一种研究M2型MΦs介导NPC放疗抵抗作用的方法与流程

技术特征：
1.一种研究m2型mφs介导npc放疗抵抗作用的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)体外证明靶向抑制usp7(sirna和p5091)可促进m2向m1型mφs转化，从而增强npc放疗敏感性；2)co
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ip结合lc
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ms/ms筛选与usp7相互作用的蛋白birc6，内源co
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ip及gstpulldown验证两者的相互作用；3)构建usp7和birc6不同突变体以明确二者相互作用的结构域和结合位点，并靶向抑制usp7检测birc6蛋白半衰期和泛素化水平的改变；4)rna
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seq筛选usp7靶向birc6促进mφs表型转化过程中的分子通路，并对其进行验证提取dmso或p5091处理的thp
‑
1来源的mφsrna行rna
‑
seq检测，将数据进行kegg pathway和go等分析；分别用p5091和birc6的sirna对人原代mφs进行处理并提取蛋白，western blot检测jnk/erk/p38 mapk通路中，usp7靶向birc6促进mφs表型转化的确切分子途径；5)采用rescue技术，在抑制usp7功能的mφs中过表达myc
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birc6，检测mφs条件培养基中细胞因子的变化和该培养基对npc放疗敏感性的影响；6)采用rescue技术，在抑制usp7功能的mφs中加入jnk/erk/p38抑制剂，检测其条件培养基对npc放疗敏感性的影响。2.根据权利要求1所述的一种研究m2型mφs介导npc放疗抵抗作用的方法，其特征在于，所述步骤1包括如下步骤：
①
在人原代mφs和thp
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1来源的mφs中，用sirna干扰usp7表达，qrt
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pcr和western blot检测其敲低效果后，流式检测mφs亚型变化；
②
加入不同浓度的usp7抑制剂p5091对人原代mφs和thp
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1来源的mφs进行处理，检测细胞活性后，选择对细胞活性无影响的浓度对mφs进行处理，流式检测mφs亚型变化；
③
分别制备抑制usp7功能(p5091)或干扰usp7表达(sirna)的人原代mφs条件培养基：i)细胞因子抗体芯片分析其分泌细胞因子的变化；ii)将其与npc细胞系(cne2，hk1)孵育48h候后铺板，24h后以0、2、4、6、8gy x射线进行照射，克隆形成实验计算细胞种植率及存活分数，评价抑制mφs usp7功能(p5091)或干扰usp7表达(sirna)对npc放疗敏感性的影响。3.根据权利要求2所述的一种研究m2型mφs介导npc放疗抵抗作用的方法，其特征在于，所述步骤2包括如下步骤：
①
提取人原代mφs和thp
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1来源的mφs蛋白质，加入anti
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usp7一抗及protein a/g agarose于4℃摇床孵育过夜。洗涤3次后，加入上样缓冲液行sds
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page凝胶电泳,银染分析差异条带后，从胶上切下目标带，洗脱并收集胶中的蛋白质进行lc
‑
ms/ms分析；
②
提取人原代mφs和thp
‑
1来源的mφs总蛋白，加入anti
‑
usp7一抗及proteina/gagarose于4℃摇床孵育过夜。洗涤3次后，加入上样缓冲液，western blot检测usp7与birc6的相互作用；
③
构建带有gst标签的原核表达usp7质粒并进行细菌转化，加入iptg诱导后收集菌体，经超声破碎后收集上清，通过谷胱甘肽琼脂糖及还原型谷胱甘肽溶液(10mm)以得到gst
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usp7融合蛋白。构建可真核表达的myc
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birc6质粒，转染表达于hek293t细胞并提取蛋白。亲和固化gst
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usp7融合蛋白于谷胱甘肽亲和树脂上，myc
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birc6蛋白溶液过柱后洗脱结合物，western blot检测usp7与birc6在体外能否直接相互作用。4.根据权利要求3所述的一种研究m2型mφs介导npc放疗抵抗作用的方法，其特征在
于，所述步骤3包括如下步骤：
①
usp7蛋白由3309个碱基编码的1102个氨基酸构成，其主要结构域有7个：traf(62～205)、catalytic domain(208～560)、ubl1(562～665)、ubl2(684～771)、ubl3(793～881)、ubl4(892～974)、ubl5(985～1102)，分别构建其对应的缺失突变体sfb
‑
usp7
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δtraf/δcd/δubl1/δubl2/δubl3/δubl4/δubl5质粒，转染于hek293t细胞中表达，co
‑
ip实验检测各突变体是否与birc6蛋白存在相互作用；
②
birc6蛋白由14487个碱基编码的4829个氨基酸构成，分别构建myc标签birc6突变体1
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272、1
‑
677、1
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1360、1
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1648、1
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2400、1
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3191、1
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4099质粒，转染于hek293t细胞中表达，co
‑
ip实验检测各突变体是否与usp7蛋白存在相互作用；
③
在确定usp7与birc6结合结构域的基础上，根据usp7识别底物的保守基序，构建birc6与usp7结合位点突变的myc
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birc6
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mt质粒，转染于hek293t细胞中表达，co
‑
ip实验检测各突变体是否与usp7蛋白存在相互作用，进一步明确二者相互作用的位点。5.根据权利要求4所述的一种研究m2型mφs介导npc放疗抵抗作用的方法，其特征在于，所述步骤5包括如下步骤：
①
分别制备dmso vector组、p5091 vector组、dmso myc
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birc6组、p5091 myc
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birc6组的thp
‑
1来源的mφs条件培养基，进行细胞因子抗体芯片分析和统计学差异分析；
②
分别制备dmso vector组、p5091 vector组、dmso myc
‑
birc6组、p5091 myc
‑
birc6组的thp
‑
1来源的mφs条件培养基，对npc细胞系(cne2，hk1)培养48h后铺板，行cck
‑
8实验观察细胞增殖活性；克隆形成实验检测细胞集落形成能力；单染pi流式检测细胞周期分布；双染pi
‑
annexin v流式检测细胞凋亡；if和western blot检测γ
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h2ax焦点数及其蛋白含量；分别以0、2、4、6、8gy x射线照射后计算细胞存活分数来评价其放疗敏感性变化情况。

技术总结
本发明公开了一种研究M2型MΦs介导NPC放疗抵抗作用的方法，包括如下步骤：增强NPC放疗敏感性；内源co


技术研发人员：卢利森 袁冬军 彭炎秘
受保护的技术使用者：苏州鼎动生物科技有限公司
技术研发日：2021.08.02
技术公布日：2021/11/9