用于鳙遗传多样性分析的双重PCR微卫星引物及应用的制作方法

用于鳙遗传多样性分析的双重pcr微卫星引物及应用
技术领域
1.本发明属于动物分子遗传学领域，涉及一种双重pcr微卫星引物及应用，尤其涉及一种用于鳙遗传多样性分析的双重pcr微卫星引物及应用。


背景技术：

2.鳙(学名：aristichthys nobilis)俗称花鲢、胖头鱼、包头鱼、大头鱼、黑鲢、麻鲢、雄鱼，是中国特有淡水鱼类，也是中国四大家鱼之一，具有重要的经济价值。鳙的外形似鲢鱼，体型侧扁，头部较大且宽，口也宽大，且稍微上翘，眼位比较低。鳙生长在淡水湖泊、河流、水库、池塘里，喜栖居在水域的中上层。鳙是江湖洄游性鱼类，亲鱼性成熟时到江中产卵，产卵后仔稚鱼随水流进入沿江湖泊摄食肥育；待冬季湖泊水位回落时，又回到江河的深水区越冬。鳙产漂流性卵，性成熟为4～5龄，雄鱼最小为3龄，繁殖期在4～7月；喜在降雨天气，江水水位陡然上涨，水体流速明显加快时进行产卵。鳙人工繁育的催产季节多在5月初至6月中旬，一般3公斤以上的雌鱼便可达到性成熟。5公斤左右的雌鱼相对怀卵量约4～5万粒/千克，绝对怀卵量20～25万粒，产卵期与草鱼相近。在天然河流和湖泊等水体中，通常可见到10千克以上的个体，最大者可达50千克。在饲料充足的条件下，池塘养殖1龄鱼可重达0.8～1千克。初次性成熟个体体重大，部分地区达10千克以上，但在广西、广东地区，不足10千克的个体通常也可产卵。
3.微卫星标记是目前研究动物保护遗传学中最理想的一类方式，微卫星具有多态性高、共显性遗传、遍布整个基因组等优势，广泛应用于动物遗传性研究。微卫星标记多重pcr是在同一pcr反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的pcr反应。多重pcr具有高效性、系统性、经济简便性等优点。有关鳙的微卫星标记多重pcr国内外未见报道。


技术实现要素：

4.为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种为鳙的选育工作提供了重要的研究基础且具有显著的推广价值的用于鳙遗传多样性分析的双重pcr微卫星引物及应用。
5.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种用于鳙遗传多样性分析的双重pcr微卫星引物，其特征在于：所述用于鳙遗传多样性分析的双重pcr微卫星引物包括如下4组引物序列：
[0007][0008]
一种基于如前所述的用于鳙遗传多样性分析的双重pcr微卫星引物对鳙遗传多样性进行分析的方法，所述方法包括如下步骤：
[0009]
1)取鳙组织样品并从鳙组织样品中提取鳙样品dna；
[0010]
2)利用如前所述的用于鳙遗传多样性分析的双重pcr微卫星引物对鳙样品dna进行pcr扩增；
[0011]
3)把步骤2)得到的pcr扩增产物在10％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，根据分离结果统计每个个体在所有微卫星位点中pcr扩增产物的基因型，根据各个个体的基因分型结果进行遗传多样性分析。
[0012]
作为优选，本发明所采用的步骤2)中的pcr反应体系是25ul：10
×
pcr buffer 2.5ul，2.5mmol/l dntp 0.5ul，2mmol/l mgcl
2 1.5ul，taq酶0.4ul，dna模板3ul，超纯水13.1ul以及每组反应体系两对引物的上下游引物各1ul。
[0013]
作为优选，本发明所采用的步骤2)中的pcr反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，退火温度57℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
[0014]
作为优选，本发明所采用的步骤3)中是将步骤2)得到的pcr扩增产物用10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。
[0015]
如前所述的用于鳙遗传多样性分析的双重pcr微卫星引物在鳙的遗传多样性检测
时、在鳙个体识别时、在计算鳙个体之间亲缘关系的远近时以及在鳙选育时的应用。
[0016]
与现有技术相比，本发明具有以下的优点：
[0017]
利用本发明提供的4组鳙微卫星标记的双重pcr反应体系可以实现对鳙的遗传多样性检测、个体识别，还可以计算个体之间的亲缘关系的远近，避免个体之间产生近亲繁殖，这为鳙的选育工作提供了重要的研究基础。并且本发明所提供的双重pcr方法消耗的财力和人力都比传统的pcr减少了一半，具有巨大的推广价值。本发明提供了4组鳙微卫星标记的双重pcr反应体系可以实现了对鳙群体遗传多样性分析，为鳙的遗传管理、人工繁殖配种制定、遗传背景分析提供了坚实的技术支持。
附图说明
[0018]
图1是双重pcr引物筛选扩增结果图；
[0019]
图2是33个鳙个体之间的亲缘关系分析图。
具体实施方式
[0020]
实施例1
[0021]
鳙dna的提取：
[0022]
1.取33尾鳙，采集鳙的尾部肌肉，提取鳙的基因组dna，提取方式采取传统的酚
‑
氯仿抽提途径。
[0023]
1.1每个个体取0.1g尾鳍放于1.5ml的离心管内，剪碎，加入450μlste抽提缓冲液(10mmol/l tris
‑
hcl，ph8.0；1mmol/l edta，ph8.0)、35μl sds(10％)、15μl蛋白酶k(0.2％)。
[0024]
1.2将离心管放入放在55℃的水浴锅内水浴1个小时至澄清透明。
[0025]
1.3在离心管内加入700ul tris饱和酚，放在震荡机上混匀30分钟，4℃下12000r/min离心10min，将上清液转移入另一个干净的eppendorf管中(注意用尖端剪平的1ml管头吸取上清液，以防混淆下层沉淀)。
[0026]
1.4在上清液中加入等体积酚仿醇混合物(酚、氯仿、异戊醇比例为25：24：1)，振荡混匀15min后，4℃下12000转/min离心10min，吸上清液于另一新eppendorf管中。
[0027]
1.5上清液中加入等体积氯仿，振荡混匀15min后，4℃下12000转/min离10min，吸取上清液。
[0028]
1.6加入
‑
20℃预冷的无水乙醇1ml沉淀dna，收集沉淀。
[0029]
1.7用70％乙醇洗涤沉淀两次，干燥后加入200μl te(10mmol/ltris
‑
hcl，ph 8.0；0.1mmol/l edta，ph 8.0)，室温充分溶解。检测dna提取质量。
[0030]
实施例2
[0031]
鳙微卫星标记开发：
[0032]
利用本课题组的鳙转录组数据，寻找微卫星序列，利用misa软件寻找微卫星位点。寻找微卫星序列的原则为：重复序列至少重复6次，重复单位最少为2个碱基。在微卫星位点序列位置，利用primer软件设计引物，微卫星的段串联序列包含在上下游引物之内。pcr产物的大小为100
‑
500bp，引物的长度为18
‑
24bp，退火温度为55
‑
60℃，设计3000对引物。
[0033]
实施例3
[0034]
鳙优良微卫星标记的筛选：
[0035]
选取4个鳙个体dna，对设计的3000个引物进行pcr扩增，进而进行筛选。具体pcr扩增反应体系为：10
×
pcr buffer 2.5ul，2.5mmol/l dntp 0.5ul，2mmol/l mgcl
2 1.5ul，引物的上下游引物各1ul，5u/ul taq酶0.3ul，dna模板3ul，超纯水15.2ul。pcr扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。把pcr反应产物用10％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳和银染。筛选出条带清晰，无杂带的微卫星引物。
[0036]
实施例4
[0037]
双重微卫星标记分组：
[0038]
根据实施例3的电泳结果，筛选出条带清晰，无杂带的微卫星引物，用24个鳙dna个体做进一步扩增，检测这些微卫星标记对鳙的适用性，进一步筛选出条带清晰，无杂带的微卫星引物。把筛选出的微卫星标记统计出来，计算每个微卫星标记在所有dna个体的pcr产物大小范围，选择pcr产物大小不相交的两个微卫星标记进行组合。对每个微卫星组合进行pcr扩增，检测微卫星组合效果(双重pcr引物筛选如图1所示)。具体pcr反应体系是25ul：10
×
pcr buffer 2.5ul，2.5mmol/l dntp 0.5ul，2mmol/l mgcl
2 1.5ul，每组反应体系两对引物的上下游引物各1ul，5u/ul taq酶0.3ul，dna模板3ul，超纯水13.2ul。pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。pcr产物用10％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳和银染。观测每个组合的pcr反应产物，筛选出条带清晰，无杂带的微卫星引物组合。最终选出4组鳙微卫星标记的双重pcr反应体系的微卫星引物。
[0039]
实施例5
[0040]
鱼微卫星标记的双重pcr反应体系在鳙研究中的应用
[0041]
利用本发明提供的4组鳙微卫星标记的双重pcr反应体系中的微卫星引物对这33个鳙鱼个体的dna进行pcr反应，pcr反应体系是25ul：10
×
pcr buffer 2.5ul，2.5mmol/l dntp 0.5ul，2mmol/l mgcl
2 1.5ul，每组反应体系两对引物的上下游引物各1ul，5u/ul taq酶0.3ul，dna模板3ul，超纯水13.2ul。pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。pcr产物用10％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳和银染。
[0042]
用软件bio
‑
profil判断聚丙烯酰胺凝胶显示的各个个体的等位基因片段的大小，根据这33个个体在4组双重pcr体系中的等位基因大小(如表1所示)，用ntsys软件画出各个个体之间的亲缘关系分析图(如图2所示)。根据聚类分析结果进行鳙群体遗传多样性分析，聚类在一个分支上的个体亲缘关系较近，可能来自同一个家系。从图2中可以看出，13、33、7、27、28、20、32、6、22、31、17、26号个体亲缘关系较近；3、19、12、23、8、4、5号个体亲缘关系较近；2、29、21、10、14、9、24、11、30、15、1、25号个体亲缘关系较近。
[0043]
表1鳙个体遗传信息扩增结果
[0044]