一种用于检测环境低剂量电离辐射的方法与流程

1.本发明涉及辐射检测技术领域，具体涉及一种用于检测环境低剂量电离辐射的方法。


背景技术：

2.我国广东阳江和恩平为高天然本底辐射地区，医院放射科医生、核电厂工作的工人和因患病需要经常接受x线、ct等放射性的医学检查的患者以及长期工作在具有低剂量辐射环境的官兵等也可能一直处于低剂量的辐射环境中，这些环境是否存在辐射，以及累积的剂量是否具有生物效应，一直都没有明确的科学研究进行证实。
3.因此，生物体受到环境低剂量暴露后如何快速、准确鉴别与检测出照射剂量具有实际应用价值。目前国内尚无针对环境低剂量辐射的特异性生物学检测方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种用于检测环境低剂量电离辐射的方法。本发明所述方法能够对环境中低剂量电离辐射进行检测，可以用来鉴别环境是否存在电离辐射并提供辐射参考剂量。
5.本发明提供了一种用于检测环境低剂量电离辐射的方法，包括以下步骤：
6.1)取待检测细胞和阴性对照组的细胞，分别进行细胞核的提取，得到细胞核；所述阴性对照组为未受到电离辐射的细胞；
7.2)从步骤1)得到的细胞核中提取组蛋白，得到组蛋白；
8.3)检测组蛋白中γh2ax和h2ax的摩尔含量；
9.4)当待检测细胞γh2ax和h2ax的摩尔含量比值高于相同处理条件下的阴性对照组时，判断细胞受到了低剂量电离辐射；细胞受到不同剂量的辐射后，以照射剂量为横坐标，γh2ax和h2ax的摩尔含量比值为纵坐标，绘制拟合曲线，根据拟合曲线，结合待检测细胞γh2ax和h2ax的摩尔含量比值，得出待检测细胞受到的电离辐射的具体剂量。
10.优选的是，所述待检测细胞与阴性对照组的细胞类型相同。
11.优选的是，所述待检测细胞的类型包括淋巴细胞或人支气管上皮细胞。
12.优选的是，所述淋巴细胞包括人淋巴母细胞。
13.优选的是，当所述待检测细胞提取自血液样品时，待检测细胞的提取方法包括以下步骤：
14.取人外周血，提取淋巴细胞，加入磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。
15.优选的是，所述人外周血的体积为3ml。
16.优选的是，所述磷酸酶抑制剂的使用浓度为0.001倍浓度的磷酸酶抑制剂。
17.优选的是，所述蛋白酶抑制剂的使用浓度为1倍浓度的蛋白酶抑制剂。
18.优选的是，所述淋巴细胞的提取的温度为0～4℃。
19.优选的是，步骤4)所述不同照射剂量的辐射为：0gy、0.01gy、0.02gy、0.05gy、
0.1gy和0.2gy剂量的辐射。
20.本发明提供了一种用于检测环境低剂量电离辐射的方法。本发明通过检测γh2ax蛋白表达水平变化对环境电离辐射的评价。目前针对γh2ax蛋白表达水平的免疫荧光细胞化学和免疫荧光流式术检测的下限分别为0.05gy和0.5gy，缺少检测低于0.05gy的电离辐射的检测方法。本发明方法能够实现更精准的检测，评价环境中是否存在低剂量的辐射，并通过该生物学效应根据剂量
‑
效应模型提供辐射剂量参考值。试验结果表明，本发明通过对组蛋白进行特定操作的提取，利用质谱准确检测照射后淋巴细胞(人淋巴母细胞ahh
‑
1)产生的γh2ax/h2ax来评估生物体所处环境是否存在低剂量辐射(可低达0.01gy)，同时可以评估所受的剂量范围；本发明血样检测是从外周血中提取淋巴细胞进行检测，其它类型的细胞相对于电离辐射不敏感，在低剂量电离辐射照射后损伤不明显，不能实现环境低剂量电离辐射的检测。本发明的检测方法灵敏度和特异性好，能够用较少的细胞量就可以检测出γh2ax/h2ax的指标，同时可以满足放射性事故发生时，快速高通量检测的要求，即样品形成后可以连续性进行检测，不需要太多的劳动力。另外，在用外周血样品进行检测时，只需要3ml的血液就可以准确测量出γh2ax/h2ax的指标，具有很高的实用性，获取样品的方法也比较简单。
附图说明
21.图1为本发明提供的钴60γ射线照射暴露ahh
‑
1细胞后γh2ax/h2ax的时效变化结果；
22.图2为本发明提供的钴60γ射线照射暴露ahh
‑
1细胞后γh2ax/h2ax的量效关系图；
23.图3为本发明提供的钴60γ射线照射暴露16hbe细胞后γh2ax/h2ax的时效变化结果；
24.图4为本发明提供的钴60γ射线照射暴露16hbe细胞后γh2ax/h2ax的量效关系图；
25.图5为本发明提供的钴60γ射线照射暴露ahh
‑
1细胞与16hbe细胞后γh2ax/h2ax的时效变化比较结果；
26.图6为本发明提供的钴60γ射线照射暴露ahh
‑
1细胞与16hbe细胞后γh2ax/h2ax的量效关系比较图；
27.图7为本发明提供的健康人群外周血淋巴细胞的γh2ax/h2ax本底水平分析结果；
28.图8为本发明提供的女性和男性的γh2ax/h2ax(％)的平均值；
29.图9为本发明提供的钴60γ射线照射健康人外周血淋巴细胞的γh2ax/h2ax量效结果，*差异具有统计学意义(p<0.05)；
30.图10为本发明提供的人外周血淋巴细胞的水平的拟合曲线图。
具体实施方式
31.本发明提供了一种用于检测环境低剂量电离辐射的方法，包括以下步骤：
32.1)取待检测细胞和阴性对照组的细胞，分别进行细胞核的提取，得到细胞核；所述阴性对照组为未受到电离辐射的细胞；
33.2)从步骤1)得到的细胞核中提取组蛋白，得到组蛋白；
34.3)检测组蛋白中γh2ax和h2ax的摩尔含量；
35.4)当待检测细胞γh2ax和h2ax的摩尔含量比值高于相同处理条件下的阴性对照组时，判断细胞受到了低剂量电离辐射；细胞受到不同剂量的辐射后，以照射剂量为横坐标，γh2ax和h2ax的摩尔含量比值为纵坐标，绘制拟合曲线，根据拟合曲线，结合待检测细胞γh2ax和h2ax的摩尔含量比值，得出待检测细胞受到的电离辐射的具体剂量。
36.取待检测细胞和阴性对照组的细胞，分别进行细胞核的提取，得到细胞核；所述阴性对照组为未受到电离辐射的细胞。本发明设置阴性对照组便于待检测细胞辐射情况的检测。在本发明中，所述待检测细胞与阴性对照组的细胞类型优选相同。在本发明中，所述待检测细胞的类型优选包括淋巴细胞或人支气管上皮细胞。在本发明中，所述淋巴细胞优选包括人淋巴母细胞。人淋巴母细胞对电离辐射敏感，在低剂量电离辐射照射后的24h后，γh2ax蛋白水平仍有很大水平的变化，具有统计学意义；而人支气管上皮细胞在低剂量电离辐射照射后的短时间内(0.5h)是有统计学差异，但由于对电离辐射不敏感，低剂量照射后短时间内γh2ax蛋白的表达就恢复了，不能高效用于低剂量电离辐射的检测。本发明所述待检测细胞的来源优选包括待检测血液样品，本发明优选提取血液样品中的淋巴细胞进行检测，外周血中的淋巴细胞对辐射敏感，照射后损伤大，短时间内不容易恢复，且其灵敏度高，淋巴细胞优选作为检测细胞，血液样品中的淋巴细胞在低剂量照射后进行检测，是有统计学差异的，检测结果比较好；而抽取人的外周血，之后加入红细胞裂解液提取白细胞进行检测，发现无信号。在本发明中，当所述待检测细胞提取自血液样品时，待检测细胞的提取方法优选包括以下步骤：取人外周血，提取淋巴细胞，加入磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。在本发明中，所述人外周血的体积优选为3ml，即每次检测，血液样品仅需提取3ml的量。在本发明中，所述磷酸酶抑制剂的使用浓度优选为0.001倍浓度的磷酸酶抑制剂。本发明所述磷酸酶抑制剂的来源优选为默克roche phosstop easypack。在本发明中，所述蛋白酶抑制剂的使用浓度优选为1倍浓度的蛋白酶抑制剂。本发明所述蛋白酶抑制剂的来源优选为bimake蛋白酶抑制剂cocktail。在本发明中，所述淋巴细胞的提取的温度优选为0～4℃，在常温下提取得到的淋巴细胞用本发明方法进行检测，显示无信号，即检测不到γh2ax。具体的，当所述待检测细胞提取自待测血液样品时，待测血液样品的预处理方法优选包括：用edta抗凝血管抽取3ml人的外周血后，根据人的外周血淋巴细胞分离液说明书(温度改为0～4℃，离心条件改为400g，30min)提取淋巴细胞，提取完后，加入磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，进行细胞核的提取。在本发明中，所述人外周血细胞分离液优选购自天津瀚洋。在本发明中，磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂用于加入淋巴细胞里，实现淋巴细胞的裂解。具体的，本发明所述磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂优选加入细胞核提取试剂盒的lysis buffer里面进行使用。本发明所述细胞核的提取方法使用细胞核提取试剂盒(北京索莱宝)进行，本发明优选在lysis buffer里加入磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。
37.在本发明中，提取淋巴细胞及其它过程优选都在0～4℃进行，血样中提取淋巴细胞不在0～4℃进行，就检测不到γh2ax的信号，其余过程不在0～4℃进行就会容易导致γh2ax去磷酸化，使其表达值降低。
38.得到细胞核后，本发明从细胞核中提取组蛋白，得到组蛋白。具体的，本发明优选将细胞核与预冷的硫酸水溶液混合，逐滴加入预冷的三氯乙酸，得到沉淀组蛋白，用预冷的
丙酮对沉淀组蛋白进行洗涤，得到组蛋白。在本发明中，所述硫酸水溶液中，硫酸的摩尔浓度优选为0.2mol/l。在本发明中，所述预冷为常规方法，预冷至温度为即可。在本发明中，逐滴加入预冷的三氯乙酸时，本发明优选在冰上操作，保证操作环境的温度为0～4℃。
39.得到组蛋白后，本发明检测组蛋白中γh2ax和h2ax的摩尔含量。具体的，本发明优选将组蛋白与碳酸氢铵水溶液混合，离心，得到上清液。在本发明中，所述碳酸氢铵水溶液中碳酸氢铵的摩尔浓度优选为50mmol/l。在本发明中，所述离心的条件优选为4℃下，16,000g离心10min。得到上清液后，本发明优选通过bca蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。得到上清液后，本发明优选将上清液与胰蛋白酶混合进行消化，加入醋酸水溶液终止反应，利用c18 stagetips进行脱盐和浓缩，用水复溶后，质谱检测γh2ax和h2ax的摩尔含量。在本发明中，所述上清液与胰蛋白酶混合的质量比优选为(10～100)：1，更优选(10～30)：1，更优选(10～20)：1，最优选为15：1。本发明所述胰蛋白酶优选为测序级胰蛋白酶。在本发明中，所述消化的时间为6～10h。在本发明中，所述醋酸水溶液中醋酸的体积百分含量为20％。在本发明中，检测γh2ax和h2ax的摩尔含量的方法参考申请号为202010133755.4的专利。
40.当待检测细胞γh2ax和h2ax的摩尔含量比值高于相同处理条件下的阴性对照组时，判断细胞受到了低剂量电离辐射；细胞受到不同剂量的辐射后，以照射剂量为横坐标，γh2ax和h2ax的摩尔含量比值为纵坐标，绘制拟合曲线，根据拟合曲线，结合待检测细胞γh2ax和h2ax的摩尔含量比值，得出待检测细胞受到的电离辐射的具体剂量。在本发明中，所述不同照射剂量的辐射为：0gy、0.01gy、0.02gy、0.05gy、0.1gy和0.2gy剂量的辐射。本发明所述方法能够评估生物体所处环境是否存在低剂量辐射(可低达0.01gy)，同时可以评估所受的剂量范围，灵敏度和特异性好，能够用较少的细胞量就可以检测出γh2ax/h2ax的指标，同时可以满足放射性事故发生时，快速高通量检测的要求，即样品形成后可以连续性进行检测，不需要大量劳动力。另外，在用外周血样品进行检测时，只需要3ml的血液就可以准确测量出γh2ax/h2ax的指标。
41.下面结合具体实施例对本发明所述的一种用于检测环境低剂量电离辐射的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
42.实施例1
43.1.细胞培养：本发明采用的细胞系人淋巴母细胞ahh
‑
1和人支气管上皮细胞16hbe，细胞分别培养于含10％胎牛血清的1640培养基和dmem培养基中，置37℃、5％co2培养箱中传代培养。
44.2.采用钴60γ射线照射：传代培养后的ahh
‑
1细胞及16hbe细胞给予钴60γ射线照射。其中，所述钴60γ射线照射的照射条件是20～25℃，照射距离为3米，剂量率2.81cgy/min。收取对照组(不照射组)细胞(标记为0gy)，依次用磷酸盐缓冲液洗涤并收取辐照后0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时和48小时的细胞(标记为0.5h、1h、2h、4h、8h、24h和48h)。照射剂量分别为0.01gy、0.02gy、0.05gy、0.1gy、0.2gy。
45.3.ahh1及16hbe细胞核蛋白的提取
46.提取细胞核蛋白，具体步骤如下：
47.1)收取1mlahh
‑
1细胞混悬液于50ml离心管中，4℃，3000rpm离心3min，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液，混匀后收集于1.5ml ep管中，4℃，1000g离心5min；
48.将16hbe细胞用1
×
pbs缓冲液漂洗细胞2次，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液刮下细胞收
集于1.5ml ep管中，4℃，1000g离心5min。
49.2)根据细胞核提取试剂盒(北京索莱宝)分别提取ahh
‑
1及16hbe细胞核(未加入磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂)；
50.3)然后分别加入预冷的400μl 0.2mol/lh2so4提取组蛋白，在冰上通过逐滴加入预冷的100％三氯乙酸以沉淀组蛋白。
51.4)用预冷的丙酮将组蛋白洗涤两次，并室温干燥。
52.5)将组蛋白溶解于100μl 50mmol/l碳酸氢铵溶液中，在4℃条件下16,000g离心10min后，将上清液转移到新的1.5ml离心管中，
53.6)通过bca蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。
54.7)用测序级胰蛋白酶消化过夜(胰蛋白酶和组蛋白样品的质量比为1:(10～30))，加入20％醋酸终止反应，利用c18 stagetips对样品脱盐并浓缩，用水复溶后进行质谱分析，定量检测ahh
‑
1及16hbe细胞核蛋白。
55.4.ahh
‑
1及16hbe细胞核蛋白定量检测(部分具体方案参见申请号为202010133755.4的专利)
56.采用高效液相色谱串联质谱技术，对γh2ax磷酸化位点即139位丝氨酸的特定肽段进行定量检测，并同时对h2ax肽段进行检测，实现γh2ax/h2ax和动态定量监测。
57.1)选择c
‑
末端胰蛋白酶酶解产物135atqasqey142用于测定组蛋白h2ax，分别合成四种含有s139位点的肽段标准品，包括未磷酸化形式，s139磷酸化形式和相应的同位素标记肽。
58.2)色谱和质谱条件：色谱分离条件为：流动相a：0.1％甲酸水溶液，流动相b：强极性溶剂；梯度洗脱程序：0～100％b；流速为0.1～1.2ml/min，进样量范围为0.1～20μl，柱温范围为20℃～60℃。在一些实施方案中，所述强极性溶剂为醇类溶剂(甲醇、乙醇或异丙醇)或乙腈。具体色谱分离条件为：流动相a：0.1％甲酸水溶液，流动相b：乙腈；梯度洗脱程序：0
→
8min，1
→
30％b；8
→
8.5min，30
→
80％b；8.5
‑
9.5min，80
→
1％b；9.5
→
11min，1％b；流速为0.25ml/min；进样体积为10μl；柱温为40℃。
59.采用正离子多反应监测模式(mrm)进行质量扫描。
60.质谱条件为：电喷雾(esi)离子源；离子源温度范围为300℃～550℃，雾化气(gs1)和辅助加热干燥气(gs2)流量范围为40～60psi，喷雾电压范围为2.0～5.5kv。具体的，质谱条件为：电喷雾离子源正离子检测模式和多反应监测的质谱扫描模式；离子源温度：500℃；雾化气(gs1)：40psi，辅助加热干燥气(gs2)：60psi，喷雾电压：5.5kv。
61.3)优化质谱采集参数，如表1、表2，实现对靶标肽段的灵敏和特异检测。
62.表1 h2ax肽段标准品的色谱条件参数
[0063][0064]
注：a为0.1％甲酸水溶液，b为乙腈
[0065]
表2 h2ax肽段标准品的质谱条件参数
[0066][0067]
对于组蛋白h2ax，分别配制6个浓度梯度的atqasqey肽段和atqas(ph)qey肽段的混合标准溶液，并加入500ng/ml的atqasqey(is)肽段和atqas(ph)qey(is)肽段的混合内标溶液；以分析物与内标浓度的比值为横坐标，峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线。采用标准加入法，计算对应肽段的准确度与精密度，其中，精密度用变异系数表示。检测肽段的线性范围、回归方程、准确度及精密度如表3所示。
[0068]
表3检测肽段的线性范围、回归方程、准确度及精密度
[0069][0070]
分别配制多个(例如6个)不同浓度梯度的h2ax特征性多肽片段(atqasqey)的p标准溶液，并加入500ng/ml的同位素标记的h2ax特征性多肽片段(atqasqey)的内标作为标准溶液，以h2ax与内标浓度的比值作为横坐标，峰面积比值作为纵坐标，绘制各自标准曲线。
以标准溶液浓度为x轴，标准和内标峰面积的比值为y轴，进行线性回归分析，经“1/x”权重得回归方程；将样品中待测成分与其内标峰面积比代入标准曲线方程，计算样品中h2ax特征性多肽片段(atqasqey)的质量浓度。并等摩尔换算得到h2ax的浓度。γh2ax摩尔含量计算方法同此。
[0071]
质谱检测结束后，保存实验数据进行分析。
[0072]
图1和表4为钴60γ射线照射暴露ahh
‑
1细胞后γh2ax/h2ax的时效变化结果；图2为钴60γ射线照射暴露ahh
‑
1细胞后γh2ax/h2ax的量效关系图。
[0073]
表4钴60γ射线照射暴露ahh
‑
1细胞后γh2ax/h2ax的时效变化结果
[0074][0075][0076]
图3和表5为钴60γ射线照射暴露16hbe细胞后γh2ax/h2ax的时效变化结果；图4为钴60γ射线照射暴露16hbe细胞后γh2ax/h2ax的量效关系图。
[0077]
表5钴60γ射线照射暴露16hbe细胞后γh2ax/h2ax的时效变化结果
[0078][0079]
图5为钴60γ射线照射暴露ahh
‑
1细胞与16hbe细胞后γh2ax/h2ax的时效变化比较结果，*差异具有统计学意义(p<0.0001)；图6为钴60γ射线照射暴露ahh
‑
1细胞与16hbe细胞后γh2ax/h2ax的量效关系比较图。
[0080]
根据时效变化结果可知：
[0081]
低剂量照射人淋巴母细胞ahh
‑
1后，γh2ax/h2ax均在辐射后迅速增加，0.01gy的低剂量照射在0.5h达到峰值，并在2h恢复到正常(未照射水平)；表明0.01gy照射后，ahh
‑
1细胞的dna双链断裂，并能够在2h之内完成修复。0.02gy～0.05gy的低剂量照射在0.5h达到峰值，在8h仍然存在双链断裂损伤，到24h恢复到正常(未照射水平)；表明0.02gy～0.05gy照射后，ahh
‑
1细胞的dna发生双链断裂损伤较0.01gy严重，细胞在24h完成自我修复。0.1～0.2gy在1h达到高峰，之后呈下降趋势，并且这种损伤可以持续到照射后48h仍然存在。
[0082]
低剂量照射16hbe后，γh2ax/h2ax均在辐射后0.5h达到峰值，之后呈下降趋势，2h恢复到未辐射水平。说明人支气管上皮细胞16hbe在低剂量照射后，dna双链发生断裂，并且在小于0.2gy的照射剂量之内，均能够在2h之内完成自我修复。
[0083]
根据量效关系结果可知：
[0084]
0.01～0.2gy低剂量照射人淋巴母细胞ahh
‑
1后的0.5h和1h，γh2ax/h2ax的表达值随照射剂量的增加而增加，有明显的剂量效应；0.02～0.2gy低剂量照射人淋巴母细胞ahh
‑
1后的2h、4h和8h，γh2ax/h2ax的表达值随照射剂量的增加而增加，有明显的剂量依赖关系；0.1～0.2gy低剂量照射人淋巴母细胞ahh
‑
1后的24h后仍具有统计学意义，说明dna发生双链断裂损伤较严重。
[0085]
0.01～0.2gy低剂量照射人淋巴母细胞ahh
‑
1后的0.5h和1h，γh2ax/h2ax的表达值随照射剂量的增加而增加，有明显的剂量效应；但0.01～0.2gy低剂量照射人淋巴母细胞ahh
‑
1后的2h、4h、8h及24h，γh2ax/h2ax的表达值无明显变化，无剂量依赖关系。
[0086]
本发明方法可以通过利用质谱准确检测照射后人淋巴母细胞ahh
‑
1产生的γh2ax/h2ax来评估生物体所处环境是否存在低剂量辐射(可低达0.01gy)，同时可以评估所受的剂量范围。
[0087]
此外，本发明前期实验抽取人的外周血，之后加入红细胞裂解液提取白细胞进行检测，发现无信号，说明人外周血淋巴细胞更适合作为本发明方法检测的最佳细胞，且并不是任意细胞都可以实现低剂量辐射的定量检测。
[0088]
实施例2
[0089]
1、抽取16名女性和25名男性的外周血(3ml)提取淋巴细胞用于阴性对照组的本底值的检测。
[0090]
本发明基于人外周血淋巴细胞分离液(天津瀚洋)提取淋巴细胞的步骤进行改动；此说明书要求在常温下提取淋巴细胞，但是本发明在常温下提取到的淋巴细胞用本发明方法进行检测，显示无信号，即检测不到γh2ax。但在4℃提取到淋巴细胞进行检测，可看到较弱的信号。因此，本发明提取淋巴细胞时选择在4℃进行。同时由于人外周血淋巴细胞分离液说明书里的转速设置是根据在常温条件下设计的，不适用于在低温下提取的方案，本发明分别选择以下离心条件进行离心：500g，30min离心；500g，20min；300g，40min；300g，20min；400g，20min；400g，30min；发现在400g，30min条件下离心的话，效果最好，淋巴细胞数量多，掺杂的红细胞数量少，因此，本发明在此离心条件下进行操作。
[0091]
具体的，淋巴细胞具体提取方法如下：
[0092]
用edta抗凝血管采集3ml新鲜血液，与3ml样本稀释液(产品编号：2010c1119)混匀，取一支15mlpbmc高效离心管，加入4ml分离液，用吸管小心吸取稀释后的血液样本加于
分离液之液面上，4℃，400g，30min。离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层。第二层为环状乳白色淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。用吸管将环状乳白色淋巴细胞层加入到另一个装有20ml清洗液(产品编号：2010x1118)的离心管，混匀，4℃，400g，离心7min，弃上清。再加15ml清洗液(产品编号：2010x1118)混匀，4℃，400g，离心7min，弃去上清，后加0.5ml 1
×
pbs转移到1.5ep管中，4℃，3000rpm,5min，弃上清。
[0093]
在4℃条件下提取淋巴细胞进行检测其信号较弱，本发明通过在细胞核提取试剂盒(索莱宝)中的lysis buffer中加入磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂进行细胞核的提取，克服了信号弱的缺陷。本发明选取以下使用浓度的组合：1
×
的磷酸酶抑制剂和1
×
的蛋白酶抑制剂、0.1
×
的磷酸酶抑制剂和1
×
的蛋白酶抑制剂、0.01
×
的磷酸酶抑制剂和1
×
的蛋白酶抑制剂、0.001
×
磷酸酶抑制剂和1
×
的蛋白酶抑制剂、0.0001
×
磷酸酶抑制剂和1
×
的蛋白酶抑制剂，结果表明，加入1
×
的磷酸酶抑制剂和1
×
的蛋白酶抑制剂、0.1
×
的磷酸酶抑制剂和1
×
的蛋白酶抑制剂及0.01
×
的磷酸酶抑制剂和1
×
的蛋白酶抑制剂后，γh2ax的信号增强的同时h2ax的信号也增强，甚至超过了γh2ax，说明浓度过大起到反向作用。加入0.0001
×
磷酸酶抑制剂和1
×
的蛋白酶抑制剂后γh2ax的信号较弱，h2ax的信号正常。只有加入0.001
×
磷酸酶抑制剂和1
×
的蛋白酶抑制剂后γh2ax的信号增强的同时h2ax的信号也在正常范围，可用于检测。因此，本技术选用0.001
×
的磷酸酶抑制剂和1
×
的蛋白酶抑制剂加入细胞核提取试剂盒(索莱宝)lysis buffer中的方案对细胞核进行提取。
[0094]
提取得到细胞核后，参考实施例1进行后续检测。
[0095]
健康人群外周血淋巴细胞的γh2ax/h2ax本底水平分析结果见表6和图7，图7中，前16个为女性的结果，后25个为男性的结果。
[0096]
表6健康人群外周血淋巴细胞的γh2ax/h2ax本底水平分析结果
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结果显示：16名女性的γh2ax/h2ax(％)的平均值为2.93
±
0.41，25名男性的γh2ax/h2ax(％)的平均值为2.67
±
0.39，性别之间无统计学差异(见图8)。41名健康人外周血淋巴细胞γh2ax/h2ax(％)的平均值为2.77
±
0.41。
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2、抽取6名男性的外周血(3ml)给予钴60γ射线照射后提取淋巴细胞检测γh2ax/h2ax的量效结果，结果如表7和图9：
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表7钴60γ射线照射健康人外周血淋巴细胞的γh2ax/h2ax量效结果
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结果显示：0.01、0.02、0.05、0.1及0.2gy低剂量照射人外周血0.5h后，外周血淋巴细胞γh2ax/h2ax在辐射后迅速增加，差异具有统计学意义，并且具有良好的剂量依赖关系，证明用该方法在人血中检测仍然是可行的，且适用于低剂量的检测。
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实施例3
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在人外周血淋巴细胞水平上进行拟合曲线的构建。即以0.01gy、0.02gy、0.05gy、0.1gy及0.2gy低剂量照射人外周血0.5h后的γh2ax/h2ax(％)的值为纵坐标，辐射剂量(0.01gy、0.02gy、0.05gy、0.1gy和0.2gy)为横坐标进行构建，结果如图10所示。结果显示:拟合方程为y＝
‑
104.99x2 37.689x 3,0409,r2＝0.9632，说明拟合曲线的估计值与对应的实际数据之间的拟合程度高，可以用来评估所受到的辐射剂量。
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。