一种干式免疫荧光层析法甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒的制作方法

1.本发明涉及医学检测和免疫分析技术领域，具体涉及一种干式免疫荧光层析法甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒。


背景技术：

2.流感病毒分甲、乙、丙三型，甲型流感病毒威胁最大，乙型次之。依据血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)蛋白抗原性的不同，甲型流感病毒目前可分为15个h亚型(h1
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h15)和9个n亚型(n1
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n9)。由于编码ha或na的核酸序列容易发生突变，致使ha或na的抗原表位发生改变，这种抗原性的转变使人群原有的特异性免疫力失效，故甲型流感病毒常引起较大规模甚至世界性的流感流行。
3.流感病毒作为一类致病率极高的上呼吸道感染病毒，在全世界的发病人群可达80～90％，其中易感人群多为老年人和婴幼儿。流感病人临床症状表现为急起高热、全身酸痛、乏力，并常常引起上呼吸道感染，有些导致支气管炎、支气管肺炎等并发症。该病潜伏期短，传染性强，传播迅速，由于流感病毒致病力强，易发生变异，若人群对变异株缺乏免疫力，易引起暴发流行，给人类的健康与生活造成严重危害，同时也对社会公共防疫系统构成了极大的威胁，因此流感病毒已经成为流行病学的主要研究对象之一。近年来随着一些抗流感病毒药的上市，对流感病毒进行准确检测也已经成为药物使用的重要基础。
4.目前对于流感病毒的确认一般采用鸡胚或mdck细胞分离培养和血凝抑制法，但是其操作繁琐且费时费力，难以满足快速诊断的需要。随着快速诊断技术的发展和应用，目前市场上流感病毒的检测产品类型基本可以分为三大类：核酸诊断类(rt
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pcr法)、酶联免疫吸附法(elisa法)和胶体金免疫层析法。其中rt
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pcr法是首选的诊断方法，准确度最高，但缺点是检测成本高，检测时间长，对实验室不同反应条件空间要求相互独立，且需专业人员通过设备进行操作，具有一定的局限性，不适合大规模检测应用；elisa法兼顾速度和准确性，是医院检验科和疾控系统实验室的经典方法；胶体金法速度最快，简便易行，适合于普遍筛查，但胶体金检测的灵敏度较低，往往会造成漏检。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了一种干式免疫荧光层析法甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒，能够简便、快速、准确地检测甲型/乙型流感病毒抗原，实现快速分型诊断。本发明采用免疫荧光双抗体夹心法检测样本中的流感病毒抗原，与现有方法相比，操作更加简单便捷、节省人力物力且灵敏度高，无需专业人员操作，荧光免疫定量分析仪可直接出检测结果，适合各级医疗单位使用，易推广，具有广泛的适用性。
6.本发明的技术方案是：
7.一种干式免疫荧光层析法甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒，包括检测卡、检测芯片和检测缓冲液；所述检测卡包括试剂条，所述试剂条包括吸水纸、硝酸纤维素膜、结合
垫和样品垫；所述硝酸纤维素膜上依次包被有质控c线、检测t1线和检测t2线；所述结合垫上固相有荧光物质标记的0.1～0.5mg/ml(包括0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml)的鼠抗人甲型/乙型流感病毒单克隆抗体形成的荧光抗体；所述检测缓冲液为10mm pbs 0.5～2wt％bsa 0.01～0.05wt％酪蛋白 0.1～0.5wt％s9 0.5wt％pc300。
8.进一步的，所述荧光物质标记工艺包括以下步骤：
9.(1)采用双蒸水制备25～50mm mes活化缓冲液并调节ph至5.8～6.2，优选调节至6.0；取制备的mes活化缓冲液调节ph至6.3～6.8制备偶联缓冲液，优选调节至6.5；mes活化缓冲液浓度包括25mm、30mm、35mm、40mm、45mm以及50mm；
10.(2)将荧光微球和mes活化缓冲液采用1:10体积比进行混匀，超声确保荧光微球呈单分散状态，制得微球悬浮液；荧光微球优选为0.22μm荧光微球；
11.(3)称取适量edc和一定体积的mes活化缓冲液，充分混匀，制备浓度为10～20mg/ml的edc溶液；此处浓度优选10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml；
12.(4)称取适量sulfo
‑
nhs和一定体积的mes活化缓冲液，充分混匀，制备浓度为10～20mg/ml的sulfo
‑
nhs溶液；浓度优选10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml；
13.(5)向步骤(2)中的微球悬浮液中先后快速加入100～500ul的edc溶液和100～500ul的sulfo
‑
nhs溶液，超声并混合孵育20～60min，活化微球，得到活化后微球溶液；所加入具体体积包括100ul、200ul、300ul、400ul、500ul；混合孵育时间可为30min、40min或50min；
14.(6)将步骤(5)活化后微球溶液离心，去除上清，加入偶联缓冲液洗涤微球并充分混匀；将混匀后的溶液再次离心，去除上清，然后利用偶联缓冲液将微球重悬，超声，确保微球呈单分散状态，得到微球悬液；
15.(7)分别移取一定体积的微球悬液加入到偶联缓冲液制备的1～4mg/ml(优选2mg/ml)的鼠抗人甲型流感病毒单克隆抗体溶液和偶联缓冲液制备的1～4mg/ml(优选2mg/ml)的鼠抗人乙型流感病毒单克隆抗体溶液中，超声并混合孵育2～6h，进行抗体偶联；
16.制得的微球悬液中鼠抗人甲型流感病毒单克隆抗体溶液的浓度为0.1～0.5mg/ml，优选的，浓度为0.4mg/ml；制得的微球悬液中鼠抗人乙型流感病毒单克隆抗体溶液的浓度为0.1～0.5mg/ml，优选的，浓度为0.2mg/ml；
17.(8)向步骤(7)的溶液中加入终浓度为100mm的甘氨酸终止反应，混合孵育20～60min，优选混合孵育时间为30min；然后将混合后的溶液离心，去除上清，加入含0.5～5wt％酪蛋白的25mm tris封闭缓冲液重悬，充分混匀；重悬后的溶液再次离心，去除上清，加入25mm tris 0.5～5wt％酪蛋白封闭缓冲液重悬，超声，混合孵育1.5～2.5h进行封闭反应；此处，封闭缓冲液混合孵育时间优选2h；
18.(9)制备微球保存液，包括25mm tris 0.5wt％bsa 0.2wt％酪蛋白 1wt％海藻糖 0.01wt％nan3；将步骤(8)的溶液离心后去除上清，微球保存液重悬，超声确保微球呈单分散状态，置于4℃保存。
19.进一步的，所述超声均采用探入式超声，混合孵育方式为采用转盘式混合器进行混合孵育；所述离心转速为12000～15000rpm，离心时间12～20min，离心温度4℃。离心转速可选为12000rpm、13000rpm、14000rpm或15000rpm中的任一种，离心时间包括12min、15min、18min及20min。
20.进一步的，所述质控c线包被有浓度为0.1～3mg/ml的羊抗鼠抗体，羊抗鼠抗体采用样品稀释液进行稀释，待羊抗鼠抗体完全干燥后在质控c线上喷涂样品稀释液以增加质控稳定性；所述检测t1线包被有浓度为1.5～3mg/ml的鼠抗人甲型流感病毒单克隆抗体，包被抗体采用样品稀释液进行稀释以增加包被抗体的稳定性；所述检测t2线包被有浓度为1.5～3mg/ml的鼠抗人乙型流感病毒单克隆抗体，包被抗体采用样品稀释液进行稀释以增加包被抗体的稳定性；所述样品稀释液为含1～5wt％蔗糖的pbs缓冲液。
21.进一步的，所述吸水纸和样品垫分别设置于硝酸纤维素膜的两端，所述结合垫位于样品垫和硝酸纤维素膜之间，并且上述各组分之间交叉重叠1～2mm。
22.进一步的，所述荧光抗体经固相液稀释后固定于结合垫的中间位置，所述固相液的组成为25mm tris 1～10wt％蔗糖 1～10wt％海藻糖。
23.进一步的，所述荧光抗体经固相液稀释至5～20倍，然后按照2～10ul/cm的喷量喷于结合垫的中央位置，烘箱烘2h干燥，即可将荧光抗体固定于结合垫上。
24.进一步的，所述样品垫需经处理液处理，所述处理液为10mm pbs缓冲液，处理操作为将样品垫置于10mm pbs缓冲液中，浸泡30～35min，烘箱烘4h干燥，存放备用。
25.进一步的，所述结合垫需经处理液处理，所述处理液的缓冲系统为10mm pbs缓冲液，包括1～3wt％表面活性剂s9、0.1～2wt％酪蛋白、0.1～2wt％pvp以及1～5wt％蔗糖；处理操作为将结合垫置于上述处理液中浸泡30～35min，烘箱烘4h干燥，存放备用。
26.本发明的有益效果：
27.(1)本发明提供了一种能同时检测甲型/乙型流感病毒抗原的快速检测试剂盒，通过一次性加样检测完成流感病毒的临床分型，适合大规模的流行病学调查及应付突发事件，同时，甲型/乙型流感病毒抗原联合检测的试剂盒能够有效节约成本，且方便快捷，15分钟判读结果，无需专业人士，做到了真正的poct检测，普遍适用于门诊和急诊检测使用。
28.(2)本发明采用了新式荧光标记工艺，采用荧光微球作为示踪物，荧光微球表面修饰有合适密度的羧基，用于与蛋白或抗体的共价偶联，提高了荧光探针标记稳定性；通过改进活化缓冲液的使用量使荧光微球保持较高的活化效率，改进偶联缓冲液ph值使微球和抗体高效率偶联，从而实现超高灵敏度，灵敏度是传统poct类的10～100倍，明显降低检出限，能够在病人发病3～5天检出阳性，缩短检测窗口期。
29.(3)本发明提供了一种快速、准确的干式免疫荧光层析法甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒，通过对十几种抗体原料进行筛选，得到的应用于本试剂盒的原料可过国家标准品，且甲型/乙型流感病毒菌株之间无交叉反应。
30.(4)借助荧光免疫定量分析仪读数出结果，解决了胶体金免疫层析法对于部分弱阳样本不好判读的问题；通过对临床数据的采集，上传云端服务器，可以在后台方便获取到仪器的运行状态、测试的需求，通过对大数据的处理，辅助临床医生对测试结果进行解读。
附图说明
31.图1为本发明所提供的检测试剂盒的结构示意图；
32.图2为图1的俯视图；
33.图3为图1中试剂条的俯视图；
34.以上各图中，1、下盖；2、上盖；3、样品垫；4、结合垫；5、硝酸纤维素膜；6、吸水纸；7、
t2检测线；8、t1检测线；9、质控c线；10、加样孔；11、检测窗口。
具体实施方式
35.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
36.为了进一步理解本发明，将结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
37.实施例1
38.如图1至3所示，本发明涉及一种干式免疫荧光层析法甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒，包括检测卡、检测芯片和检测缓冲液；检测卡包括下盖1、上盖2和试剂条，下盖1和上盖2相互卡扣连接，下盖1和上盖2之间形成容纳腔，试剂条位于容纳腔内，上盖2设置有加样孔10和检测窗口11。
39.试剂条包括吸水纸6、硝酸纤维素膜5、结合垫4和样品垫3，吸水纸6位于硝酸纤维素膜5的一端，样品垫3位于硝酸纤维素膜5的另一端，结合垫4位于样品垫3和硝酸纤维素膜5之间，各组分之间交叉重叠1mm。硝酸纤维素膜5上依次包被有质控c线9、t1检测线8和t2检测线7，结合垫4上固相有荧光抗体，加样孔10与样品垫3相对应，检测窗口11的位置对应t2检测线7、t1检测线8和质控c线9的位置。
40.规范采集待测人员的鼻咽拭子样本，将采集后拭子放入检测缓冲液中，转动挤压拭子至少10次，然后挤压并丢弃拭子，塞紧滴头，得到待测样本。将待测样本滴加2
‑
3滴(约100ul)到试剂条加样孔10后，如果待测样本中有甲型或乙型流感病毒，在层析作用下迁移至结合垫4处与荧光抗体形成抗原抗体复合物，继续在层析作用下沿膜向上移动，迁移至t2检测线7处时，被鼠抗人乙型流感病毒单克隆抗体所捕获形成复合物，迁移至t1检测线8处时，被鼠抗人甲型流感病毒单克隆抗体所捕获形成复合物，复合物的荧光抗体信号与甲型或乙型流感病毒抗原浓度成正比，经荧光分析仪分析后可计算出样本中是否有甲型/乙型流感病毒抗原。
41.实施例2
42.一种干式免疫荧光层析法甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒，包括检测卡、检测芯片和检测缓冲液；检测缓冲液为10mm pbs 2wt％bsa 0.02wt％酪蛋白 0.3wt％s9 0.5wt％pc300；检测卡包括试剂条，试剂条包括吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫；
43.硝酸纤维素膜上依次包被有质控c线、检测t1线和检测t2线；
44.质控c线包被有浓度为0.1mg/ml的羊抗鼠抗体，羊抗鼠抗体采用3wt％蔗糖的pbs缓冲液进行稀释，待羊抗鼠抗体完全干燥后在质控c线上喷涂3wt％蔗糖的pbs缓冲液以增加质控稳定性；所述检测t1线包被有浓度为1.5mg/ml的鼠抗人甲型流感病毒单克隆抗体，包被抗体采用2wt％蔗糖的pbs缓冲液进行稀释以增加包被抗体的稳定性；所述检测t2线包被有浓度为1.5mg/ml的鼠抗人乙型流感病毒单克隆抗体，包被抗体采用4wt％蔗糖的pbs缓冲液进行稀释以增加包被抗体的稳定性，烘箱烘30min干燥备用。
45.结合垫上固相有荧光物质标记的鼠抗人甲型/乙型流感病毒单克隆抗体。
46.荧光物质标记工艺包括以下步骤：
47.(1)将称取的0.533g mes置于容量瓶内，加入双蒸水溶解并定容至100ml，制备25mm mes，用naoh溶液调节ph至6.0制备mes活化缓冲液；移取10mlmes活化缓冲液，用naoh溶液调节ph至6.5，制得偶联缓冲液；
48.(2)将0.22μm荧光微球和mes活化缓冲液采用1:10体积比进行混匀，使用探入式超声确保微球呈单分散状态，制备1ml微球悬浮液；
49.(3)向干净的离心管中加入5mg edc和500ul的mes活化缓冲液，颠倒混匀，制备10mg/ml edc溶液(注意：活化试剂即配即用)；
50.(4)向干净的离心管中加入5mg sulfo
‑
nhs和500ul的mes活化缓冲液，颠倒混匀，制备10mg/ml sulfo
‑
nhs溶液：(注意：活化试剂即配即用)；
51.(5)微球活化的步骤为，向步骤(2)微球悬浮液中先后快速加入100～500ul的edc溶液和100～500ul的sulfo
‑
nhs溶液，探入式超声并用转盘式混合器混合孵育30min；
52.上述步骤中，通过改变edc溶液和sulfo
‑
nhs溶液的加入量调整活化比例，其中edc溶液和sulfo
‑
nhs溶液均为10mg/ml，edc：nhs(v/v)为(1～5)：(1～5)，其中标记0.5ml微球悬液时，甲型流感病毒单克隆抗体标记过程中加入100ul edc溶液和500ul sulfo
‑
nhs溶液(活化比例1:5)，乙型流感病毒单克隆抗体标记过程中加入100ul edc溶液和300ul sulfo
‑
nhs溶液(活化比例1:3)，用甲/乙型流感病毒抗原最低检出限国家参考品s1～s5进行检测，检测结果如表1和2所示，此时微球活化过程中溶液均匀且不出现聚集现象，活化效率最高，灵敏度高，在2～8℃放置7天微球不出现聚集。
53.表1甲型流感病毒抗原最低检出限国家参考品检测结果
[0054][0055]
表2乙型流感病毒抗原最低检出限国家参考品检测结果
[0056][0057]
(6)将步骤(5)活化后的微球悬液离心，去除上清，加入偶联缓冲液重悬微球并充分混匀；将混匀后的溶液离心，去除上清，用偶联缓冲液将微球重悬，使用探入式超声确保
微球呈单分散状态，得到微球悬液；
[0058]
(7)将步骤(6)微球悬液取500μl加入到100μl的偶联缓冲液制备的2mg/ml的鼠抗人甲型流感病毒单克隆抗体溶液，取500μl加入到50μl的偶联缓冲液制备的2mg/ml的鼠抗人乙型流感病毒单克隆抗体溶液中，探入式超声并用转盘式混合器混合孵育2h，进行抗体偶联；
[0059]
该步骤中，对微球悬液中抗体终浓度的选择包括0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml，经过测试选择浓度为0.4mg/ml的鼠抗人甲型流感病毒单克隆抗体和0.2mg/ml的鼠抗人乙型流感病毒单克隆抗体时，抗体偶联过程中微球没有出现聚集现象且标记效率最高。
[0060]
(8)向步骤(7)溶液中加入甘氨酸终止反应，甘氨酸终浓度为100mm，转盘式混合器混合30min；然后将混合后的溶液离心，去除上清，加入含1wt％酪蛋白的25mm tris封闭缓冲液，重悬微球；重悬后的溶液离心，去除上清，加入25mm tris 1wt％酪蛋白封闭缓冲液重悬，探入式超声确保微球呈单分散状态，用转盘式混合器混合2h进行封闭反应；
[0061]
(9)制备包括25mm tris 0.5wt％bsa 0.2wt％酪蛋白 1wt％海藻糖 0.01wt％nan3的微球保存液；将步骤(8)溶液离心，去除上清，加入制备好的微球保存液，使用探入式超声确保微球呈单分散状态，置于4℃保存。
[0062]
上述各步骤中的离心转速设置为12000rpm，离心时间15min，离心温度4℃。
[0063]
荧光抗体固相工艺包括以下步骤：
[0064]
将标记好的荧光微球抗体用固相液进行稀释，其中甲型流感病毒荧光抗体稀释10倍，乙型流感病毒荧光抗体稀释5倍，固相液25mm tris 3wt％蔗糖 3wt％海藻糖，按照5ul/cm的喷量喷于结合垫的中央位置，喷完后烘箱烘2h干燥。
[0065]
结合垫需经处理液处理，处理液所选的缓冲系统为10mm pbs，包括表面活性剂s9、酪蛋白、pvp和蔗糖；表面活性剂s9的浓度为1wt％；酪蛋白的浓度为0.2wt％；pvp的浓度为0.2wt％；蔗糖的浓度为3wt％；结合垫处理方法为将玻璃纤维放于预处理液中，浸泡30min，烘箱烘4h干燥，存放备用。
[0066]
样品垫需经处理液处理，处理方法为将玻璃纤维放于10mm pbs预处理液中，浸泡30min，烘箱烘4h干燥，存放备用。
[0067]
将硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫、吸水纸依次粘贴于pvc板上，组装成试纸条，然后和卡扣板块壳组装成试剂检测卡。
[0068]
试剂盒的使用方法，具体操作步骤为：
[0069]
(1)规范采集待测人员的鼻咽拭子样本，将采集后拭子放入检测缓冲液中，转动挤压拭子至少10次，然后挤压并丢弃拭子，塞紧滴头，得到待测样本；
[0070]
(2)插入检测芯片，仪器读取产品配套的芯片信息；
[0071]
(3)将待测样本滴加2
‑
3滴(约100ul)到试剂条加样孔10，室温平置15min后，插入到荧光免疫定量分析仪，仪器可自动判定阳性(结果≥1)、阴性结果(＜1)及检测卡是否有效。
[0072]
实施例3
[0073]
一种干式免疫荧光层析法甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒，包括检测卡、检测芯片和检测缓冲液；所述检测卡包括试剂条，所述试剂条包括吸水纸、硝酸纤维素膜、结合
垫和样品垫；所述硝酸纤维素膜上依次包被有质控c线、检测t1线和检测t2线；所述结合垫上固相有荧光物质标记的0.1～0.5mg/ml的鼠抗人甲型/乙型流感病毒单克隆抗体形成的荧光抗体；所述检测缓冲液为10mm pbs 0.5wt％bsa 0.05wt％酪蛋白 0.5wt％s9 0.5wt％pc300。
[0074]
进一步的，所述荧光物质标记工艺包括以下步骤：
[0075]
(1)将称取的1.066g mes置于容量瓶内，加入双蒸水溶解并定容至100ml，制备50mm mes，并调节ph至5.8；取制备的mes活化缓冲液调节ph至6.8制备偶联缓冲液；
[0076]
(2)将荧光微球和mes活化缓冲液采用1:10体积比进行混匀，超声确保荧光微球呈单分散状态，制得1ml微球悬浮液；荧光微球优选为0.22μm荧光微球；
[0077]
(3)称取适量edc和一定体积的mes活化缓冲液制备15mg/ml的edc溶液；
[0078]
(4)称取适量sulfo
‑
nhs和一定体积的mes活化缓冲液制备15mg/ml的sulfo
‑
nhs溶液；
[0079]
(5)向步骤(2)中的微球悬浮液中先后快速加入100ul的edc溶液和500ul的sulfo
‑
nhs溶液，超声并混合孵育60min，活化微球，得到活化后微球溶液；
[0080]
(6)将步骤(5)活化后微球溶液离心，去除上清，加入偶联缓冲液洗涤微球并充分混匀；将混匀后的溶液再次离心，去除上清，然后利用偶联缓冲液将微球重悬，超声，确保微球呈单分散状态，得到微球悬液；
[0081]
(7)分别移取500μl的微球悬液加入到偶联缓冲液制备的2mg/ml的鼠抗人甲型流感病毒单克隆抗体溶液和偶联缓冲液制备的2mg/ml的鼠抗人乙型流感病毒单克隆抗体溶液中，超声并混合孵育3h，进行抗体偶联；
[0082]
制得的微球悬液中鼠抗人甲型流感病毒单克隆抗体溶液的浓度为0.1～0.5mg/ml，优选的，浓度为0.4mg/ml；制得的微球悬液中鼠抗人乙型流感病毒单克隆抗体溶液的浓度为0.1～0.5mg/ml，优选的，浓度为0.2mg/ml；
[0083]
(8)向步骤(7)的溶液中加入终浓度为100mm的甘氨酸终止反应，混合孵育40min；然后将混合后的溶液离心，去除上清，加入含5wt％酪蛋白的25mm tris封闭缓冲液重悬，离心，去除上清，加入封闭缓冲液重悬，超声，混合孵育2h进行封闭反应；
[0084]
(9)制备微球保存液，包括25mm tris 0.5wt％bsa 0.2wt％酪蛋白 1wt％海藻糖 0.01wt％nan3；将步骤(8)的溶液离心后去除上清，微球保存液重悬，超声确保微球呈单分散状态，置于4℃保存。
[0085]
所述离心转速为15000rpm，离心时间12min，离心温度4℃。
[0086]
质控c线包被有浓度为1mg/ml的羊抗鼠抗体，羊抗鼠抗体采用2wt％蔗糖的pbs缓冲液进行稀释，待羊抗鼠抗体完全干燥后在质控c线上喷涂4wt％蔗糖的pbs缓冲液以增加质控稳定性；所述检测t1线包被有浓度为2mg/ml的鼠抗人甲型流感病毒单克隆抗体，包被抗体采用5wt％蔗糖的pbs缓冲液进行稀释以增加包被抗体的稳定性；所述检测t2线包被有浓度为2.5mg/ml的鼠抗人乙型流感病毒单克隆抗体，包被抗体采用2wt％蔗糖的pbs缓冲液进行稀释以增加包被抗体的稳定性，烘箱烘30min干燥备用。
[0087]
所述荧光抗体经固相液稀释后固定于结合垫的中间位置，所述固相液的组成为25mm tris 5wt％蔗糖 5wt％海藻糖。
[0088]
所述荧光抗体经固相液稀释至10倍，然后按照2ul/cm的喷量喷于结合垫的中央位
置，烘箱烘2h干燥，即可将荧光抗体固定于结合垫上。
[0089]
所述样品垫需经处理液处理，所述处理液为10mm pbs缓冲液，处理操作为将样品垫置于10mm pbs缓冲液中，浸泡30min，烘箱烘4h干燥，存放备用。
[0090]
所述结合垫需经处理液处理，所述处理液的缓冲系统为10mm pbs缓冲液，包括3wt％表面活性剂s9、2wt％酪蛋白、0.1wt％pvp以及5wt％蔗糖；处理操作为将结合垫置于上述处理液中浸泡30min，烘箱烘4h干燥，存放备用。
[0091]
将硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫、吸水纸依次粘贴于pvc板上，组装成试纸条，然后和卡扣板块壳组装成试剂检测卡。
[0092]
实施例4
[0093]
1、将组装好的试剂盒进行稳定性考察
[0094]
将本发明试剂盒置于37℃进行破坏性试验，定期考察试剂盒稳定性检测标准如下：
[0095]
(1)阴性质控品检测结果：
[0096]
用6份阴性质控品检测，检测结果如表3所示，甲型流感病毒和乙型流感病毒均呈阴性。
[0097]
表3试剂盒37℃加速破坏后阴性质控品检测结果
[0098][0099][0100]
(2)阳性质控品检测结果：
[0101]
用6份阳性质控品检测，检测结果如表4所示，其中质控品1～3均为乙型流感病毒阳性，甲型流感病毒阴性；质控品4～6均为甲型流感病毒阳性，乙型流感病毒阴性。
[0102]
表4试剂盒37℃加速破坏后阳性质控品检测结果
[0103][0104]
经试验本试剂盒在37℃可稳定至少60天，根据稳定性实验原理，阿伦尼乌斯公式：d(in k)/dt＝ea/rt2 ea，常温保存24个月，相当于37度破坏60天，可满足医院诊所及卫生检疫部门的临床需求，也可用于大专院校和科研机构的疾病诊断研究。
[0105]
实施例5
[0106]
1、取本发明所制备的甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒，采用行业通用的方式进行性能评价，结果如下：
[0107]
(1)阳性参考品检测结果
[0108]
用甲/乙型流感病毒抗原阳性国家参考品检测，严格按说明书操作，其中p1～p4乙型流感病毒均为阳性，甲型流感病毒均为阴性；p5～p10甲型流感病毒均为阳性，乙型流感病毒均为阴性；阳性符合率( / )为10/10。检测结果如表5所示。
[0109]
表5阳性参考品符合率检测结果
[0110][0111]
(2)阴性参考品检测结果
[0112]
用甲/乙型流感病毒抗原阴性国家参考品检测，严格按说明书操作，n1～n6甲型流感病毒和乙型流感病毒均为阴性，阴性符合率(－/－)为6/6。检测结果如表6所示。
[0113]
表6阴性参考品符合率检测结果
[0114]
阴性参考品n1n2n3n4n5n6flua0.3
‑
0.4
‑
0.2
‑
0.3
‑
0.3
‑
0.1
‑
flub0.3
‑
0.2
‑
0.3
‑
0.1
‑
0.4
‑
0.2
‑
[0115]
(3)甲/乙型流感病毒抗原最低检出限国家参考品检测结果
[0116]
用甲/乙型流感病毒抗原最低检出限国家参考品s1～s5检测，严格按说明书操作，检测结果如表7所示。
[0117]
s1：滴度不高于1.22
×
104tcid
50
/l(1:80稀释)，检测结果为甲型流感病毒阳性、乙型流感病毒阴性；
[0118]
s2：滴度不高于3.25
×
104tcid
50
/l(1:40稀释)，检测结果为甲型流感病毒阳性、乙型流感病毒阴性；
[0119]
s3：滴度不高于5.25
×
105tcid
50
/l(1:40稀释)，检测结果为乙型流感病毒阳性、甲型流感病毒阴性；
[0120]
s4：滴度不高于1.00
×
104tcid
50
/l(1:10稀释)，检测结果为乙型流感病毒阳性、甲型流感病毒阴性；
[0121]
s5：滴度不高于1.25
×
103tcid
50
/l(1:80稀释)，检测结果为甲型流感病毒阳性、乙型流感病毒阴性。
[0122]
表7甲/乙型流感病毒抗原最低检出限国家参考品检测结果
[0123]
最低检出限s1s2s3s4s5flua1.6 1.5 0.3
‑
0.2
‑
1.9 flub0.3
‑
0.3
‑
1.4 1.6 0.3
‑
[0124]
(4)甲/乙型流感病毒抗原重复性国家参考品检测结果
[0125]
取同一批号试剂盒，用甲/乙型流感病毒抗原重复性国家参考品(cv1和cv2)各平行检测10次，严格按说明书操作，分别计算10次检测结果的均值和标准差(sd)，按式(1)计算变异系数(cv)，
[0126][0127]
式中：
[0128]
cv——变异系数；
[0129]
sd——标准差；
[0130]
——检测结果的均值。
[0131]
检测结果：cv1均为甲型流感病毒阳性、乙型流感病毒阴性，其中甲型流感病毒阳性检测结果的cv为7.5％；cv2均为乙型流感病毒阳性、甲型流感病毒阴性，其中乙型流感病毒阳性检测结果的cv为10.4％，阳性结果cv均小于15.0％，符合要求，阴性结果cv不做要求，检测结果如表8所示。
[0132]
表8甲/乙型流感病毒抗原重复性国家参考品检测结果
[0133]
参考品12345678910cv1(flua)6.3 5.9 5.4 6.3 6.5 5.5 5.6 5.9 6.2 5.2
cv1(flub)0.3
‑
0.2
‑
0.1
‑
0.3
‑
0.3
‑
0.2
‑
0.1
‑
0.2
‑
0.2
‑
0.4
‑
cv2(flub)4.7 5.1 4.4 4.6 4.8 4.2 4.4 4.9 5.3 5.9 cv2(flua)0.1
‑
0.2
‑
0.4
‑
0.3
‑
0.2
‑
0.3
‑
0.3
‑
0.2
‑
0.4
‑
0.2
‑
[0134]
试验例
[0135]
1、样本测试
[0136]
本试剂盒与上市试剂盒进行对比测试，从临床中收集到30份确诊为呼吸道病人的鼻咽拭子，健康查体鼻咽拭子100份，用本试剂盒与上市试剂盒同时检测对比，30例呼吸道病人鼻咽拭子检测结果如下表9，特异性、检出率如下表10，总符合率如下表11。其中甲型流感病毒和乙型流感病毒的两种试剂盒总符合率均为98.5％，总符合率良好，可用于临床诊断使用。
[0137]
表9本试剂盒和上市试剂盒30例呼吸道病人鼻咽拭子检测结果对比
[0138][0139]
表10不同鼻咽拭子两种试剂盒的特异性、检出率对比
[0140][0141]
表11130例样本两种试剂盒的总符合率
[0142][0143][0144]
2、原料厂家筛选
[0145]
用甲/乙型流感病毒抗原阳性国家参考品对不同厂家抗体进行筛选，此处仅例举具有代表性的厂家结果，其中a厂家与c厂家出现甲型流感病毒抗原阳性国家参考品漏检，d厂家甲、乙型流感病毒菌株之间出现交叉反应，只有b厂家检测结果中p1～p4乙型流感病毒均为阳性，甲型流感病毒均为阴性，p5～p10甲型流感病毒均为阳性，乙型流感病毒均为阴性，检出水平符合要求，且甲型/乙型流感病毒菌株之间无交叉反应。检测结果如表12所示。
[0146]
表12甲/乙型流感病毒抗原阳性国家参考品检测结果
[0147][0148]
本发明提供了一种快速、特异、干式免疫荧光层析法甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒，借助荧光免疫定量分析仪读数，解决了胶体金免疫层析法对于部分弱阳样本不好判读的问题；采用了新式荧光标记工艺，采用荧光微球作为示踪物，提高了荧光探针标记稳定性，实现超高灵敏度，能够在病人发病3～5天后检出阳性，缩短检测窗口期。
[0149]
通过对十几种抗体原料进行筛选，得到的应用于本试剂盒的原料可过国家标准品，且甲型/乙型流感病毒菌株之间无交叉反应；同时本试剂盒能同时检测甲型/乙型流感病毒抗原，通过一次性检测完成流感病毒的临床分型，适合大规模的流行病学调查及应付突发事件，且操作简单，快速，无需专业人士，做到了真正的poct检测，普遍适用于门诊和急诊检测。
[0150]
上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。