr2)的氨基酸序列如seq id no：2所示；
45.(c)cdr
‑
h3(在本说明书中cdr
‑
h3表示重链cdr3)的氨基酸序列如seq id no：3所示；
46.(d)cdr
‑
l1(在本说明书中cdr
‑
l1表示轻链cdr1)的氨基酸序列如seq id no：4所示；
47.(e)cdr
‑
l2(在本说明书中cdr
‑
l2表示轻链cdr2)的氨基酸序列如seq id no：5所示；且
48.(f)cdr
‑
l3(在本说明书中cdr
‑
l3表示轻链cdr3)的氨基酸序列如seq id no：6所示。
49.其中，seq id no：1的氨基酸序列如下所示：
50.syymt
51.seq id no：2的氨基酸序列如下所示：
52.vinvyggtyyaswakg
53.seq id no：3的氨基酸序列如下所示：
54.edvavymaidl
55.seq id no：4的氨基酸序列如下所示：
56.qasqsisnqls
57.seq id no：5的氨基酸序列如下所示：
58.dasslas
59.seq id no：6的氨基酸序列如下所示：
60.lgiygdgaddgia
61.所述单克隆抗体表示得自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)以外，这样的变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰语“单克隆”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括、但不限于杂交瘤方法、重组dna方法、噬菌体展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了这样的方法和其它示例性的制备单克隆抗体的方法。
62.所述宿主细胞表示其中已经引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和由其来源的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内容物方面可以与亲本细胞不完全相同，但是可以含有突变。针对最初转化的细胞筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变体后代被包括在本说明书中。
63.所述宿主细胞蛋白(hcp)是与过程相关的杂质，由用于生产生物药物蛋白的宿主细胞表达。在纯化过程中，大部分的hcp被去除(>99％)，但残留的hcp量仍保留在分布的产品中，例如单克隆抗体(mab)、抗体
‑
药物结合物(adc)、治疗性蛋白质、疫苗，以及其他基于蛋白质的生物制药。
64.所述抗人干扰素α受体1(ifnar1)单克隆抗体表示这样的单克隆抗体：其能够以足够的亲和力结合人干扰素α受体1，使得所述单克隆抗体可用作靶向人干扰素α受体1的诊断剂和/或治疗剂。
65.本发明的抗人干扰素α受体1(ifnar1)单克隆抗体与靶标无关的蛋白不结合。这里，“无关的蛋白”是指除作为靶标的人干扰素α受体1以外的其他蛋白；这里，“不结合”是指：在将本发明的抗人干扰素α受体1(ifnar1)单克隆抗体与作为其靶标的人干扰素α受体1的结合能力作为100％的情况下，本发明的抗人干扰素α受体1单克隆抗体与所述无关蛋白的结合能力小于10％，例如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或者0。
66.本发明所述的抗人干扰素α受体1(ifnar1)单克隆抗体与其他动物种属的干扰素α受体1可以不结合。这里，“其他动物种属”是指除人以外的其他动物种属，例如狨猴、食蟹猴、猪、犬、兔、大鼠、小鼠、豚鼠等；这里，“不结合”是指：在将本发明的抗人干扰素α受体1(ifnar1)单克隆抗体与作为其靶标的人干扰素α受体1的结合能力作为100％的情况下，本发明的抗人干扰素α受体1(ifnar1)单克隆抗体与其他动物种属的干扰素α受体1的结合能力小于10％，例如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或者0。
67.本发明所述的抗人干扰素α受体1单克隆抗体具有≤1μm、≤100nm、≤50nm、≤40nm的平衡解离常数(kd)。
68.所述抗人干扰素α受体1(human interferon alpha/beta receptor 1，ifnar1)表示一种源自人的膜蛋白，其胞外区氨基酸序列如seq id no：9所示，其中，下划线部分表示信号肽。
69.seq id no：9：
70.mmvvllgattlvlvavapwvlsaaaggknlkspqkvevdiiddnfilrwnrsdesvgnvtfsfdyqktgmdnwiklsgcqnitstkcnfsslklnvyeeiklriraekentsswyevdsftpfrkaqigppevhleaedkaivihispgtkdsvmwaldglsftyslviwknssgveerieniysrhkiyklspettyclkvkaalltswkigvyspvhcikttvenelpppenievsvqnqnyvlkwdytyanmtfqvqwlhaflkrnpgnhlykwkqipdcenvkttqcvfpqnvfqkgiyllrvqasdgnntsfwseeikfdteiqafllppvfnirslsdsfhiyigapkqsgntpviqdypliyeiifwentsnaerkiiekktdvtvpnlkpltvycvkarahtmdeklnkssvfsdavcektkpgntsk
71.本发明通过使用上述方法进行亲和纯化，能够使单克隆抗体的宿主细胞蛋白的残留量处于极低的水平。
72.在一个实施方案中，所述抗人干扰素α受体1(ifnar1)单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，
73.所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no：7所示；且，
74.所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：8所示。
75.其中，seq id no：7的氨基酸序列如下所示：
76.evqlvesggglvqpggslrlscaasgfslssyymtwvrqapgkglewvsvinvyggtyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaredvavymaidlwgqgtlvtvss
77.seq id no：8的氨基酸序列如下所示：
78.aiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqsisnqlswyqqkpgkapklliydasslasgvpsrfsgsrsgtkftltisslqpedfatyyclgiygdgaddgiafgggtkveik
79.在一个实施方案中，所述抗人干扰素α受体1(ifnar1)单克隆抗体的重链的氨基酸序列如seq id no：10所示；轻链的氨基酸序列如seq id no：11所示。
80.其中，seq id no：10的氨基酸序列如下所示：
81.evqlvesggglvqpggslrlscaasgfslssyymtwvrqapgkglewvsvinvyggtyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaredvavymaidlwgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
82.seq id no：11的氨基酸序列如下所示：
83.aiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqsisnqlswyqqkpgkapklliydasslasgvpsrfsgsrsgtkftltisslqpedfatyyclgiygdgaddgiafgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
84.其中，seq id no：10和11均为经人源化的序列。
85.在一个实施方案中，所述亲和层析介质为配基交联到琼脂糖、聚乙烯醚、羟基化聚醚树脂、聚丙烯酸树脂、聚苯乙烯二乙烯苯基树脂、聚甲基丙烯酸树脂、聚苯乙烯树脂、羟基磷灰石或玻璃基质上的层析介质，优选的，所述亲和层析介质为配基交联到聚乙烯醚的层析介质；
86.优选的，所述配基为protein a、protein g或protein l，优选为protein a。
87.所述配基可与单克隆抗体特异性地结合。
88.本发明对亲和填料没有限制，其可以根据本领域技术人员的需要进行确认，例如，亲和填料可以为ge healthcare的mabselect、mabselect sure，博格隆生物技术有限公司的protein a diamond、merck的a。
89.在一个实施方案中，所述第一平衡缓冲液为磷酸盐缓冲液、tris
‑
hcl缓冲液或硼酸
‑
硼砂缓冲液。
90.对于第一平衡缓冲液中的盐浓度，本发明不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如所述第一平衡缓冲液中的盐浓度为5mm
‑
0.25m，ph为5.5
‑
8.0。
91.例如，所述第一平衡缓冲液中的盐浓度可以为5mm、10mm、20mm、50mm、0.1m、0.15m、0.2m、0.25m等；ph可以为5.5、6、7、8等。
92.优选的，所述第一平衡缓冲液为磷酸盐缓冲液或tris
‑
盐酸缓冲液，更优选的，在所述第一平衡缓冲液中加入nacl或na2so4来降低非抗体蛋白同填料间的非特异性吸附。
93.优选的，所述第一平衡缓冲液中的盐浓度为5mm
‑
0.15m，优选为10mm
‑
50mm，进一步
优选为20mm。
94.对于第一平衡缓冲液的ph值，本发明不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如所述第一平衡缓冲液的ph为6.5
‑
7.5，优选为6.9。
95.对于nacl或na2so4的加入量，其可以根据本领域技术人员的需要进行确定，对于nacl或na2so4的浓度，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，nacl或na2so4的浓度可以为0
‑
250mm，优选为150mm。
96.优选的，所述磷酸盐缓冲液例如可以为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的缓冲液。
97.在一个实施方案中，当将单克隆抗体发酵液与所述平衡好的亲和层析介质结合时，使用第一平衡缓冲液进行平衡。
98.在一个实施方案中，中间预洗脱缓冲液为中性缓冲液和/酸性缓冲液；优选的，所述中性缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液或甘氨酸缓冲液；所述酸性缓冲液为柠檬酸
‑
磷酸氢二钠缓冲液、醋酸
‑
醋酸钠缓冲液或柠檬酸
‑
柠檬酸三钠缓冲液。
99.对于中间预洗脱缓冲液的ph值，本发明不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，所述中间预洗脱缓冲液的ph为5.0
‑
7.5，优选为5.8.。
100.例如，所述中间预洗脱缓冲液的ph可以为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5等。
101.在一个实施方案中，在所述中间预洗脱缓冲液中加入预洗脱活性剂，优选的，所述预洗脱活性剂为盐酸胍、聚山梨酯80或氯化钠，进一步优选的，所述预洗脱活性剂为盐酸胍。
102.对于盐酸胍的浓度，本发明不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，所述盐酸胍的浓度为0.01
‑
1m，优选为0.05
‑
0.15m，进一步优选为0.1m。
103.例如，所述盐酸胍的浓度可以为0.01m、0.05m、0.1m、0.5m、1m。
104.对于中间预洗脱缓冲液中的盐浓度，本发明不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，在一个实施方案中，所述中间预洗脱缓冲液中的盐浓度为0
‑
0.5m，优选为0.1m。
105.例如，所述中间预洗脱缓冲液中的盐浓度可以为0、0.1m、0.2m、0.3m、0.4m、0.5m等。
106.在一个实施方案中，在中间预洗脱淋洗后，在进行终洗脱之前还包括下述步骤：
107.使用第二平衡缓冲液进行平衡，优选的，所述第二平衡缓冲液为磷酸盐缓冲液、tris
‑
hcl缓冲液或硼酸
‑
硼砂缓冲液。
108.优选的，所述第二平衡缓冲液为磷酸盐缓冲液或tris
‑
hcl缓冲液，优选的，在第二平衡缓冲液中加入nacl或na2so4来维持电导同时保持部分缓冲能力。
109.对于第二平衡缓冲液中的盐浓度、第二平衡缓冲液的ph以及nacl或na2so4的浓度，本发明不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，在一个实施方案中，所述第二平衡缓冲液中的盐浓度为5mm
‑
0.15m，优选为10mm
‑
50mm，进一步优选为20mm；优选的，ph值为5.5
‑
8.0，优选为6.5
‑
7.5，进一步优选为7.2；优选的，nacl或na2so4的浓度为0
‑
250mm，优选为10mm。
110.所述磷酸盐缓冲液例如可以为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的缓冲液。
111.在一个实施方案中，终洗脱缓冲液选自柠檬酸
‑
磷酸氢二钠缓冲液、醋酸缓冲液、甘氨酸
‑
hcl缓冲液和柠檬酸
‑
柠檬酸钠缓冲液中的一种或两种以上，优选为柠檬酸
‑
磷酸氢
二钠缓冲液。
112.对于终洗脱缓冲液的ph，本发明不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，在一个实施方案中，所述终洗脱缓冲液的ph为2.0
‑
7.0，优选为3.0
‑
4.0。
113.例如，所述终洗脱缓冲液的ph可以为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0等。
114.对于终洗脱缓冲液中的盐浓度，本发明不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，在一个实施方案中，所述终洗脱缓冲液中的盐浓度为5
‑
100mm，优选为10
‑
50mm。
115.例如，所述终洗脱缓冲液中的盐浓度可以为5mm、10mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm等。
116.在一个实施方案中，进行洗脱后可以将亲和介质再生，优选的，再生缓冲液包括但不限于柠檬酸
‑
磷酸氢二钠缓冲液、盐酸、甘氨酸、naoh，优先为柠檬酸
‑
磷酸氢二钠缓冲液及naoh溶液。
117.本发明使用protein a亲和纯化工艺简单易行，能够进行放大纯化生产，细胞发酵上清液无需进行前预处理，洗脱样品得率较高，同时hcp残留量也保持在较低水平(残留控制量不高于0.1％)，从而减轻之后纯化步骤中去除hcp的压力，从而保证抗体最终样品的hcp残留量处于极低水平。同时，发明中经过对不同批次发酵上清液进行亲和纯化工艺验证，证明本发明中的亲和纯化工艺具有良好的稳定性。
118.在一个实施方案中，所述单克隆抗体体外发酵生产使用的哺乳动物包括但不限于目前使用的各种杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞(cho)，优选的是cho细胞。
119.实施例
120.本发明对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
121.实施例1抗人干扰素α受体1单克隆抗体qx006n的制备
122.从上海近岸科技有限公司采购人干扰素α受体1(ifnar1)，用于免疫新西兰兔，运用b细胞克隆技术获得抗原结合特异性抗体克隆，进而筛选出结合人ifnar1并具有人ifnar1抑制活性的单克隆抗体。首先，用binding elisa检测细胞上清，挑选出与人ifnar1结合的克隆；再用hek blue ifnα/β报告基因细胞法进行检测，挑选出具有人ifnar1抑制活性的克隆。以上免疫和筛选过程委托给商业化公司完成。
123.先后挑选出37个克隆进行重组表达，并测序。经测定，362#与1203#的细胞中和活性最好，且两个克隆的序列很相似。因此，先对362#进行人源化改造，当筛选获得1203#、且发现1203#的活性更好时，在362#人源化的基础上对1203#克隆进行人源化改造。利用ncbi igblast进行人igg胚系序列(germline)同源性比对，选择ighv3
‑
66*01作为重链cdr移植模板，将1203#克隆重链的cdr区(即cdr
‑
h1(seq id no:1)、cdr
‑
h2(seq id no:2)和cdr
‑
h3(seq id no:3))移植入ighv3
‑
66*01的骨架区；选择igkv1
‑
6*01作为轻链cdr移植模板，将1203#克隆轻链的cdr区(即cdr
‑
l1(seq id no:4)、cdr
‑
l2(seq id no:5)和cdr
‑
l3(seq id no:6))移植入igkv1
‑
6*01的骨架区；对骨架区特定位点进行回复突变，获得本发明的单克隆抗体qx006n可变区。最终，人源化后的重链可变区序列如seq id no：7所示；人源化后的轻链可变区氨基酸序列如seq id no：8所示。
124.上述重链可变区(seq id no：7)的基因和轻链可变区(seq id no：8)的基因，以362#人源化抗体的基因序列为模板，利用pcr扩增获得。用hindiii和nhei双酶切重链表达质粒phzdch；用hindiii和bsiwi双酶切轻链表达质粒phzdck；用infusion重组酶将pcr扩增基因分别插入对应的表达质粒中，构建重链表达质粒phzdch
‑
362vh
‑
hu6和轻链表达质粒phzdck
‑
362vk
‑
hu20。在人源化改造过程中，1203#人源化抗体的基因用362编号，蛋白用1203编号。
125.通过核酸电泳检测质粒的双酶切结果如图1所示。根据图1的结果可以看出，抗体重链可变区和轻链可变区pcr扩增结果以及双酶切重链和轻链表达质粒的结果，其中，重链和轻链的质粒大小约10000bp，轻链可变区约447bp，重链可变区约471bp。
126.通过对1203#进行人源化改造，获得人源化抗体hzd1203
‑
45。为了降低抗体的adcc效应，将hzd1203
‑
45重链表达质粒phzdch
‑
362vh
‑
hu6的人igg1恒定区换成人igg4，获得重链表达质粒phzdch
‑
362vh
‑
hu6
‑
igg4.1。
127.将序列正确的重链表达质粒phzdch
‑
362vh
‑
hu6
‑
igg4.1和轻链表达质粒phzdck
‑
362vk
‑
hu20共转染expicho
‑
s细胞。转染前一天，将expicho
‑
s细胞稀释成3
×
106个细胞/ml进行转染前传代。转染当天，将细胞密度稀释成6
×
106个细胞/ml，125ml摇瓶装25ml细胞，等待转染。转染和表达过程如图2所示。
128.转染后第4
‑
8天，收获培养上清，用proteina进行一步纯化。用sds
‑
page电泳检测纯化的抗体，将其命名为qx006n(hzd1203
‑
45
‑
igg4.1)，利用蛋白电泳检测该抗体的结果如图3所示。蛋白电泳用变性还原胶检测，图3的结果显示出有两条带，两个条带的大小分别约50kda和25kda，与重链(48.9kda)和轻链(23.4kda)理论分子量一致。
129.实施例2平衡解离常数(k
d
)的测定
130.用biacoret200检测qx006n(hzd1203
‑
45
‑
igg4.1)与人ifnar1的亲和力，所有过程都在25℃进行。采用商品化protein a芯片，通过捕获法固定适量的抗体，使得rmax在50ru左右，捕获流速是10μl/min。将抗原进行梯度稀释，仪器流速切换成30μl/min，按照浓度从低到高的顺序依次流过参比通道和固定抗体的通道，流过缓冲液作为阴性对照。每一个结合、解离完成后用ph1.5甘氨酸再生芯片。用仪器自带分析软件选择kinetics选项中1:1结合模型进行拟合，计算抗体的结合速率常数k
a
，解离速率常数k
d
以及解离平衡常数k
d
值。
131.除此之外，将qx006n(hzd1203
‑
45
‑
igg4.1)与已进入临床iii期的针对人ifnar1的单克隆抗体，即anifrolumab的亲和力进行比较，针对已知抗体的检测方法与对qx006n进行检测的方法相同，结果如表1所示。其中anifrolumab根据专利wo2009100309a2提供的9d4序列，构建表达质粒，瞬转expicho
‑
s细胞自制获得。
132.表1 抗体结合人ifnar1的亲和力
133.样品名称k
a
(105m
‑1s
‑1)k
d
(10
‑5s
‑1)k
d
(10
‑
10
m)hzd1203
‑
45
‑
igg4.13.473.761.08anifrolumab18.6712.400.67
134.表中的数据为：每个样品检测三次，计算平均值的数据。
135.实施例3qx006n和anifrolumab中和人干扰素诱导的hek blue ifnα/β细胞stat1/2磷酸化活性
136.利用hek blue ifnα/β报告基因细胞系测定qx006n拮抗干扰素通过ifnar1介导的
胞内信号分子stat1/2磷酸化活性：将培养液中的细胞以每孔4
×
104细胞加入到96孔内，然后在37℃和5％co2条件下培养过夜。向细胞中加入抗体浓度范围为0至5μg/ml的系列稀释液，并加入0.2ng/ml的ifnα.2b。然后在37℃和5％co2条件下培养24小时，收集细胞培养上清加入10％的quanti
‑
blue
tm
检测试剂在37℃和5％co2条件下反应1小时，然后检测od630nm值及绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的拮抗活性，实验结果表明，qx006n能够抑制干扰素诱导hek blue ifnα/β细胞中stat1/2磷酸化，其抑制干扰素诱导的hek blue ifnα/β细胞中1/2磷酸化活性的ic
50
为5.23ng/ml，而anifrolumab抑制干扰素诱导的hek blue ifnα/β细胞中1/2磷酸化活性的ic
50
为4.43ng/ml。
137.实施例4qx006n和anifrolumab中和人干扰素抑制daudi细胞增殖的活性
138.利用daudi人淋巴瘤细胞系测定qx006n拮抗干扰素通过ifnar1诱导的细胞增殖活性：将培养液中的细胞以每孔4
×
104细胞加入到96孔内，然后在37℃和5％co2条件下培养过夜。向细胞中加入抗体浓度范围为0至20μg/ml的系列稀释液，并加入0.8ng/ml的ifnα.2b。然后在37℃和5％co2条件下培养72小时，收集细胞培养物采用celltiter
‑
glo检测细胞增殖情况及绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的拮抗活性，实验结果表明，qx006n能够抑制干扰素诱导的daudi细胞增殖，其抑制干扰素诱导的daudi细胞增殖活性的ec
50
为29.9ng/ml，而anifrolumab抑制干扰素诱导的daudi细胞增殖活性的ec
50
为31.7ng/ml。
139.实施例5qx006n和anifrolumab中和人干扰素诱导全血释放cxcl10/ip10活性.
140.利用人全血测定qx006n拮抗干扰素通过ifnar1诱导的cxcl10/ip10释放活性：将全血按照100μl/孔加入到96孔板中，暂存于37℃和5％co2条件下，向全血中加入抗体浓度范围为0至40μg/ml的系列稀释液，并加入8ng/ml的ifnα.2b，40ng/ml的tnf
‑
α。然后在37℃和5％co2条件下培养48小时，收集细胞培养上清采用夹心elisa法检测上清中cxcl10/ip10的表达及绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的拮抗活性，实验结果表明，qx006n能够抑制干扰素诱导的全血释放cxcl10/ip10，其抑制干扰素诱导的全血释放cxcl10/ip10活性的ic
50
为698ng/ml，而anifrolumab抑制干扰素诱导的全血释放cxcl10/ip10活性的ic
50
为562ng/ml。
141.实施例6不同预洗脱缓冲液对于重组人源化抗ifnar1单克隆抗体(qx006n)发酵液的hcp的清除效果比较
142.使用cho细胞作为宿主细胞，dynamis作为发酵基础培养基，生产实施例1所得到的抗体qx006n。使用常规的细胞培养工艺进行细胞培养，当细胞活率低于80％或培养至18天时开始收获，采用初级滤器md0hc10fs1和次级滤器mx0hc10fs1对收获液进行深层过滤，收集澄清的细胞培养上清，记为发酵液中间体。将发酵液中间体进行亲和层析，方法如下：
143.采用第一平衡缓冲液(12mmol/l na2hpo4、8mmol/l nah2po4和0.15mol/l nacl)平衡protein a层析柱(merck a，0.15l)，并将qx006n发酵液中间体上样于平衡后的protein a层析柱，以与其结合，然后再使用第一平衡缓冲液进行平衡，至发酵液完全流过层析柱；
144.然后进行中间预洗脱淋洗，中间预洗脱缓冲液的组成如表2所示，淋洗后使用第二平衡缓冲液(6mmol/l na2hpo4、4mmol/l nah2po4，ph7.2)进行平衡；
145.接着进行终洗脱来收集样品，并对收集的样品进行抗体浓度和宿主蛋白(hcp)残留含量进行测定，其中，终洗脱缓冲液为5mmol/l na2hpo4，6.5mmol/l柠檬酸，ph为3.6，并采
用再生缓冲液100mmol/l naoh，1mol/l nacl对层析柱进行再生。
146.抗体浓度的测定方法如下：
147.1.分光光度计波长调至280nm，用第二平衡缓冲液作为对照，进行校零。
148.2.用第二平衡缓冲液对待测样品进行稀释，测定样品在280nm的吸光值(吸光值保证在0.5～1.5之间)，并按照之下公式计算样品浓度(qx006n消光系数为1.469)。
[0149][0150]
所得到的结果如表3所示。
[0151]
hcp含量的测定方法：
[0152]
1.样品稀释：一般根据样品中hcp的估计值来进行稀释倍数选择，使最终hcp的浓度落在标准曲线范围内即可(一般10ng/ml～80ng/ml)。样品一步稀释倍数不超过10倍，最小取样量不低于5μl。
[0153]
2.向取出板条每孔加入anti
‑
cho hrp 100μl。
[0154]
3.上样：按一定排列分别加入标准品、样品、加标样品(各两复孔，标准品不需复孔)，50μl/孔，封板。室温置于水平摇床，180rpm，2小时，避光。
[0155]
4.洗板：弃去孔内液体，用多通道移液器加洗液300μl/孔，静置30秒后甩尽液体，在吸水纸上拍干，洗板4次。最后一次洗板完成后，需尽量拍干孔内残留洗液。
[0156]
5.显色及终止读数：按100μl/孔加tmb试剂(tmb substrate)，静置显色30分钟，避光。30分钟后加终止液(stop solution)100μl/孔，酶标仪450nm读数，以650nm作为参考。
[0157]
6.选择分析软件进行数据分析，以标准品od值为纵坐标，浓度为横坐标，作四参数标准曲线。将样品测得的od值代入标准品曲线，求得所加样品hcp的实测值。
[0158]
7.cho细胞蛋白残留量(％)＝样品平均实测值(ng/ml)
×
稀释倍数/未稀释样品蛋白含量(mg/ml)量求得
‑4(％)，其结果如表3所示。
[0159]
表2 中间预洗脱缓冲液的组成
[0160]
实验预洗脱缓冲液10.1mol/l柠檬酸钠，0.1mol/l盐酸胍，11mmol/l柠檬酸，ph5.8212mmol/l na2hpo4，8mmol/l nah2po4，0.15mol/l nacl，0.5％tween 80，ph7.030.1mol/l柠檬酸钠，0.5mol/l氯化钠，7mmol/l柠檬酸，ph5.8
[0161]
表3 qx006n浓度及hcp残留含量结果
[0162]
实验细胞培养上清hcp含量％(w/w)收率％亲和层析后hcp残留量％(w/w)118.2597.50.089218.5397.70.543318.2697.40.456
[0163]
由表3结果可知，发酵液中间体中hcp残留量大于15％，经过亲和纯化工艺的处理，收率均大于95％；对于hcp的去除，采用上述所述的方法，亲和层析后样品hcp残留低于0.1％，后续纯化工艺步骤去除hcp负荷明显降低，且样品经ph调节，进行后续层析工艺步骤
(阴离子交换层析)上样时，样品保持极为澄清，无需其他处理即可直接进样，增强了工艺的简便性，节省了工艺时间。
[0164]
实施例7不同批次重组人源化抗ifnar1单克隆抗体(qx006n)发酵液的hcp的清除效果比较
[0165]
发酵液中间体的制备及亲和层析方法同实施例6，共制备三个批次的发酵液中间体，中间预洗脱淋洗均采用含盐酸胍的预洗脱缓冲液：0.1mol/l柠檬酸钠，0.1mol/l盐酸胍，11mmol/l柠檬酸，ph5.8淋洗。亲和工艺收率及hcp残留含量测试方法如实施例6所述，其结果如表4所示。
[0166]
表4 不同批次qx006n浓度及hcp残留含量结果
[0167]
批次细胞培养上清hcp含量％(w/w)收率％亲和层析后hcp残留量％(w/w)118.3597.80.078217.3497.60.086318.1296.70.075
[0168]
由表4结果所示，不同批次的qx006n发酵液中间体hcp残留均处于15％以上，细胞培养工艺稳定；三批样品的亲和工艺收率均大于95％，收率符合工艺要求；亲和层析后样品hcp残留均低于0.1％，采用盐酸胍进行预洗脱淋洗对于hcp的去除保持稳定。
[0169]
综上所述，本发明采用上述所述的亲和纯化方法，所得到的单克隆抗体中hcp的残留量保持在较低的水平，残留控制量不高于0.1％，从而减轻了之后纯化步骤中去除hcp的压力，并且本发明所述的亲和纯化工艺具有良好的稳定性。
[0170]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。