一种培养基、枯草芽孢杆菌和复合菌种的制作方法

1.本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种培养基、枯草芽孢杆菌和复合菌种。


背景技术：

2.中国是水果大国，除大部分用于鲜食之外，还有很大一部分用于榨汁和制作罐头等，进而产生大量的皮渣等副产物。据统计，我国年产果渣4000万吨以上，其中柑橘渣在500万吨以上。柑橘渣除富含可溶性多糖、维生素、粗脂肪、矿物元素等多种营养成分以及多酚和黄酮类功能性物质外，还含有大量的水份和纤维素等物质，同时蛋白质含量不高，适口性较差，将其直接饲喂动物，可影响其适口性及消化率，不利于动物的消化吸收，进而影响动物的生长性能，严重制约了其直接作为饲料的使用，导致柑橘渣废弃物处理成本日益增加。因此，对柑橘渣进行营养性和功能性改良，是实现其资源化利用的关键。
3.此外，随着畜禽养殖业的快速发展，饲料资源匮乏等问题日益突出。将农副产品下脚料进行资源化利用，不仅可减轻环境污染，还可一定程度上解决畜禽饲料资源短缺的问题，进而缓解人畜争粮的矛盾，还有利于农牧业的可持续发展。微生物固态发酵作为一种绿色环保的生物处理方式，可为果渣废弃物的资源化利用提供解决方案。本实验室前期筛选出的一株枯草芽孢杆菌，具有较高产纤维素酶活性，为进一步提高该菌发酵产纤维素酶活性，并探究其在柑橘渣发酵中的应用效果，以纤维素酶为指标，对该菌株进行发酵条件优化，并进一步与热带假丝酵母菌、黑曲霉和植物乳杆菌组成复合菌剂对柑橘渣进行复合发酵，以提高柑橘渣发酵饲料中粗蛋白质含量，降低粗纤维含量为目标，改善其适口性，为发酵柑橘渣应用于畜禽养殖行业中提供理论依据。
4.所以，本案首要解决的技术问题是：如何提高枯草芽孢杆菌的cmca和fpa酶活力值。


技术实现要素：

5.针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种培养基，该培养基可优化枯草芽孢杆菌的cmca和fpa酶活力值。
6.本发明的另一目的在于提供一种通过上述培养基培养后的在cmca和fpa酶活力值表现优越的枯草芽孢杆菌，最后本发明还公开了一种复合菌种。
7.一种用于优化枯草芽孢杆菌的cmca和fpa酶活性的培养基，所述培养基包括如下组分：蔗糖：9
‑
11g/l；蛋白胨；4.5
‑
5.5g/l；酵母浸膏：4.5
‑
5.5g/l；mgso4.7h2o：2.5
‑
3.5g/l；feso4.7h2o:1.5
‑
2g/l；亚硒酸钠：0.1
‑
0.5g/l；
硫酸锰：0.1
‑
0.3g/l。
8.在上述的用于优化枯草芽孢杆菌的cmca和fpa酶活性的培养基中，所述培养基包括如下组分：蔗糖：10g/l蛋白胨；5g/l酵母浸膏：5g/lmgso4.7h2o：2.5g/l；feso4.7h2o:2g/l;亚硒酸钠：0.3g/l；硫酸锰：0.2g/l。
9.在上述的用于优化枯草芽孢杆菌的cmca和fpa酶活性的培养基中，所述培养基为液体培养基，所述培养基中剩余为去离子水。
10.同时，本发明还公开了一种cmca和fpa酶活性优化的枯草芽孢杆菌，其采用如上任一所述培养基培养得到。
11.在上述的cmca和fpa酶活性优化的枯草芽孢杆菌中，向培养基中接种枯草芽孢杆菌,通气封口膜封口，于37℃条件下160 r/min摇床培养48 h。
12.最后，本发明还公开了一种复合菌种，所述复合菌种包括黑曲霉、热带假丝酵母、植物乳杆菌和如上所述的枯草芽孢杆菌，所述黑曲霉、热带假丝酵母、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌的菌数量比例为1:1：1：1。
13.与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1）本发明采用蔗糖作为糖源，其来源价格低廉；复合采用蛋白胨 酵母浸膏以及水合硫酸镁和水合硫酸亚铁，同时提供微量的硒盐和锰盐，采用该培养基培养的枯草芽孢杆菌其cmca和fpa酶活性最大；通过该培养基进行枯草芽孢杆菌的培养和筛选，可促进产cmca和fpa酶活性大的枯草芽孢杆菌增殖，本培养基具有辅助筛选的功能。
14.（2）本发明的枯草芽孢杆菌采用一般的培养条件可得，并且其和黑曲霉、热带假丝酵母、植物乳杆菌组合，对于植物下脚料比如柑橘渣的处理上，能提供更高的粗蛋白和更低的粗纤维产出。
附图说明
15.图1是碳源对枯草芽孢杆菌酶活的影响；图2 氮源对枯草芽孢杆菌酶活的影响；图3 无机盐种类对枯草芽孢杆菌酶活的影响。
具体实施方式
16.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
17.实施例1原料来源:枯草芽孢杆菌 ：本实验室保存
黑曲霉：广东省农业科学院蚕业与农产品加工所果蔬深加工研究室赠送热带假丝酵母：广东省农业科学院蚕业与农产品加工所果蔬深加工研究室赠送植物乳杆菌：本实验室保存第一部分 碳源的优化分别以葡萄糖、乳糖、麸皮、可溶性淀粉、玉米粉、糖蜜替换lb液体基础培养基中的碳源，含量均为0.5%。lb液体基础培养基采用市场上购买的lb基础培养基，主要由1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物和1%的nacl组成。蒸馏水定容到1 l，121℃高温高压灭菌20 min。
18.其他培养条件为装液量100 ml,接种量为5.0%,活菌数量为108，通气封口膜封口，于37℃条件下160 r/min摇床培养48 h。将培养好的发酵产酶培养基用4层纱布过滤，滤液在4℃，8000 r/min条件下离心15 min，上清液即为粗酶液，用于测定羧甲基纤维素钠酶活（cmca）和滤纸酶活（fpa），并以cmca和fpa酶活性为指标确定最佳碳源。
19.cmca酶活性的测定：将0.5 ml的粗酶液加入25 ml的比色管内，然后加入1.5 ml浓度为1%的cmc柠檬酸缓冲液，50℃恒温水浴30 min，取出后立即采用dns法测定还原糖的含量，即加入1.5 ml的dns染液混匀，100℃沸水浴中煮沸10 min，然后立即用流水冷却至室温后用超纯水定容至25 ml。以不加酶液的相同底物为空白对照组，采用分光光度计在540 nm波长条件下，测定od值。酶活力单位规定：即在一定条件下，1 ml粗酶液每分钟产生1 μg还原糖的酶量定义为一个酶活力单位u。
20.fpa酶活性测定：将制备好的0.5 ml粗酶液25 ml的比色管内，然后加入50 mg用碱处理过的滤纸和1.5 mlｐｈ为4.8的磷酸缓冲液，50℃恒温水浴60 min，取出后立即采用dns法测定还原糖的含量，具体操作步骤同上。
21.如图1可知，菌株发酵产酶活性在不同碳源条件下受到不同的影响，蔗糖为碳源时，枯草芽孢杆菌的cmca和fpa酶活力值最大，分别达到180、160左右，且蔗糖价格便宜易得，因此选择蔗糖为最优碳源。
22.第二部分 氮源的优化以上述最佳碳源作为碳源，分别以蛋白胨、酵母浸膏、蛋白胨 酵母浸膏（1:1）、尿素、硫酸铵、黄豆饼粉替换基础培养基中的氮源，含量均为1.0%。其余培养参数与碳源选择实验相同进行发酵培养。粗酶液获取及相关酶活测定同碳源选择实验，并以cmca和fpa酶活性为指标确定最佳氮源。
23.如图2可知，菌株发酵产酶活性在不同氮源条件下受到不同的影响，当以蛋白胨 酵母浸膏为供试氮源时，枯草芽孢杆菌的cmca和fpa酶活力值最大，分别达到220和180左右，因此选择蛋白胨 酵母浸膏为最优氮源。
24.第三部分 无机盐的优化以上述最佳碳源和氮源作为碳源和氮源，分别以feso4.7h2o、mgso4.7h2o、mnso4.h2o、feso4.7h2o mgso4.7h2o(3:2)、mnso4.h2o 亚硒酸钠（4.5:0.5）和feso4.7h2o mgso4.7h2o mnso4.h2o 亚硒酸钠（2.5：2:0.2:0.3）替换基础培养基中的无机盐，含量为0.5%，其余培养条件同上。粗酶液获取及相关酶活测定同碳源选择实验，并以cmca和fpa酶活性为指标确定最佳无机盐。
25.如图3可知，菌株发酵产酶活性在不同无机盐种类条件下受到不同的影响，当以feso4.7h2o mgso4.7h2o mnso4.h2o 亚硒酸钠（2.5：2:0.2:0.3）为供试无机盐时，枯草芽孢
杆菌的cmca和fpa酶活力值最大，分别达到200和190左右，因此选择feso4.7h2o mgso4.7h2o mnso4.h2o 亚硒酸钠（2.5：2:0.2:0.3）为最优无机盐。
26.第四部分 培养基组成优化正交试验采用第一部分至第三部分采用单因素试验筛选出的最佳碳源、氮源和无机盐，设计正交试验因素水平见表1，利用l9(33)正交表进行试验，以发酵液中cmca和fpa酶活性为指标，确定最优培养基组成。
27.表1 枯草芽孢杆菌培养基组成正交试验的因素水平培养基组成正交试验结果如表2所示，对于cmca酶活性而言，由极差分析结果可知，r
蔗糖
>r
蛋白胨 酵母浸膏
>r
feso4.7h2o mgso4.7h2o mnso4.h2o 亚硒酸钠
。可见对枯草芽孢杆菌发酵产生cmca酶活影响最大的是蔗糖，其次是蛋白胨 酵母浸膏。比较各因素的均值可得：a2>a3>a1,b2>b3>b1,c2>c3>c1,因此枯草芽孢杆菌产cmca酶最优培养基组合条件为蔗糖1.0%、蛋白胨 酵母浸膏1.0%、feso4.7h2o mgso4.7h2o feso4.7h2o mnso4.h2o 亚硒酸钠（2.5：2:0.2:0.3）为0.5%。
28.对于fpa酶活性而言，由极差分析结果可知，r
蔗糖
>r
蛋白胨 酵母浸膏
>r
feso4.7h2o、mgso4.7h2o mnso4.h2o 亚硒酸钠
。可见对枯草芽孢杆菌发酵产生fpa酶活影响最大的同样是蔗糖，其次是蛋白胨 酵母浸膏。比较各因素的均值可得：a2>a3>a1,b2>b3>b1,c3>c2>c1, 因此枯草芽孢杆菌产fpa酶最优培养基组合条件为蔗糖1.0%、蛋白胨 酵母浸膏1.0%、feso4.7h2o mgso4.7h2o mnso4.h2o 亚硒酸钠（2.5：2:0.2:0.3）为0.7%。cmca与fpa培养基中最佳无机盐浓度不同，但综合考虑当无机盐浓度为0.5%时，两种酶的活力均较高，因此，枯草芽孢杆菌产纤维素酶的最优培养基组合条件为蔗糖1.0%、蛋白胨 酵母浸膏1.0%、feso4.7h2o mgso4.7h2o mnso4.h2o 亚硒酸钠为0.5%。
29.表2 正交设计及极差分析
第五部分 培养基优化后的枯草芽孢杆菌应用效果将第四部分的优化培养基条件后培养的枯草芽孢杆菌与实验室前期筛选培养的黑曲霉、热带假丝酵母和植物乳杆菌按照接种比例1:1:1:1进行组合发酵柑橘渣（发酵组1），同时以市场上售卖的lb培养基培养的枯草芽孢杆菌替代上述复合菌中经培养基优化后生产的枯草芽孢杆菌作为发酵组2。
30.设在温度30
°
c，含水率60%，尿素添加量1.5%，接种量为15%，柑橘渣与麸皮的比例为7：3，发酵时间4 d后测定发酵前后常规营养物质和功能性物质的含量。
31.如表3所示，发酵后柑橘渣的粗蛋白含量增加，粗纤维含量降低，其中发酵组1的粗蛋白质含量增加了60.43%，粗纤维含量降低了19.69%；发酵2组的粗蛋白含量增加了
35.78%，粗纤维含量降低了11.88%。由此可见，经优化培养枯燥芽孢杆菌的培养基条件后，柑橘渣发酵工艺条件最佳。
32.表3 优化培养基后发酵柑橘渣应用效果上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。