一种α-倒捻子素衍生物及其制备方法和应用与流程

一种
α
‑
倒捻子素衍生物及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于药物化学技术领域。更具体地，涉及一种α
‑
倒捻子素衍生物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.特发性肺纤维化(ipf)是一种慢性进行性疾病，会造成肺功能下降，导致呼吸衰竭并最终导致死亡。来自新冠肺炎大流行的新数据表明，在sars
‑
cov
‑
2感染后出现大量肺纤维化症状，sars、mers等冠状病毒感染也会出现类似的症状。尽管ipf的致病机制已被广泛研究，但仍缺乏对ipf的有效治疗方法；ipf病患者从诊断到治疗的中位生存期仅为2～4年，肺移植是唯一可以提高预期寿命的手术治疗方法，不仅费用高昂、配型难，还具有较高的风险。而药物方面，目前只有两种抗纤维化药物——吡非尼酮(pirfenidone)和尼达尼布(nintedanib)，且这两种药物均存在不同程度的不良反应发生。因此，迫切需要研发更多用于治疗ipf病的新型治疗药物。
3.研究发现，第二信使环磷酸腺苷(camp)在ipf的发展过程中可以抑制成纤维细胞增殖或分化为肌成纤维细胞。磷酸二酯酶4(pde4)，肺成纤维细胞中主要的camp降解酶，在纤维化的进展中被上调，采用选择性pde4抑制剂罗氟司特对ipf模型进行实验，可证明pde4抑制剂具有体内和体外抗纤维化作用；另一方面，pde4广泛参与炎症过程，该过程也在ipf的发病机制中起作用；这些证据均表明pde4是一种潜在ipf治疗靶标。如中国专利申请cn103748073a公开了一种新的软pde4抑制剂，但是其在实际的临床应用中存在剂量依赖性副作用，如呕吐和恶心等。因此，迫切需要开发副作用小、安全性高的新型pde4抑制剂，用于治疗如ipf病等与pde4相关的疾病。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服现有治疗ipf病药物非常少，pde4抑制剂存在依赖性副作用的缺陷和不足，提供一种具有显著抑制pde4效果的α
‑
倒捻子素衍生物。发明人发现，特定结构的α
‑
倒捻子素衍生物具有良好的pde4抑制活性，可以用于pde4代谢相关的疾病治疗中，特别是抗肺纤维化疾病的治疗中。
5.因此，本发明的目的是提供一种α
‑
倒捻子素衍生物。
6.本发明另一目的是提供所述α
‑
倒捻子素衍生物的制备方法。
7.本发明另一目的是提供所述α
‑
倒捻子素衍生物在制备pde4抑制剂中的应用，及一种含有所述α
‑
倒捻子素衍生物的pde4抑制剂。
8.本发明另一目的是提供所述α
‑
倒捻子素衍生物在制备防治抗纤维化药物中的应用，及一种含有所述α
‑
倒捻子素衍生物的防治抗纤维化药物。
9.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
10.一种α
‑
倒捻子素衍生物，其特征在于，具有式(i)结构：
[0011][0012]
其中，r1为氢、烷基、环烷基、烷酰基、苄基或取代苄基；
[0013]
r2为氢、烷基、取代烷基、烯烃基、取代烯烃基、苄基、取代苄基；
[0014]
所述取代烷基、取代烯烃基、取代苄基的取代基团为卤素、烷氧基、甲基磺酰基、酯基或羧基。
[0015]
优选地，所述烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基；所述环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基；所述羧基为甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、反式巴豆酸、顺式巴豆酸等。
[0016]
进一步地，所述r1为氢、c
1～5
烷基、c
1～5
烷酰基、苄基或取代苄基；
[0017]
所述r2为氢、c
1～5
烷基、取代c
1～5
烷基、c
1～5
烯烃基或取代c
1～5
烯烃基。
[0018]
优选地，所述r1为氢、甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、乙酰基、叔丁氧羰基、苄基、3
‑
氟
‑
苄基、4
‑
氟
‑
苄基、3
‑
甲氧基
‑
苄基、3
‑
甲基
‑
苄基、4
‑
甲基磺酰基
‑
苄基；
[0019]
所述r2为氢、
‑
(ch2)
n
‑
coo
‑
ch2ch3、
‑
(ch2)
m
‑
cooh、
‑
ch2ch＝ch
‑
coo
‑
ch2ch3、
‑
ch2ch＝ch
‑
cooh；
[0020]
其中，n＝1～4，m＝1～4。
[0021]
更优选地，所述r1为h、甲基、乙基、异丙基、苄基、3
‑
氟
‑
苄基、3
‑
甲氧基
‑
苄基、3
‑
甲基
‑
苄基、4
‑
甲基磺酰基
‑
苄基；
[0022]
所述r2为
‑
(ch2)3‑
cooh、
‑
(ch2)4‑
cooh或
‑
ch2ch＝ch
‑
cooh。
[0023]
另外的，本发明还提供了所述α
‑
倒捻子素衍生物的制备方法，包括以下步骤：
[0024][0025]
以α
‑
倒捻子素衍生物化合物1作为原料，在溶剂中与醋酐或二碳酸二叔丁酯反应，再在20～60℃、催化剂存在条件下与溴代烷基羧酸酯反应，脱去保护基和长链羧酸酯中酯基，即得；
[0026]
或，以α
‑
倒捻子素衍生物化合物1作为原料，在溶剂中与溴代r1反应，再在20～60℃、催化剂存在条件下与溴代烷基羧酸酯反应，脱去长链羧酸酯中酯基，即得。
[0027]
进一步地，所述溶剂为丙酮或二甲酰胺。
[0028]
更进一步地，所述催化剂为碳酸钾、碳酸铯或氢化钠。
[0029]
另外的，本发明还提供了所述α
‑
倒捻子素衍生物在制备pde4抑制剂中的应用。
[0030]
进一步地，本发明还提供了一种pde4抑制剂，包含有效量的所述α
‑
倒捻子素衍生物。
[0031]
另外的，本发明还提供了所述α
‑
倒捻子素衍生物在制备防治与pde4相关疾病药物中的应用。
[0032]
更进一步地，所述与pde4相关疾病包括组织纤维化、银屑病、老年性痴呆症、慢性阻塞性肺疾病、炎症性肠病和哮喘。现有技术研究发现，pde4与多种疾病密切相关，pde4抑制剂可以作为相关疾病的靶点。
[0033]
优选地，所述与pde4相关疾病为组织纤维化。
[0034]
另外的，本发明还提供了一种防治抗纤维化药物，包含有效量的所述α
‑
倒捻子素衍生物。
[0035]
本发明具有以下有益效果：
[0036]
本发明通过实验证明，本发明提供的α
‑
倒捻子素衍生物对pde4具有良好的选择性抑制作用，效果明显强于阳性对照药物，同时还有较好的药代动力学和类药性，口服无呕吐等不良反应，安全性高，可应用于制备治疗pde4相关疾病的药物中；并且在抗肺纤维化实验中，α
‑
倒捻子素衍生物显示出显著的改善肺功能参数、减少肺纤维化病变的效果，具有较好的开发潜力。
附图说明
[0037]
图1为本发明实施例8中化合物18a在口服1.5g/kg剂量下的急性毒性实验结果统计图。
[0038]
图2为本发明实施例9中化合物18a抗ipf测定结果统计图；其中，图a
‑
各组大鼠肺呼吸功能指标测定结果；图b
‑
各组肺组织的苏木精
‑
伊红染色切片：未染色区域为肺泡上皮癌，蓝色为细胞核，红色为细胞质；图c
‑
各组肺组织的masson染色切片：未染色区域为肺泡上皮癌，深蓝区域为胶原质，红色区域为细胞结构；图d
‑
纤维连接蛋白和α
‑
肌动蛋白表达水平相对于3
‑
磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)抗体的蛋白质印迹分析。
[0039]
图3为本发明实施例10化合物18a抑制体外上皮间质转化结果统计图。
[0040]
图中，p值通过配对试验计算，与对照组相比，
#
p<0.05，
##
p<0.01，
###
p<0.001，
####
p<0.0001，与模型组相比，
*
p<0.05，
**
p<0.01，
***
p<0.001，
****
p<0.0001。
具体实施方式
[0041]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0042]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0043]
本发明合成路线及主要产物如下：
[0044][0045]
实施例1化合物12a和12b的合成
[0046]
化合物1(0.49～0.73mmol)溶于5ml二氯甲烷，然后室温下加入醋酐(0.54mmol)或二碳酸二叔丁酯(0.81mmol)和催化量的(dmap)；室温反应3h后，减压下蒸干溶剂得粗产物，再经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯洗脱，得到黄色固体12a，12b。
[0047]5‑
hydroxy
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyra no[3,2
‑
b]xanthen
‑9‑
yl acetate(12a).yield:93％.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ
13.50(s,1h),7.10(s,1h),6.73(d,j＝10.1hz,1h),6.25(s,1h),5.58(d,j＝10.0hz,1h),5.27
–
5.18(m,1h),4.14(d,j＝6.4hz,2h),3.77(s,3h),2.39(s,3h),1.83(s,3h),1.69(s,3h),1.47(s,6h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ182.1,168.1,160.4,158.0,156.3,153.8,148.9,146.6,138.9,132.2,127.3,122.8,116.9,115.6,110.6,104.6,104.0,94.2,78.2,61.7,28.4,26.4,25.9,20.9,18.2.esi
‑
msm/z:451.2[m h]

.
[0048]
tert
‑
butyl(5
‑
hydroxy
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑9‑
yl)carbonate(12b).yield:74％.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ13.51(s,1h),7.16(s,1h),6.73(d,j＝10.1hz,1h),6.25(s,1h),5.58(d,j＝10.0hz,1h),5.26
–
5.17(m,1h),4.15(d,j＝6.5hz,2h),3.79(s,3h),1.84(s,3h),1.68(s,3h),1.57(s,9h),1.47(s,6h).
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ182.2,160.3,158.0,156.4,153.8,150.3,149.2,146.7,138.8,132.1,127.3,122.9,116.7,115.6,110.0,104.6,104.0,94.2,84.6,78.1,61.7,28.4,27.6,26.4,25.9,18.2.esi
‑
msm/z:509.2[m h]

.
[0049]
实施例2化合物14a～14i的合成
[0050]
化合物1(0.34～0.73mmol)溶于丙酮(4～5ml)，加入k2co3(0.74～0.98mmol)和烷基碘或溴苄或取代溴苄(0.49～0.88mmol)，室温搅拌3～24h；反应完毕经乙酸乙酯萃取，无水na2so4干燥，粗产物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯洗脱)得黄色固体14a～14i。
[0051]5‑
hydroxy
‑
8,9
‑
dimethoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑6‑
one(14a).yield:77％.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ13.75(s,1h),6.74(s,1h),6.73(d,j＝10.0hz,1h),6.23(s,1h),5.57(d,j＝10.0hz,1h),5.28
‑
5.20(m,1h),4.12(d,j＝6.6hz,2h),3.96(s,3h),3.79(s,3h),1.84(s,3h),1.68(s,3h),1.47(s,6h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ182.2,159.8,158.3,158.1,156.4,155.5,144.2,137.4,132.0,127.2,123.3,115.9,112.0,104.6,104.0,98.5,94.1,78.1,61.1,56.2,28.5,26.3,26.1,18.3.esi
‑
ms m/z:423.3[m h]

.
[0052]9‑
ethoxy
‑5‑
hydroxy
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑6‑
one(14b).yield:90％.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ13.77(s,1h),6.73(d,j＝10.0hz,1h),6.71(s,1h),6.22(s,1h),5.56(d,j＝10.0hz,1h),5.28
‑
5.21(m,1h),4.16(q,j＝7.0hz,2h),4.13
‑
4.09(m,2h),3.80(s,3h),1.85(s,3h),1.68(s,3h),1.52(t,j＝7.0hz,3h),1.46(s,6h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ182.2,159.8,158.1,157.6,156.4,155.5,144.3,137.2,131.9,127.2,123.3,115.9,111.8,104.6,104.0,99.0,94.1,78.0,64.7,60.9,28.4,26.3,26.1,18.3,14.7.esi
‑
ms m/z:437.1[m h]

.
[0053]5‑
hydroxy
‑9‑
isopropoxy
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑6‑
one(14c).yield:86％.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ13.80(s,1h),6.74(d,j＝10.0hz,1h),6.72(s,1h),6.23(s,1h),5.56(d,j＝10.0hz,1h),5.29
‑
5.21(m,1h),4.68(hept,j＝6.1hz,1h),4.12(d,j＝6.6hz,2h),3.79(s,3h),1.85(s,3h),1.68(s,3h),1.47(s,6h),1.46(d,j＝6.1hz,6h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ182.2,159.8,158.2,156.6,156.4,155.5,144.8,137.4,131.9,127.2,123.3,115.9,111.6,104.6,104.0,99.8,94.1,78.0,71.3,60.8,28.5,26.4,26.1,22.0,18.3.esi
‑
ms m/z:473.1[m na]
.
[0054]5‑
hydroxy
‑8‑
methoxy
‑9‑
(benzyloxy)
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑6‑
one(14d).yield:99％.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ13.75(s,1h),7.51
‑
7.47(m,1h),7.47
‑
7.45(m,1h),7.45
‑
7.42(m,1h),7.42
‑
7.39(m,1h),7.39
‑
7.34(m,1h),6.80(s,1h),6.73(d,j＝10.5hz,1h),6.22(s,1h),5.57(d,j＝10.0hz,1h),5.29
‑
5.23(m,1h),5.19(s,2h),4.14(d,j＝6.6hz,2h),3.83(s,3h),1.85(s,3h),1.69(s,3h),1.47(s,6h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ182.2,159.9,158.1,157.2,156.4,155.3,144.4,137.5,135.8,132.0,128.9,128.5,127.5,127.2,123.3,115.9,112.2,104.6,104.0,99.7,94.1,78.1,70.8,61.1,28.5,26.4,26.1,18.3.esi
‑
ms m/z:521.1[m na]

.
[0055]5‑
hydroxy
‑8‑
methoxy
‑9‑
((3
‑
fluorobenzyl)oxy)
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑6‑
one(14e).yield:86％.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ13.71(s,1h),7.39(td,j＝7.9,5.7hz,1h),7.26
–
7.18(m,2h),7.06(tdd,j＝8.4,2.6,1.0hz,1h),6.77(s,1h),6.73(d,j＝10.0hz,1h),6.23(d,j＝0.7hz,1h),5.57(d,j＝10.0hz,1h),5.29
–
5.21(m,1h),5.19(s,2h),4.14(d,j＝6.7hz,2h),3.84(s,3h),1.85(s,3h),1.69(s,3h),1.46(s,6h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ182.0,163.0(d,1j
c
‑
f
＝246.9hz),159.8,158.0,156.8,156.2,155.2,144.3,138.2(d,3j
c
‑
f
＝7.4hz),137.6,132.0,130.4(d,3j
c
‑
f
＝8.3hz),127.1,123.1,122.6(d,4j
c
‑
f
＝2.9hz),115.7,115.3(d,2j
c
‑
f
＝21.2hz),114.1(d,2j
c
‑
f
＝22.3hz),112.3,104.5,103.9,99.6,94.0,78.0,69.9(d,4j
c
‑
f
＝2.1hz),61.0,28.3,26.2,25.9,18.2.
19
f nmr(376mhz,cdcl3)δ
‑
112.2.esi
‑
ms m/z:517.1[m h]

.
[0056]5‑
hydroxy
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑9‑
((3
‑
methylbenzyl)oxy)
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑6‑
one(14f).yield:76％.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ13.75(s,1h),7.33
–
7.24(m,3h),7.21
–
7.15(m,1h),6.80(s,1h),6.73(d,j＝10.0hz,1h),6.22(s,1h),5.56(d,j＝10.0hz,1h),5.28
–
5.22(m,1h),5.16(s,2h),4.13(d,j＝6.6hz,2h),3.82(s,3h),2.39(s,3h),1.85(s,3h),1.46(s,6h).
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ182.1,159.7,158.0,157.2,156.2,155.2,144.3,138.5,137.3,135.6,131.9,129.1,128.7,128.0,127.1,124.4,123.1,115.8,112.0,104.5,103.9,99.6,94.0,77.9,70.8,60.9,28.3,26.2,25.9,21.5,18.2.esi
‑
msm/z:513.1[m h]

.
[0057]5‑
hydroxy
‑8‑
methoxy
‑9‑
((3
‑
methoxybenzyl)oxy)
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑6‑
one(14g).yield:85％.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ13.75(s,1h),7.33(t,j＝7.9hz,1h),7.07
–
7.01(m,2h),6.90(ddd,j＝8.3,2.7,1.0hz,1h),6.79(s,1h),6.73(d,j＝10.0hz,1h),6.23(s,1h),5.57(d,j＝10.1hz,1h),5.27
–
5.22(m,1h),5.18(s,2h),4.14(d,j＝6.7hz,2h),3.84(s,3h),3.83(s,3h),1.85(s,3h),1.69(s,3h),1.46(s,6h).
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ182.1,159.9,159.8,158.0,157.1,156.2,155.2,144.3,137.4,137.3,131.9,129.9,127.1,123.2,119.4,115.8,113.7,112.8,112.1,104.5,103.9,99.6,94.0,77.9,70.5,61.0,55.3,28.3,26.2,25.9,18.2.esi
‑
ms m/z:529.1[m h]

.
[0058]5‑
hydroxy
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑9‑
((4
‑
(methylsulfonyl)benzyl)oxy)
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑6‑
one(14h).yield:88％.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ13.67(s,1h),8.01(d,j＝8.3hz,2h),7.69(d,j＝8.2hz,2h),6.76(s,1h),6.72(d,j＝10.0hz,1h),6.22(s,1h),5.57(d,j＝10.0hz,1h),5.28(s,2h),5.27
–
5.22(m,1h),4.14(d,j＝6.6hz,2h),3.84(s,3h),3.09(s,3h),1.86(s,3h),1.69(s,3h),1.47(s,6h).
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ181.9,159.9,157.9,156.5,156.2,155.1,144.2,142.0,140.5,137.9,132.1,128.0,127.8,127.2,123.0,115.7,112.5,104.6,103.9,99.6,94.0,78.0,69.5,61.1,44.5,28.3,26.2,25.9,18.2.esi
‑
msm/z:577.1[m h]

.
[0059]5‑
hydroxy
‑8‑
methoxy
‑9‑
((4
‑
fluorobenzyl)oxy)
‑
2,2
‑
dimethyl7
‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑6‑
one(14i).yield:89％.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ13.72(s,1h),7.45(dd,j＝8.6,5.4hz,2h),7.10(t,j＝8.7hz,2h),6.78(s,1h),6.73(d,j＝10.0hz,1h),6.22(s,1h),5.57(d,j＝10.0hz,1h),5.29
–
5.20(m,1h),5.14(s,2h),4.13(d,j＝6.6hz,2h),3.80(s,3h),1.85(s,3h),1.69(s,3h),1.46(s,6h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ182.0,162.7(d,1j
c
‑
f
＝247.3hz),159.8,158.0,156.9,156.2,155.2,144.3,137.5,131.9,131.4(d,4j
c
‑
f
＝3.1hz),129.3(d,3j
c
‑
f
＝8.3hz),127.1,123.1,115.8(d,2j
c
‑
f
＝21.7hz),115.7,112.2,104.5,103.9,99.5,94.0,78.0,70.1,60.9,28.3,26.2,25.9,18.2.
19
f nmr(376mhz,cdcl3)δ
‑
113.4.esi
‑
msm/z:517.1[m h]

.
[0060]
实施例3化合物13a～13d的合成
[0061]
将化合物12a或12b(0.18～0.20mmol)溶于(5ml)丙酮，加入cs2co3(0.36～0.40mmol)和溴代烷基羧酸乙酯或溴代巴豆酸乙酯(0.18～0.79mmol)，室温搅拌过夜；蒸干溶剂，加入水，乙酸乙酯萃取3次；收集有机相，无水na2so4干燥，移除溶剂得粗产物。硅胶柱层析分离，乙酸乙酯/石油醚洗脱，得白色固体13a～13d。
[0062]
ethyl2
‑
((9
‑
acetoxy
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)acetate(13a).yield:62％.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.07(s,1h),7.04(d,j＝10.1hz,1h),6.55(s,1h),5.69(d,j＝10.2hz,1h),5.26
–
5.21(m,1h),4.69(s,2h),4.26(q,j＝7.2hz,2h),4.11(d,j＝6.6hz,2h),3.76(s,3h),2.38(s,3h),1.83(s,3h),1.67(s,3h),1.47(s,6h),1.30(t,j＝7.1hz,3h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ176.4,169.5,168.3,158.8,157.5,154.0,152.9,148.0,146.5,138.7,131.9,129.8,123.3,119.3,116.8,112.2,110.2,110.1,100.1,77.9,71.3,61.6,61.1,28.4,26.1,25.8,20.9,18.2,14.2.esi
‑
ms m/z:537.1[m h]

.
[0063]
ethyl4
‑
((9
‑
((tert
‑
butoxycarbonyl)oxy)
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)butanoate(13b).yield:39％.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.11(s,1h),6.70(d,j＝10.1hz,1h),6.51(s,1h),5.67(d,j＝10.1hz,1h),5.26
–
5.21(m,1h),4.21
–
4.09(m,4h),4.01(t,j＝6.2hz,2h),3.79(s,3h),2.63(t,j＝7.5hz,2h),2.23
–
2.15(m,2h),1.84(s,3h),1.66(s,3h),1.56(s,9h),1.46(s,6h),1.27(t,j＝7.1hz,3h).
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ176.3,173.5,158.5,157.6,155.0,152.9,150.5,148.2,146.6,138.6,131.5,129.9,123.5,119.2,116.4,112.1,111.0,109.5,99.7,84.4,77.7,74.1,61.6,60.4,30.9,28.3,27.6,26.1,25.8,25.6,18.2,14.3.esi
‑
msm/z:623.3[m h]

.
[0064]
ethyl5
‑
((9
‑
((tert
‑
butoxycarbonyl)oxy)
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)pentanoate(13c).yield:18％.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.11(s,1h),6.71(d,j＝10.1hz,1h),6.51(s,1h),5.66(d,j＝10.1hz,1h),5.27
–
5.21(m,1h),4.17
–
4.11(m,4h),3.99(t,j＝6.1hz,2h),
3.79(s,3h),2.42(t,j＝7.0hz,2h),1.94
–
1.85(m,4h),1.83(s,3h),1.65(s,3h),1.56(s,9h),1.46(s,6h),1.26(t,j＝7.1hz,3h).
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ176.3,173.6,158.5,157.7,155.2,152.9,150.5,148.2,146.5,138.6,131.5,129.8,123.5,119.3,116.5,112.1,111.0,109.5,99.6,84.4,77.7,74.9,61.6,60.3,34.1,29.7,28.3,27.6,26.1,25.8,21.6,18.2,14.3.esi
‑
msm/z:637.3[m h]

.
[0065]
ethyl(e)
‑4‑
((9
‑
((tert
‑
butoxycarbonyl)oxy)
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoate(13d).yield:70％.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.14(dt,j＝15.7,4.8hz,1h),7.12(s,1h),6.68(d,j＝10.1hz,1h),6.55(s,1h),6.25(dt,j＝15.7,1.9hz,1h),5.68(d,j＝10.1hz,1h),5.25
–
5.17(m,1h),4.71(dd,j＝4.8,2.0hz,2h),4.23(q,j＝7.1hz,2h),4.12(d,j＝6.6hz,2h),3.79(s,3h),1.82(s,3h),1.66(s,3h),1.57(s,9h),1.46(s,6h),1.31(t,j＝7.2hz,3h).
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ176.3,166.3,158.6,157.6,154.1,152.9,150.5,148.3,146.6,143.0,138.7,131.7,130.3,123.3,122.1,119.2,116.2,112.3,111.1,109.6,100.2,84.4,77.8,73.1,61.6,60.5,28.3,27.6,26.2,25.8,18.2,14.3.esi
‑
ms m/z:643.3[m na]

.
[0066]
实施例4化合物15a～15g和19b的合成
[0067]
分别将化合物14a～14i(0.14～0.71mmol)溶于丙酮(5ml)或dmf(3ml)，加入k2co3(0.28～1.07mmol)和(e)
‑4‑
溴巴豆酸乙酯(0.28～1.86mmol)，反应物回流过夜，减压移除溶剂，加入水，等体积乙酸乙酯萃取3次；有机相经无水na2so4干燥，蒸掉溶剂得粗产物；硅胶柱层析分离，石油醚/乙酸乙酯洗脱得白色固体15a～15g或19b。
[0068]
ethyl(e)
‑4‑
((8,9
‑
dimethoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoate(15a).yield:79％.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.13(dt,j＝15.7,4.8hz,1h),6.68(s,1h),6.66(d,j＝10.5hz,1h),6.51(s,1h),6.23(dt,j＝15.7,1.8hz,1h),5.65(d,j＝10.1hz,1h),5.26
–
5.19(m,1h),4.70(dd,j＝4.7,1.8hz,2h),4.20(q,j＝7.1hz,2h),4.08(d,j＝6.7hz,2h),3.91(s,3h),3.76(s,3h),1.81(s,3h),1.63(s,3h),1.43(s,6h),1.28(t,j＝7.1hz,3h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ176.2,166.3,158.1,157.5,157.2,154.3,154.1,144.0,143.2,137.2,131.4,130.2,123.7,122.0,116.4,114.3,112.2,111.2,100.2,98.0,77.6,73.1,60.9,60.4,56.0,28.3,26.0,25.9,18.2,14.3.esi
‑
ms m/z:535.2[m h]

.
[0069]
ethyl(e)
‑4‑
((9
‑
ethoxy
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoate(15b).yield:86％.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.14(dt,j＝15.7,4.8hz,1h),6.70(s,1h),6.69(d,j＝10.1hz,1h),6.54(s,1h),6.24(dt,j＝15.7,1.9hz,1h),5.67(d,j＝10.1hz,1h),5.28
‑
5.22(m,1h),4.72(dd,j＝4.8,1.9hz,2h),4.23(q,j＝7.1hz,2h),4.15(q,j＝7.0hz,2h),4.10(d,j＝6.7hz,2h),3.80(s,3h),1.84(s,3h),1.65(s,3h),1.52(t,j＝7.0hz,3h),1.46(s,6h),1.31(t,j＝7.1hz,3h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ176.4,166.4,158.2,157.7,156.6,154.4,154.2,144.2,143.4,137.3,131.5,130.2,123.8,122.1,116.5,114.3,112.3,111.3,100.3,98.6,77.8,73.2,64.5,60.9,60.6,28.4,26.1,26.1,18.4,14.8,14.4.esi
‑
ms m/z:549.2[m h]

.
[0070]
ethyl(e)
‑4‑
((9
‑
isopropoxy
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoate(15c).yield:78％.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.14(dt,j＝15.7,4.8hz,1h),6.68(d,j＝10.1hz,1h),6.66(s,1h),6.52(s,1h),6.24(dt,j＝15.6,1.9hz,1h),5.65(d,j＝10.1hz,1h),5.31
‑
5.20(m,1h),4.72(dd,j＝4.8,1.9hz,2h),4.65(p,j＝6.1hz,1h),4.21(q,j＝7.1hz,2h),4.09(d,j＝6.8hz,2h),3.77(s,3h),1.83(s,3h),1.64(s,3h),1.44(s,6h),1.43(d,j＝6.1hz,6h),1.29(t,j＝7.1hz,3h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ176.3,166.3,158.1,157.6,155.5,154.3,154.2,144.7,143.3,137.4,131.3,130.2,123.8,122.1,116.5,114.1,112.2,111.2,100.2,99.4,77.7,73.1,71.0,60.7,60.5,28.3,26.1,26.0,21.9,18.3,14.3.esi
‑
ms m/z:563.2[m h]

.
[0071]
ethyl(e)
‑4‑
((9
‑
(benzyloxy)
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoate(15d).yield:81％.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.50
‑
7.47(m,1h),7.47
‑
7.45(m,1h),7.45
‑
7.41(m,1h),7.41
‑
7.38(m,1h),7.38
‑
7.33(m,1h),7.15(dt,j＝15.7,4.8hz,1h),6.78(s,1h),6.69(d,j＝10.1,1h),6.53(s,1h),6.25(dt,j＝15.7,1.9hz,1h),5.67(d,j＝10.1hz,1h),5.29
‑
5.23(m,1h),5.20(s,2h),4.72(dd,j＝4.8,1.9hz,2h),4.23(q,j＝7.1hz,2h),4.12(d,j＝6.6hz,2h),3.83(s,3h),1.84(s,3h),1.66(s,3h),1.46(s,6h),1.31(t,j＝7.1hz,3h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ176.4,166.4,158.2,157.6,156.3,154.2,144.4,143.3,137.5,136.0,131.5,130.3,128.9,128.4,127.4,123.8,122.2,116.5,114.7,112.3,111.3,100.3,99.3,77.8,73.2,70.7,61.0,60.6,28.4,26.2,26.1,18.4,14.4.esi
‑
ms m/z:611.2[m h]

.
[0072]
ethyl(e)
‑4‑
((8
‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑9‑
((3
‑
methylbenzyl)oxy)
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoate(15e).yield:80％.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.34
‑
7.23(m,3h),7.20
‑
7.09(m,2h),6.77(s,1h),6.69(d,j＝10.1hz,1h),6.53(d,j＝0.7hz,1h),6.24(dt,j＝15.7,1.9hz,1h),5.67(d,j＝10.1hz,1h),5.29
‑
5.21(m,1h),5.16(s,2h),4.72(dd,j＝4.8,1.9hz,2h),4.23(q,j＝7.1hz,2h),4.12(d,j＝6.7hz,2h),3.83(s,3h),2.39(s,3h),1.84(s,3h),1.66(s,3h),1.46(s,6h),1.31(t,j＝7.1hz,3h).
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ176.3,166.3,158.1,157.5,156.3,154.1,144.3,143.2,138.5,137.4,135.8,131.4,130.1,129.0,128.6,128.0,124.4,123.7,122.1,116.4,114.6,112.2,111.2,100.2,99.2,77.6,73.1,70.7,60.9,60.4,28.3,26.0,25.9,21.5,18.2,14.3.esi
‑
msm/z:625.2[m h]

.
[0073]
ethyl(e)
‑4‑
((8
‑
methoxy
‑9‑
((3
‑
methoxybenzyl)oxy)
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoate(15f).yield:84％.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.33(t,j＝7.9hz,1h),7.14(dt,j＝15.7,4.8hz,1h),7.07
–
7.01(m,2h),6.89(ddd,j＝8.3,2.7,0.9hz,1h),6.77(s,1h),6.69(d,j＝10.1hz,1h),6.25(dt,j＝15.7,1.9hz,1h),5.67(d,j＝10.1hz,1h),5.28
–
5.22(m,1h),5.18(s,2h),4.72(dd,j＝4.8,1.9hz,2h),4.23(q,j＝7.1hz,2h),4.12(d,j＝6.7hz,2h),3.84(s,3h),3.83(s,3h),1.46(s,6h),1.31(t,j＝7.1hz,3h).
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ176.3,166.3,159.9,158.1,157.5,156.1,154.1,144.3,143.2,137.5,137.5,131.5,
130.2,129.8,123.6,122.0,119.4,116.4,114.6,113.6,112.8,112.2,111.2,100.2,99.3,77.6,73.1,70.5,60.9,60.5,55.3,28.3,26.0,25.9,18.2,14.3.esi
‑
msm/z:641.2[m h]

.
[0074]
ethyl(e)
‑4‑
((8
‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑9‑
((4
‑
(methyl
‑
sulfonyl)benzyl)oxy)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoate(15g).yield:71％.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.01(d,j＝8.3hz,2h),7.70(d,j＝8.3hz,2h),7.14(dt,j＝15.7,4.8hz,1h),6.74(s,1h),6.68(d,j＝10.1hz,1h),6.53(s,1h),6.25(dt,j＝15.7,1.8hz,1h),5.68(d,j＝10.1hz,1h),5.29(s,2h),5.27
–
5.21(m,1h),4.72(dd,j＝4.8,1.8hz,2h),4.23(q,j＝7.1hz,2h),4.13(d,j＝6.7hz,2h),3.84(s,3h),3.08(s,3h),1.85(s,3h),1.67(s,3h),1.46(s,6h),1.31(t,j＝7.1hz,3h).
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ176.1,166.3,158.2,157.4,155.5,154.1,154.0,144.2,143.1,142.2,140.4,137.9,131.6,130.3,127.9,127.7,123.4,122.1,116.3,115.1,112.3,111.2,100.1,99.3,77.7,73.1,69.5,61.1,60.5,44.5,28.3,26.0,25.9,18.2,14.3.esi
‑
msm/z:689.1[m h]

.
[0075]
ethyl(e)
‑4‑
((9
‑
((3
‑
fluorobenzyl)oxy)
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoate(19b).yield:89％.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.38(td,j＝7.9,5.7hz,1h),7.26
–
7.11(m,3h),7.05(td,j＝8.6,2.7hz,1h),6.74(s,1h),6.69(d,j＝10.1hz,1h),6.53(s,1h),6.25(dt,j＝15.7,2.0hz,1h),5.67(d,j＝10.1hz,1h),5.28
–
5.22(m,1h),5.18(s,2h),4.72(dd,j＝4.8,1.9hz,2h),4.23(q,j＝7.1hz,2h),4.13(d,j＝6.7hz,2h),3.84(s,3h),1.85(s,3h),1.66(s,3h),1.46(s,6h),1.31(t,j＝7.1hz,3h).
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ176.2,166.3,163.0(d,1j
c
‑
f
＝246.8hz),158.2,157.5,155.9,154.1,154.1,144.3,143.2,138.4(d,3j
c
‑
f
＝7.2hz),137.6,131.5,130.4(d,3j
c
‑
f
＝8.3hz),130.2,123.6,122.6(d,4j
c
‑
f
＝2.9hz),122.1,116.4,115.2(d,2j
c
‑
f
＝21.0hz),114.8,114.1(d,2j
c
‑
f
＝22.2hz),112.2,111.2,100.2,99.2,77.7,73.1,69.8(d,4j
c
‑
f
＝2.0hz),61.0,60.4,28.3,26.0,25.9,18.2,14.3.
19
fnmr(376mhz,cdcl3)δ
‑
112.3.esi
‑
msm/z:629.1[m h]

.
[0076]
实施例5化合物15h、15i和18d的合成
[0077]
将化合物14i(0.19～4.3mmol)溶于(5～20ml)丙酮，加入cs2co3(0.38～8.5mmol)，(e)
‑4‑
溴代巴豆酸乙酯(8.6mmol)或4
‑
溴丁酸乙酯(0.39mmol)，回流过夜，减压除掉溶剂，加入水，等体积的乙酸乙酯萃取3次；收集有机相，经无水na2so4干燥，硅胶柱层析，石油醚/乙酸乙酯洗脱得白色固体15h、15i和18d。
[0078]
ethyl4
‑
((9
‑
((4
‑
fluorobenzyl)oxy)
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)butanoate(15h).yield:88％.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.45(dd,j＝8.5,5.5hz,2h),7.10(t,j＝8.6hz,2h),6.76(s,1h),6.71(d,j＝10.1hz,1h),6.50(s,1h),5.66(d,j＝10.1hz,1h),5.29
–
5.24(m,1h),5.14(s,2h),4.19
–
4.10(m,4h),4.02(t,j＝6.2hz,2h),3.81(s,3h),2.63(t,j＝7.5hz,2h),2.20(p,j＝6.6hz,2h),1.85(s,3h),1.66(s,3h),1.46(s,6h),1.27(t,j＝7.1hz,3h).
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ176.2,173.5,162.6(d,1j
c
‑
f
＝246.9hz),158.1,157.5,155.8,154.9,154.0,144.2,137.4,131.7(d,4j
c
‑
f
＝3.2hz),131.3,129.7,129.2(d,3j
c
‑
f
＝8.2hz),123.7,116.5,115.7(d,2j
c
‑
f
＝21.6hz),114.8,112.1,111.1,99.7,99.2,77.5,
74.1,69.9,60.9,60.4,30.9,28.3,26.0,25.9,25.6,18.2,14.3.
19
fnmr(376mhz,cdcl3)δ
‑
113.6.esi
‑
msm/z:631.2[m h]

.
[0079]
ethyl(z)
‑4‑
((9
‑
((4
‑
fluorobenzyl)oxy)
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoate(15i).compound15i was isolated from the crude product of compound 18d.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.45(dd,j＝8.5,5.4hz,2h),7.11(t,j＝8.7hz,2h),6.83(dt,j＝11.7,4.8hz,1h),6.76(s,1h),6.71(d,j＝10.1hz,1h),6.53(s,1h),5.88(dt,j＝11.7,2.4hz,1h),5.66(d,j＝10.1hz,1h),5.31
–
5.25(m,1h),5.15(s,2h),5.13(dd,j＝4.7,2.4hz,2h),4.13(q,j＝7.2hz,4h),3.80(s,3h),1.83(s,3h),1.64(s,3h),1.46(s,6h),1.25(t,j＝7.1hz,3h).
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ176.2,166.0,162.6(d,1j
c
‑
f
＝246.8hz),158.1,157.5,155.9,154.5,154.1,147.7,144.1,137.5,131.6(d,4j
c
‑
f
＝3.1hz),131.3,129.9,129.2(d,3j
c
‑
f
＝8.2hz),123.6,119.1,116.5,115.7(d,2j
c
‑
f
＝21.6hz),114.7,112.2,111.1,100.0,99.2,77.6,73.5,69.9,60.9,60.2,28.3,26.1,25.8,18.2,14.2.
19
fnmr(376mhz,cdcl3)δ
‑
113.6.esi
‑
msm/z:629.2[m h]

.
[0080]
ethyl(e)
‑4‑
((9
‑
((4
‑
fluorobenzyl)oxy)
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoate(18d).yield：86％.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.45(dd,j＝8.5,5.5hz,2h),7.18
–
7.07(m,3h),6.77(s,1h),6.69(d,j＝10.1hz,1h),6.54(s,1h),6.24(dt,j＝15.7,1.9hz,1h),5.67(d,j＝10.1hz,1h),5.29
–
5.20(m,1h),5.15(s,2h),4.72(dd,j＝4.8,1.9hz,2h),4.23(q,j＝7.1hz,2h),4.12(d,j＝6.7hz,2h),3.81(s,3h),1.84(s,3h),1.66(s,3h),1.46(s,6h),1.31(t,j＝7.1hz,3h).
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ176.2,166.3,162.7(d,1j
c
‑
f
＝247.0hz),158.1,157.5,156.0,154.11,154.08,144.3,143.2,137.6,131.6(d,4j
c
‑
f
＝3.1hz),131.5,130.2,129.2(d,3j
c
‑
f
＝8.3hz),123.6,122.0,116.4,115.7(d,2j
c
‑
f
＝21.6hz),114.7,112.2,111.2,100.1,99.2,77.7,73.1,70.0,60.9,60.4,28.3,26.0,25.9,18.2,14.3.
19
f nmr(376mhz,cdcl3)δ
‑
113.6.esi
‑
ms m/z:629.1[m h]

.
[0081]
实施例6化合物16a～16c、17a～17e、18a～18c、19a和20a～20c的合成
[0082]
将化合物13a～13d,15a～15i,18d和19b(0.04～0.56mmol)分别溶于丙酮/水(v/v,1:4)，加入naoh(0.22～2.81mmol)，60℃反应2～4小时，反应完毕倒入10ml水中，5％hcl酸化调ph 1，乙酸乙酯萃取；有机相经无水na2so4干燥，浓缩得粗产物；硅胶层析分离，二氯甲烷/甲醇洗脱，得目标化合物(白色固体)。
[0083]2‑
((9
‑
hydroxy
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)acetic acid(16a).yield:58％.1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ6.91(d,j＝10.1hz,1h),6.75(s,1h),6.64(s,1h),5.85(d,j＝10.1hz,1h),5.17
–
5.09(m,1h),4.57(s,2h),3.97(d,j＝6.7hz,2h),3.69(s,3h),1.77(s,3h),1.61(s,3h),1.42(s,6h).
13
c nmr(100mhz,dmso
‑
d6)δ175.9,170.8,158.1,157.3,156.3,154.0,153.9,143.8,136.7,130.9,130.7,124.3,116.6,113.1,111.9,110.3,101.8,99.9,78.2,71.1,60.6,28.3,26.0,25.8,18.4.esi
‑
hrms m/z:[m h]

(calcd for c
26
h
26
o
8 467.1700,found 467.1696).
[0084]4‑
((9
‑
hydroxy
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)butanoic acid(16b).yield:73％.1h nmr(400mhz,methanol
‑
d4)δ6.74
–
6.69(m,2h),6.51(s,1h),5.78(d,j＝10.1hz,1h),5.24
–
5.17(m,1h),4.06(d,j＝6.5hz,2h),3.97(t,j＝6.3hz,2h),3.76(s,3h),2.59(t,j＝7.4hz,2h),2.19
–
2.10(m,2h),1.82(s,3h),1.66(s,3h),1.45(s,6h).
13
c nmr(100mhz,methanol
‑
d4)δ178.2,177.2,159.8,159.0,157.2,156.1,155.8,145.0,138.4,131.9,131.4,125.3,117.1,114.7,113.3,111.9,102.5,100.7,78.8,75.5,61.3,31.6,28.5,26.9,26.7,26.0,18.4.esi
‑
hrms m/z:[m h]

(calcd for c
28
h
30
o
8 495.2013,found 495.2009).
[0085]5‑
((9
‑
hydroxy
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)pentanoic acid(16c).yield:77％.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ6.80(s,1h),6.71(d,j＝10.1hz,1h),6.52(s,1h),5.66(d,j＝10.1hz,1h),5.30
–
5.21(m,1h),4.08(d,j＝6.4hz,2h),3.99(t,j＝5.8hz,2h),3.80(s,3h),2.50(t,j＝6.8hz,2h),1.98
–
1.87(m,4h),1.82(s,3h),1.65(s,3h),1.45(s,6h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ178.8,176.4,158.2,157.6,155.1,154.7,153.5,142.5,136.9,131.6,129.8,123.6,116.6,114.7,112.0,111.0,101.2,99.7,77.5,74.7,62.0,33.7,29.5,28.3,26.3,25.8,21.4,18.2.esi
‑
hrms m/z:[m h]

(calcd for c
29
h
32
o
8 509.2170,found 509.2166).
[0086]
(e)
‑4‑
((9
‑
hydroxy
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoic acid(17a).yield:71％.1h nmr(400mhz,meod cdcl3)δ7.13(dt,j＝15.6,4.9hz,1h),6.72(s,1h),6.69(d,j＝10.1hz,1h),6.57(s,1h),6.18(dt,j＝15.7,1.9hz,1h),5.81(d,j＝10.1hz,1h),5.20(d,j＝6.5hz,1h),4.66(dd,j＝4.8,1.5hz,2h),4.06(d,j＝6.3hz,2h),3.76(s,3h),1.82(s,3h),1.65(s,3h),1.46(s,6h).
13
c nmr(100mhz,meod cdcl3)δ178.1,169.5,159.7,158.9,157.3,155.8,155.2,145.0,144.7,138.4,132.0,131.7,125.1,123.5,116.9,114.6,113.4,111.9,102.4,101.1,78.9,74.3,61.3,28.5,26.9,26.0,18.4.esi
‑
hrmsm/z:[m h]

(calcd for c
28
h
28
o
8 493.1857,found 493.1857).
[0087]
(e)
‑4‑
((8,9
‑
dimethoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoic acid(17b).yield:44％.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.26(dt,j＝15.6,4.5hz,1h),6.72(s,1h),6.68(d,j＝10.1hz,1h),6.55(s,1h),6.30(dt,j＝15.6,1.8hz,1h),5.69(d,j＝10.1hz,1h),5.27
–
5.21(m,1h),4.77(dd,j＝4.5,1.9hz,2h),4.11(d,j＝6.6hz,2h),3.95(s,3h),3.79(s,3h),1.83(s,3h),1.65(s,3h),1.46(s,6h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ176.4,171.3,158.2,157.6,157.4,154.5,154.1,146.1,144.1,137.4,131.7,130.4,123.7,121.1,116.4,114.5,112.3,111.3,100.3,98.1,77.8,73.0,61.1,56.1,28.4,26.1,26.1,18.3.esi
‑
hrms m/z:[m h]

(calcd for c
29
h
30
o
8 507.2013,found 507.2017).
[0088]
(e)
‑4‑
((9
‑
ethoxy
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoic acid(17c).yield:64％.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.29
‑
7.22(m,1h),6.69(s,1h),6.68(d,j＝10.1hz,1h),6.54(s,1h),6.29(dt,j＝15.6,2.0hz,1h),5.68(d,j＝10.1hz,1h),5.28
‑
5.21(m,1h),4.77(dd,j＝
4.2,1.5hz,2h),4.22
‑
4.12(m,2h),4.11(d,j＝7.1hz,2h),3.80(s,3h),1.84(s,3h),1.66(s,3h),1.52(t,j＝7.0hz,3h),1.46(s,6h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ176.4,171.3,158.2,157.7,156.7,154.4,154.1,146.2,144.2,137.3,131.5,130.4,123.7,121.1,116.4,114.3,112.2,111.3,100.3,98.6,77.8,73.0,64.5,60.9,28.4,26.1,26.1,18.3,14.7.esi
‑
hrms m/z:[m h]

(calcd for c
30
h
32
o
8 521.2170,found 521.2166).
[0089]
(e)
‑4‑
((9
‑
isopropoxy
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoic acid(17d).yield:63％.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.29
‑
7.21(m,2h),6.70(s,1h),6.68(d,j＝10.0hz,1h),6.55(s,1h),6.29(dt,j＝15.7,1.9hz,1h),5.68(d,j＝10.1hz,1h),5.28
‑
5.22(m,1h),4.77(dd,j＝4.5,2.0hz,2h),4.67(hept,j＝6.1hz,1h),4.10(d,j＝6.7hz,2h),3.79(s,3h),1.84(s,3h),1.66(s,3h),1.46(s,6h),1.46(s,3h),1.44(s,3h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ176.4,170.8,158.2,157.7,155.6,154.4,154.1,146.1,144.8,137.5,131.5,130.4,123.8,121.0,116.4,114.2,112.2,111.3,100.3,99.5,77.8,73.0,71.1,60.8,28.4,26.2,26.1,22.0,18.3.esi
‑
hrms m/z:[m h]

(calcd for c
31
h
34
o
8 535.2326,found 535.2321).
[0090]
(e)
‑4‑
((9
‑
(benzyloxy)
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoic acid(17e).yield:55％.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.52
‑
7.47(m,1h),7.47
‑
7.45(m,1h),7.45
‑
7.42(m,1h),7.42
‑
7.38(m,1h),7.38
‑
7.33(m,1h),7.29
‑
7.22(m,1h),6.78(s,1h),6.68(d,j＝10.0hz,1h),6.54(s,1h),6.36
‑
6.24(m,1h),5.69(d,j＝10.1hz,1h),5.25(t,j＝6.1hz,1h),5.20(s,2h),4.82
‑
4.70(m,2h),4.12(d,j＝6.4hz,2h),3.83(s,3h),1.84(s,3h),1.66(s,3h),1.46(s,6h).
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ176.4,171.0,158.3,157.6,156.3,154.3,154.1,146.1,144.4,137.6,136.0,131.6,130.4,128.9,128.4,127.4,123.7,121.1,116.4,114.7,112.3,111.3,100.4,99.4,77.8,73.0,70.7,61.1,28.4,26.2,26.1,18.4.esi
‑
hrms m/z:[m h]

(calcd for c
35
h
33
fo
8 583.2326,found 583.2321).
[0091]
(e)
‑4‑
((9
‑
((4
‑
fluorobenzyl)oxy)
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoic acid(18a).yield:78％.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.45(dd,j＝8.6,5.4hz,2h),7.25(dt,j＝15.6,4.5hz,1h),7.11(t,j＝8.7hz,2h),6.77(s,1h),6.68(d,j＝10.2hz,1h),6.55(s,1h),6.30(dt,j＝15.6,2.0hz,1h),5.69(d,j＝10.1hz,1h),5.27
–
5.21(m,1h),5.15(s,2h),4.77(dd,j＝4.5,2.0hz,2h),4.12(d,j＝6.7hz,2h),3.81(s,3h),1.84(s,3h),1.66(s,3h),1.47(s,6h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ176.3,170.6,162.7(d,1j
c
‑
f
＝246.9hz),158.2,157.5,156.0,154.1,154.0,146.0,144.3,137.6,131.6(d,4j
c
‑
f
＝3.2hz),131.55,130.3,129.3(d,3j
c
‑
f
＝8.2hz),123.5,120.9,116.2,115.7(d,2j
c
‑
f
＝21.7hz),114.7,112.2,111.2,100.2,99.2,77.7,72.8,70.0,60.9,28.3,26.0,25.9,18.2.
19
fnmr(376mhz,cdcl3)δ
‑
113.5.esi
‑
hrms m/z:[m h]

(calcd for c
35
h
33
fo
8 601.2232,found 601.2232).
[0092]4‑
((9
‑
((4
‑
fluorobenzyl)oxy)
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)butanoic acid(18b).yield:87％.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.45(dd,j＝8.6,5.4hz,2h),7.10(t,j＝8.7hz,2h),6.77(s,1h),6.68(d,j＝10.1hz,1h),6.53(s,1h),5.68(d,j＝10.1hz,1h),5.28
–
5.23(m,1h),4.11
(d,j＝6.6hz,2h),4.02(t,j＝5.9hz,2h),3.81(s,3h),2.76(t,j＝7.1hz,2h),2.21(p,j＝6.7hz,2h),1.85(s,3h),1.66(s,3h),1.46(s,6h).
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ177.7,176.7,162.7(d,1j
c
‑
f
＝246.9hz),158.4,157.6,156.1,154.7,154.2,144.3,137.5,131.6(d,4j
c
‑
f
＝3.2hz),131.5,130.0,129.3(d,3j
c
‑
f
＝8.3hz),123.6,116.3,115.7(d,2j
c
‑
f
＝21.6hz),114.6,112.2,111.0,99.9,99.2,77.7,74.1,70.0,60.9,31.4,28.3,26.1,25.9,25.7,18.2.
19
fnmr(376mhz,cdcl3)δ
‑
113.5.esi
‑
hrms m/z:[m h]

(calcd for c
35
h
35
fo
8 603.2389,found 603.2373).
[0093]
(z)
‑4‑
((9
‑
((4
‑
fluorobenzyl)oxy)
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoic acid(18c).yield:52％.1hnmr(400mhz,chloroform
‑
d)δ7.45(dd,j＝8.5,5.4hz,2h),7.10(t,j＝8.7hz,2h),6.92(dt,j＝11.8,4.6hz,1h),6.76(s,1h),6.67(d,j＝10.1hz,1h),6.52(s,1h),5.89(dt,j＝11.8,2.4hz,1h),5.66(d,j＝10.1hz,1h),5.26
–
5.21(m,1h),5.14(s,2h),5.06(dd,j＝4.6,2.5hz,2h),4.09(d,j＝6.8hz,2h),3.79(s,3h),1.80(s,3h),1.61(s,3h),1.45(s,6h).
13
cnmr(101mhz,cdcl3)δ176.2,170.4,162.6(d,1j
c
‑
f
＝247.0hz),158.2,157.5,156.0,154.2,154.1,150.2,144.2,137.6,131.6(d,4j
c
‑
f
＝3.3hz),131.4,130.1,129.2(d,3j
c
‑
f
＝8.2hz),123.5,118.3,116.3,115.7(d,2j
c
‑
f
＝21.6hz),114.6,112.1,111.0,100.1,99.2,77.7,73.4,69.9,60.9,28.3,26.0,25.8,18.2.
19
fnmr(376mhz,cdcl3)δ
‑
113.6.esi
‑
hrms m/z:[m h]

(calcd for c
35
h
33
fo
8 601.2232,found 601.2222).
[0094]
(e)
‑4‑
((9
‑
((3
‑
fluorobenzyl)oxy)
‑8‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoic acid(19a).yield:87％.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.39(td,j＝8.0,5.8hz,1h),7.29
–
7.18(m,3h),7.05(tdd,j＝8.4,2.6,1.0hz,1h),6.75(s,1h),6.69(d,j＝10.1hz,1h),6.54(s,1h),6.30(dt,j＝15.7,1.9hz,1h),5.69(d,j＝10.1hz,1h),5.27
–
5.22(m,1h),5.19(s,2h),4.77(dd,j＝4.5,2.0hz,2h),4.13(d,j＝6.7hz,2h),3.84(s,3h),1.85(s,3h),1.67(s,3h),1.47(s,6h).
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ176.2,170.8,163.0(d,1j
c
‑
f
＝246.7hz),158.2,157.5,155.9,154.1,154.0,146.0,144.3,138.4(d,3j
c
‑
f
＝7.4hz),137.7,131.6,130.4(d,3j
c
‑
f
＝8.4hz),130.3,123.5,122.6(d,4j
c
‑
f
＝2.8hz),120.9,116.2,115.2(d,2j
c
‑
f
＝21.3hz),114.8,114.1(d,2j
c
‑
f
＝22.4hz),112.2,111.2,100.2,99.2,77.7,72.8,69.8(d,4j
c
‑
f
＝1.9hz),61.0,28.3,26.0,25.9,18.2.
19
fnmr(376mhz,cdcl3)δ
‑
112.3.esi
‑
hrmsm/z:[m h]

(calcdforc
35
h
33
fo
8 601.2232,found 601.2236).
[0095]
(e)
‑4‑
((8
‑
methoxy
‑9‑
((3
‑
methoxybenzyl)oxy)
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoic acid(20a).yield:79％.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.33
–
7.21(m,4h),7.19
–
7.15(m,1h),6.78(s,1h),6.69(d,j＝10.1hz,1h),6.55(s,1h),6.30(dt,j＝15.7,2.0hz,1h),5.69(d,j＝10.1hz,1h),5.29
–
5.22(m,1h),5.16(s,2h),4.77(dd,j＝4.6,2.0hz,2h),4.12(d,j＝6.7hz,2h),3.83(s,3h),2.39(s,3h),1.84(s,3h),1.66(s,3h),1.46(s,6h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ176.3,171.0,158.1,157.5,156.3,154.2,154.0,146.0,144.3,138.5,137.4,135.8,131.5,130.3,129.0,128.6,128.0,124.4,123.6,121.0,116.3,114.5,
112.2,111.2,100.3,99.2,77.7,72.9,70.7,60.9,28.3,26.0,25.9,21.5,18.2.esi
‑
hrms m/z:[m h]

(calcd for c
36
h
36
o
8 597.2483,found 597.2473).
[0096]
(e)
‑4‑
((8
‑
methoxy
‑9‑
((3
‑
methoxybenzyl)oxy)
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoic acid(20b).yield:75％.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.33(t,j＝7.9hz,1h),7.25(dt,j＝15.7,4.5hz,1h),7.08
–
7.01(m,2h),6.89(dd,j＝8.1,2.6hz,1h),6.77(s,1h),6.68(d,j＝10.1hz,1h),6.54(s,1h),6.30(dt,j＝15.7,2.0hz,1h),5.69(d,j＝10.1hz,1h),5.28
–
5.22(m,1h),5.18(s,2h),4.77(dd,j＝4.6,2.0hz,2h),4.12(d,j＝6.7hz,2h),3.84(s,3h),3.83(s,3h),1.84(s,3h),1.66(s,3h),1.46(s,6h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ176.3,170.4,159.9,158.2,157.5,156.2,154.1,154.0,145.9,144.3,137.5,131.5,130.3,129.8,123.6,120.9,119.4,116.3,114.6,113.6,112.8,112.2,111.2,100.3,99.3,77.7,72.9,70.5,61.0,55.3,28.3,26.0,25.9,18.2.esi
‑
hrms m/z:[m h]

(calcd for c
36
h
36
o
9 613.2432,found 613.2421).
[0097]
(e)
‑4‑
((8
‑
methoxy
‑
2,2
‑
dimethyl
‑7‑
(3
‑
methylbut
‑2‑
en
‑1‑
yl)
‑9‑
((4
‑
(methylsulfonyl)benzyl)oxy)
‑6‑
oxo
‑
2h,6h
‑
pyrano[3,2
‑
b]xanthen
‑5‑
yl)oxy)but
‑2‑
enoic acid(20c).yield:67％.1hnmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ8.00(d,j＝8.3hz,2h),7.77(d,j＝8.3hz,2h),7.12(s,1h),7.02(dt,j＝15.7,4.8hz,1h),6.66(s,1h),6.61(d,j＝10.2hz,1h),6.11(dt,j＝15.7,1.9hz,1h),5.90(d,j＝10.1hz,1h),5.44(s,2h),5.17
–
5.10(m,1h),4.65(dd,j＝4.8,1.9hz,2h),4.01(d,j＝6.7hz,2h),3.76(s,3h),3.24(s,3h),1.77(s,3h),1.61(s,3h),1.43(s,6h).
13
c nmr(100mhz,dmso
‑
d6)δ175.6,167.3,158.2,157.3,156.1,154.0,153.9,144.2,143.6,142.6,140.9,136.5,131.5,131.0,128.5,127.8,124.1,122.8,115.8,114.2,112.3,111.1,100.3,100.1,78.3,73.3,69.7,61.0,43.9,28.3,26.1,25.8,18.5.esi
‑
hrms m/z:[m h]

(calcd for c
36
h
36
o
10
s 661.2102,found 661.2090).
[0098]
实施例7化合物对pde4抑制活性测定
[0099]
测定化合物对pde4d2的抑制活性，以化合物18a为代表，测定其对pdes亚型选择性，其他化合物效果与化合物18a类似。
[0100]
实验方法：
[0101]
先将表达pdes质粒转化入大肠杆菌(e.coli)菌株bl21(codonplus)中，携带重组质粒的大肠杆菌(e.coli)细胞在lb培养基中在37℃下生长至a600＝0.7，然后加入0.1mm异丙基
‑
β
‑
d
‑
硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导表达，并在15℃培养20h。重组的pdes催化结构域通过ni
‑
nta亲和柱(qiagen)、q柱(ge healthcare)和superdex 100柱(ge healthcare)纯化。
[0102]
以3h
‑
环磷酸鸟苷(cgmp)或3h
‑
环磷酸腺苷(camp)为底物，测定磷酸二酯酶(pdes)活性；检测缓冲液含有20mm tris
‑
hcl(ph 7.5)、10mm mgc l2或4mm mncl2、1mm dtt和10～30nm 3
h
‑
cgmp或3h
‑
camp(20,000
‑
30,000cpm/检测)；反应在室温下进行15min，然后加入0.2m硫酸锌终止；反应产物(3h
‑
环磷酸鸟苷cgmp或3h
‑
环磷酸腺苷camp)用0.2n的氢氧化钡沉淀，而未反应的(3h
‑
环磷酸鸟苷camp或3h
‑
环磷酸腺苷cgmp)保留在上清液中，perkinelmer 2910液体闪烁计数器测量，通过非线性回归计算ic
50
值。
[0103]
实验结果参见表1～2。
[0104][0105]
表1化合物对pde4d2抑制活性
[0106]
[0107][0108]
由表可见，本发明提供的化合物对pde4d2具有显著的抑制活性，大部分化合物ic
50
显著小于阳性对照组咯利普兰(rolipram)；其中，化合物16a、18d、19b抑制效果较差，ic
50
>1000。
[0109]
表2化合物18a对pdes亚型选择性
[0110]
pdesic
50
(nm)选择性指数pde4d2(86
‑
413)4.2
±
0.5
‑
pde4b2(152
‑
487)140
±
1833pde1c(147
‑
531)440
±
92104pde2a(580
‑
919)940
±
79223pde3a(679
‑
1087)>10000>2300pde5a1(535
‑
860)93
±
2022pde7a1(130
‑
482)298
±
970pde8a1(480
‑
828)710
±
65169pde9a2(181
‑
506)>10000>2300pde10a2(449
‑
770)260
±
661
[0111]
由表可见，化合物18a对pde3a和pde9a的抑制作用非常弱，ic
50
值超过10μm，选择性倍数超过2000；化合物18a对pde4d与对pde1c、pde2a和pde8a相比，显示出>100倍的选择性，与pde5a、pde7a和pde10a相比也显示出>22倍的选择性；化合物18a还显示出33倍于pde4b的中等选择性。上述结果表明，化合物18a是一种选择性pde4d抑制剂。
[0112]
实施例8化合物18a的药代动力学及类药性测定
[0113]
以化合物18a为代表，测定化合物18a的药代动力学及类药性，其他化合物效果与化合物18a类似。
[0114]
实验方法：
[0115]
(1)药代动力学实验：选取sd大鼠6只(3只静脉注射，3只口服)，10个时间点，给药后不同时间点采集血浆，用hplc
‑
ms/ms的方法测定血浆中化合物的浓度，分析药代动力学参数auc
(0
‑
t)
、auc
(0
‑
∞)
t
1/2
、t
max
、c
max
等。
[0116]
(2)体外肝微粒体稳定性测试
[0117]
配制0.5mm供试品或者阳性对照品(酮色林)；1.5μm供试品或者阳性对照品在0.75mg/ml肝微粒体混悬液中；配制6mm nadph在pbs中；按照时间点(0、5、15、30、45和60min)在96孔板中分装30μl含1.5μm化合物或者阳性对照品的0.75mg/ml肝微粒体混悬液；在0点加入150μl含内标的acn后加入15μl配制好的nadph(6mm)，反应板封装好；96孔反应板在37℃水浴中预热5min，加入15μl配制好的nadph(6mm)起始反应(化合物与阳性对照品在反应体系中最终浓度均为1μm)；在5、15、30、45和60min加入150μl含内标的acn终止反应；将反应板震荡5min，样品保存于
‑
80℃冰箱直至测样；测样前样品4000rpm离心15min，取上清80μl加入80μl超纯水混合均匀，lc
‑
ms/ms进样分析。
[0118]
(3)小鼠的急性毒性实验：取成年清洁级昆明小鼠30只，每组10只，共3组，随机分为空白对照组(溶媒)、正常组、1500mg/kg。药物悬浮于0.5％cm c
‑
na，按照1ml/kg口服给药。给药后立即观察动物的反应情况，持续观察12小时后，每天观察一次，连续观察14天，评价化合物的急性毒性。
[0119]
实验结果参见表3～4和图1。
[0120]
表3化合物18a在sd大鼠上的药代动力学特征(口服给药5mg/kg)
[0121][0122][0123]
由表可见，sd大鼠口服5mg/kg化合物18a后，t
1/2
、c
max
和auc的药代动力学参数分别为1.02h、1067ng/ml和2106h*ng/ml。
[0124]
表4化合物18a的类药性测定
[0125][0126]
由表可见，化合物18a对人细胞色素p450酶cyp1a2、2b6、2d6和3a4亚型的ic
50
值大于25μm，对cyp2c9的ic
50
值为1.7μm，表明化合物18a一般不会诱导药物
‑
药物相互作用；并且化合物18a对herg钾离子通道的ic
50
值大于30μm，心脏毒性风险较低；另外，评价了1.5g/kg
的剂量下对小鼠的急性毒性，结果参见图1，显示化合物18a在口服1.5g/kg剂量下无急毒性展现了良好的安全性。
[0127]
综上所述，化合物18a具有合理的选择性和理化性质，适合后续的药效学研究。其他化合物也具有类似的性质。
[0128]
实施例9化合物18a抗ipf测定
[0129]
实验方法：40只雄性sd大鼠(5～6周，200～220g，中山大学动物研究机构伦理委员会(sysu
‑
iauc
‑
2021
‑
000184)的批准，并于中山大学实验动物中心饲养)在24
±
1℃，60～70％的相对湿度，光照12h(8:00～20:00)培养条件下，将大鼠随机分为对照组、模型组、化合物18a(10mg/kg)组和阳性对照组(pfd，150mg/kg)。在实验之前，老鼠可以自由获取食物和水，然后，对照组用生理盐水治疗，其余的用blm进行单次气管内滴注，剂量为5mg/kg；治疗从第二天开始，用药物载体(对照组)、化合物18a(10.0mg/kg)或pfd(150mg/kg)治疗4周：将化合物18a和pfd溶解在0.5％羧甲基纤维素钠溶液中，并以0.4ml/100g的剂量口服给药。在整个实验间隔期间观察并记录重量、毛发和呼吸状态的变化。口服28天后，测量各组的呼吸水平。
[0130]
检测结束，给大鼠腹腔注射4％戊巴比妥钠，从腹主动脉抽取10ml血液，在2800转/min和4℃下离心10min后，收集血清并储存在
‑
80℃的冰箱中。左下肺骨折在安乐死后取出，在室温下将组织浸入4％缓冲聚甲醛中，并包埋在石蜡中，制作5μm厚的切片，安装在载玻片上，进行苏木精
‑
伊红和马森(masson)染色。
[0131]
各组的肺组织在添加1％蛋白酶抑制剂混合物和1mm苯基甲磺酰氟的裂解缓冲液中匀浆，裂解物在12,000克和4℃下离心10min，收集上清液用于后续用于免疫印迹分析。
[0132]
上述每个上清液样品的20μg用于蛋白质印迹：蛋白质样品通过sds
‑
page分离，然后转移到聚偏氟乙烯膜(美国密理博公司)，在室温下，用5％脱脂奶粉在tris
‑
缓冲盐水tween 20(tbs
‑
t)中封闭膜1.5h，连续在4℃下用如下初级抗体探测膜过夜：抗fn抗体(1:5000，abcam，ab2413，美国)、抗α
‑
sma抗体(1:300，abcam，ab7817，美国)和抗gapdh抗体(1μg/ml，abcam，ab9484，美国)；然后，在室温下用相应的山羊抗小鼠lgg二级抗体(boster，中国)将膜染色1小时，最后，使用ecl试剂(美国)对信号进行可视化，并用bio
‑
rad quality one软件对免疫印迹带进行密度定量。
[0133]
上述实验结果参见图2，由图2a可见，与对照组(con)相比，模型组(mod)大鼠的肺功能参数，包括呼气中流速(ef50)、呼气峰流速(pef)、呼吸频率(n)和增强停顿(金边)显著增加，表明blm诱导的ipf模型成功建立；在相同条件下，连续28天后，口服剂量为10mg/kg的化合物18a比口服剂量为150mg/kg的市售药物吡非尼酮(pfd)具有更好的抗ipf效应。并且，化合物18a组中与肺功能相关的参数如ef50、pef和金边指数恢复到与对照组接近的水平，这表明pde4抑制剂化合物18a在改善ipf大鼠的肺功能方面具有显著的效果。
[0134]
由图2b、2c可见，苏木精
‑
伊红染色显示模型组肺泡紊乱，肺泡壁破裂融合，有明显的炎性细胞浸润；化合物18a(10mg/kg)和pfd(150mg/kg)都可以有效地减轻肺的结构损伤，减少纤维化病变。此外，ipf的病理特征之一胶原沉积的表达大大增加，如masson染色切片所示，模型组气管周围有大面积的胶原沉积和细胞增生5c，而化合物18a和pfd都能几乎完全抑制胶原沉积至正常水平。
[0135]
由图2d可见，通过蛋白质印迹，ipf肺组织中的标记蛋白α
‑
平滑肌肌动蛋白(α
‑
sma)和纤连蛋白(fibronectin)的表达水平相对于模型组中的表达水平上调，化合物18a和pfd能显著降低α
‑
sma和纤连蛋白的水平。
[0136]
上述结果均表明，pde4抑制剂化合物18a改善了博莱霉素(blm)诱导的肺纤维化。
[0137]
实施例10化合物18a抑制体外上皮细胞间质转化(emt)
[0138]
上皮间质转化是ipf病的一个重要发病机制，可由纤维化前细胞因子tgf
‑
β(转化生长因子
‑
β)诱导，在此过程中，纤维连接蛋白(fibronectin)、n
‑
钙粘蛋白(n
‑
cadherin)和波形纤维蛋白(vimentin)等霍尔标记物的表达水平发生改变。本实施例通过免疫印迹法(western bolt)分析进一步评估化合物18a在tgf
‑
β诱导的a549细胞模型中的抗ipf潜能。
[0139]
实验方法：a549细胞(购自中国科学院上海细胞库)在含有10％胎牛血清的杜尔贝科改良鹰培养基(dmem)中培养，并置于含5％co2的37℃恒温培养箱中；a549细胞以5
×
105个/ml接种在细胞培养皿中，培养过夜；将细胞分为空白对照组、模型组和给药组，除空白组外，均加入10ng/ml tgf
‑
β，给药组加入最终浓度为20μm和10μm的化合物18a；孵育48h后，将细胞皿置于0℃下，弃去培养基，随后用4℃的pbs溶液洗涤三次；用ripa裂解液提取细胞总蛋白，用bca法定量蛋白：使用n
‑
钙粘蛋白(1:1000，cst，13116，美国)、波形纤维蛋白(1:1000，cst，5741，美国)和fn(1:5000，abcam，ab2413，美国)的抗体通过western印迹法测定各组样品中的蛋白质水平。所有结果均以平均扫描电镜给出。使用单向方差分析与邦费罗尼(bonferroni)多重比较法进行分析，p值小于0.05被认为具有统计学意义。结果参见图3。
[0140]
由图可见，在tgf
‑
β
‑
诱导48h后，a549细胞中纤维连接蛋白(fibronectin)、n
‑
钙粘蛋白和波形纤维蛋白的表达水平显著上调；化合物18a治疗能以剂量依赖性方式(10～20μmol/l)显著降低n
‑
钙粘蛋白、波形蛋白纤维和纤维连接蛋白的高表达，表明pde4抑制剂化合物18a能预防tgf
‑
β诱导的emt过程。
[0141]
实施例11化合物18a比格犬催吐试验
[0142]
实验方法：将比格犬(8只雄性比格犬购自广州医药研究总院有限公司，iac uc编号:sysuiauc
‑
2021
‑
000130)随机分成2组，实验前对比格犬进行12h禁食，将药物以1mg/ml悬浮于0.5％羧甲基纤维素钠溶液中，口服给药(化合物18a 10mg/kg，咯利普兰1mg/kg)，然后用15ml水冲洗灌洗管，确保所有化合物进入狗的胃；持续观察动物180分钟，观察其干呕、过度流涎和呕吐的行为。结果参见表5。
[0143]
表5化合物18a比格犬催吐试验结果
[0144]
药物剂量(mg/kg,p.o.)呕吐动物数/测试动物数化合物18a100/4咯利普兰14/4
[0145]
由表可见，本发明化合物18a相比较于咯利普兰，口服时不会引起呕吐，顺应性好。
[0146]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。