β-烟酰胺单核苷酸的化学合成方法与流程

β
‑
烟酰胺单核苷酸的化学合成方法
技术领域
1.本发明涉及药物合成技术领域，尤其涉及一种β
‑
烟酰胺单核苷酸的化学合成方法。


背景技术：

2.烟酰胺单核苷酸(nmn)为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad

)的合成中间体。研究表明其在机体内主要作为nad

的关键前体，通过转化发挥其生理功能，如激活nad

底物依赖性酶sirt1(组蛋白脱乙酰酶)、调节细胞存活、死亡、以及维持氧化还原状态。研究证实，nmn的水平与心脑血管疾病、神经退行性病、糖尿病和肥胖等多种疾病相关。
3.β
‑
烟酰胺单核苷酸是人体内长寿蛋白的辅因子nad

的前体物质。nad

是三羧酸循环的重要辅酶，促进糖、脂肪、氨基酸的代谢，参与能量的合成；nad

参与人体新陈代谢的方方面面，可以通过额外补充nad

，全面改善人体机能。
4.β
‑
烟酰胺单核苷酸(nmn)的化学结构式如下：
[0005][0006]
nmn的生产工艺主要包括酶法和化学合成方法。酶法对生产的条件要求比较高，前期投资大，因此化学合成方法仍然是目前研究中的热点。
[0007]
现有化学合成方法之一：an efficient chemical synthesis of nicotinamide riboside(nar)and analogues报道以四乙酰核糖和烟酰胺为起始原料合成nmn的过程，其中烟酰胺核苷盐的反应收率为58％，存在着反应迅速，不易控制，产物杂质较多，总收率偏低的缺陷。
[0008]
现有化学合成方法之二：以苯甲酰呋喃核糖或乙酰呋喃核糖为原料，经溴代或氯化后，与烟酰胺进行缩合反应生成核苷，再脱去保护基、磷酸化制得目标产物，其中卤代反应收率较低，且环境不友好。
[0009]
现有化学合成方法之三：以乙酰呋喃核糖与烟酰胺乙酯为原料，经缩合、脱保护、磷酸化、氨解、纯化制得成品，该反应路线环境友好，但存在合成步骤较长，操作难度大的缺陷。
[0010]
目前也出现了利用合成新技术，比如在微通道反应器内进行连续反应，企图实现最短的反应时间获得最高的收率。但是微通道等相关技术存在分步热传导效果差的问题，导致杂质比较多，增加了后期分离纯化的难度。
[0011]
鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

[0012]
为此，本发明提供一种β
‑
烟酰胺单核苷酸的化学合成方法。所述方法采用1,2,3,
5
‑
四苯甲酰氧基
‑2‑
c
‑
甲基
‑
beta
‑
d
‑
呋喃核糖和烟酰胺为起始原料反应条件较温和，杂质较低，总收率高，同时还具有合成步骤短，适合于操作，及环境友好的优点。
[0013]
一种β
‑
烟酰胺单核苷酸的化学合成方法，包括：以1,2,3,5
‑
四苯甲酰氧基
‑2‑
c
‑
甲基
‑
beta
‑
d
‑
呋喃核糖和烟酰胺为起始原料，依次经缩合反应、脱苯甲酰基保护基和磷酸化反应，制得β
‑
烟酰胺单核苷酸。
[0014]
本发明意外发现，羟基被苯甲酰基保护后的呋喃核糖因存在较大的空间位阻，其与烟酰胺进行缩合反应，该反应条件相对温和，副产物少，收率高。
[0015]
本发明的合成路线如下：
[0016][0017]
具体合成过程为：含有活泼氢的1,2,3,5
‑
四苯甲酰氧基
‑2‑
c
‑
甲基
‑
beta
‑
d
‑
呋喃核糖(化合物a)在催化剂作用下发生claisen缩合反应得到烟酰胺三苯甲酰基核苷(化合物b)，烟酰胺三苯甲酰基核苷(化合物b)的苯甲酰氧基经碱解得到烟酰胺核苷盐(化合物c)，烟酰胺核苷盐(化合物c)的羟基经磷酸化得到β
‑
烟酰胺单核苷酸(化合物d)。
[0018]
在本发明的一些实施例中，所述缩合反应的温度为40
‑
50℃。
[0019]
在本发明的一些实施例中，所述缩合反应在第一溶剂和催化剂下进行，所述第一溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃、n,n
‑
二甲基甲酰胺、三氯甲烷、二甲基亚砜、丙酮中的至少一种，优选二氯甲烷和/或四氢呋喃；所述催化剂选自三氟甲磺酸、甲苯磺酸或三氟甲磺酸三甲基硅脂，优选三氟甲磺酸；
[0020]
或，所述1,2,3,5
‑
四苯甲酰氧基
‑2‑
c
‑
甲基
‑
beta
‑
d
‑
呋喃核糖、烟酰胺和催化剂的摩尔比为1：(1.5
‑
1.6)：(2.0
‑
2.1)；
[0021]
或，所述第一溶剂的用量(ml)为1,2,3,5
‑
四苯甲酰氧基
‑2‑
c
‑
甲基
‑
beta
‑
d
‑
呋喃核糖质量(g)的5
‑
6倍。
[0022]
在本发明的一些实施例中，所述脱苯甲酰基保护基的温度为35
‑
40℃。
[0023]
在本发明的一些实施例中，所述脱苯甲酰基保护基在第二溶剂和有机碱下进行，所述第二溶剂选自乙醇、甲醇、异丙醇中的至少一种，优选乙醇；所述有机碱选自三乙胺、甲醇钠、乙醇钠或叔丁基醇钾，优选三乙胺；
[0024]
或，所述有机碱与1,2,3,5
‑
四苯甲酰氧基
‑2‑
c
‑
甲基
‑
beta
‑
d
‑
呋喃核糖的摩尔比为(2.5
‑
3)：1；
[0025]
或，将缩合反应的产物溶于第二溶剂中，加入有机碱，控制加料速度使体系温度不超过
‑
5℃。
[0026]
在本发明的一些实施例中，所述磷酸化反应的温度为20
‑
25℃。
[0027]
在本发明的一些实施例中，所述磷酸化反应采用的磷酸化试剂为磷酸三甲酯和三氯氧磷。
[0028]
在本发明的一些实施例中，所述方法还包括对所述磷酸化反应的产物进行阴离子交换树脂脱盐纯化。作为优选，所述阴离子交换树为产自上海华震树脂厂的dd2离子树脂。
[0029]
在本发明的一些实施例中，先用水洗，收集水洗液，再用1
‑
10％cf3cooh洗脱，收集洗脱液，合并水洗液和洗脱液，冻干得到高纯度β
‑
烟酰胺单核苷酸。
[0030]
在本发明的一些实施例中，所述的β
‑
烟酰胺单核苷酸的合成方法，包括以下步骤：
[0031]
(1)缩合反应：将1,2,3,5
‑
四苯甲酰氧基
‑2‑
c
‑
甲基
‑
beta
‑
d
‑
呋喃核糖、烟酰胺和催化剂溶于第一溶剂中，在40
‑
50℃下反应1
‑
3h，降至室温，加入甲醇淬灭反应，减压脱除溶剂，得到烟酰胺三苯甲酰基核苷；
[0032]
(2)脱苯甲酰基保护基：将步骤(1)所得烟酰胺三苯甲酰基核苷溶于第二溶剂中，在
‑
10～
‑
5℃下加入有机碱，控制加料速度使体系温度不超过
‑
5℃，然后升温至35
‑
40℃反应2
‑
3h，滴加稀盐酸使体系显中性，加入甲基叔丁基醚，在0℃析出固体，过滤，得到烟酰胺核苷盐；
[0033]
(3)磷酸化反应：在
‑5‑
0℃下，向步骤(2)所得烟酰胺核苷盐中滴加三氯氧磷和磷酸三甲酯的混合液，保持温度反应1
‑
2小时，反应完毕转室温，加入冰水淬灭反应，乙酸乙酯萃取有机相，浓缩，得到β
‑
烟酰胺单核苷酸粗品；
[0034]
(4)脱盐纯化：将步骤(3)所得β
‑
烟酰胺单核苷酸粗品溶于水中，用dd2离子树脂进行吸附，先用水洗，收集水洗液，再用5％cf3cooh洗脱，收集洗脱液，合并水洗液和洗脱液，冻干得到β
‑
烟酰胺单核苷酸。
[0035]
本发明具有如下技术效果：
[0036]
1、本发明以1,2,3,5
‑
四苯甲酰氧基
‑2‑
c
‑
甲基
‑
beta
‑
d
‑
呋喃核糖和烟酰胺为起始原料进行缩合反应，反应条件温和，副产物少，淬灭反应后，通过减压脱除溶剂即可获得纯度较高的烟酰胺三苯甲酰基核苷，无需纯化可直接用于下一步反应。
[0037]
2、本发明通过三步反应(每一步反应均不需要纯化)和一步脱盐纯化即可获得高纯度的β
‑
烟酰胺单核苷酸，该方法原料易得，反应路线短，后处理简单，绿色环保，且反应总收率高，适合于工业化生产。
具体实施方式
[0038]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
[0039]
以下实施例中采用的烟酰胺、1,2,3,5
‑
四苯甲酰氧基
‑2‑
c
‑
甲基
‑
beta
‑
d
‑
呋喃核糖(cas号：15397
‑
15
‑
6)均为工业级，纯度97％以上。
[0040]
实施例1
[0041]
本实施例提供一种β
‑
烟酰胺单核苷酸的合成方法，包括以下步骤：
[0042]
(1)缩合反应
[0043]
称量58克的1,2,3,5
‑
四苯甲酰氧基
‑2‑
c
‑
甲基
‑
beta
‑
d
‑
呋喃核糖和18.3克的烟酰胺溶解于300ml的四氢呋喃中，搅拌下溶清后，转入带机械搅拌的1000ml三口瓶中，备用。将30克的三氟甲磺酸转入滴液漏斗中，缓慢滴加入上述体系中，滴加时间40分钟，滴加过程中控制温度不超过50℃，滴加完毕后，保持温度50℃，回流2小时，hplc检测反应完全后，降至室温。加入100ml的水淬灭反应；搅拌下加入200ml的二氯甲烷萃取产物，有机相用饱和食盐水洗涤三次，纯化水洗涤一次，减压浓缩至干，得到烟酰胺三苯甲酰基核苷，收率72.0％，
hplc定量纯度87.5％。
[0044]
(2)脱苯甲酰基保护基
[0045]
将上述反应得到的烟酰胺三苯甲酰基核苷溶于300ml的无水乙醇中，降温至
‑
5℃，搅拌下滴加三乙胺40ml，控制滴加速度，因为反应过程中会升温，因此控制温度不能超过
‑
5℃，约1.5小时滴加完毕，搅拌30分钟，升温至35℃，反应2.5小时；hplc检测反应完毕后，滴加一定量的稀盐酸至反应体系为中性。加入200ml的甲叔醚，搅拌下得到有机相。降温至0℃，有产品析出，分离减压干燥，得到烟酰胺核苷盐，收率95.6％，hplc定量纯度93.8％。
[0046]
(3)磷酸化反应
[0047]
将上述反应得到的烟酰胺核苷盐溶于200ml乙腈中，将23克三氯氧磷溶于50ml磷酸三甲酯中备用，在
‑
5℃
‑
0℃下，将磷酸三甲酯和三氯氧磷的混合溶液缓慢的滴加到上述溶液中，保持恒速缓慢的滴加，滴加时间1.5小时，hplc检测反应的进行程度，约3小时反应完毕。加入200ml左右的水淬灭反应；搅拌下加入150ml的乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，浓缩至干，得到β
‑
烟酰胺单核苷酸粗品，收率88.0％，hplc定量纯度91.5％。
[0048]
(4)脱盐纯化
[0049]
将上述步骤得到的β
‑
烟酰胺单核苷酸粗品溶解于水中，用dd2离子树脂吸附，先用水洗，再用5％体积百分比cf3cooh洗脱，收集层析液，冻干得到β
‑
烟酰胺单核苷酸，收率75.6％，hplc定量纯度98.32％。
[0050]
实施例2
[0051]
本实施例提供一种β
‑
烟酰胺单核苷酸的合成方法，包括以下步骤：
[0052]
(1)缩合反应
[0053]
称量58克的1,2,3,5
‑
四苯甲酰氧基
‑2‑
c
‑
甲基
‑
beta
‑
d
‑
呋喃核糖和18.3克的烟酰胺溶解于300ml的二氯甲烷中，搅拌下溶清后，转入带机械搅拌的1000ml三口瓶中，备用。将48克的三氟甲磺酸三甲基硅脂转入滴液漏斗中，缓慢滴加入上述体系中，滴加时间40分钟，滴加过程中控制温度不超过50℃，滴加完毕后，保持温度50℃，回流3小时，hplc检测反应完全后，降至室温。加入200ml的水淬灭反应；搅拌下再加入200ml的二氯甲烷萃取产物，有机相用饱和食盐水洗涤三次，纯化水洗涤一次，减压浓缩至干，得到烟酰胺三苯甲酰基核苷，收率71.5％，hplc定量纯度86.8％。
[0054]
(2)脱苯甲酰基保护基
[0055]
将46克的甲醇钠溶解于50ml的乙醇中备用；将上述反应得到的烟酰胺三苯甲酰基核苷溶于300ml的无水乙醇中，降温至
‑
5℃，搅拌下滴加甲醇钠的乙醇溶液，控制滴加速度，因为反应过程中会升温，因此控制温度不能超过
‑
5℃，约2小时滴加完毕，搅拌30分钟，升温至35℃，反应4小时；hplc检测反应完毕后，滴加一定量的稀盐酸至反应体系为中性。加入200ml的甲叔醚，搅拌下得到有机相。降温至0℃，有产品析出，分离减压干燥，得到烟酰胺核苷盐，收率95.0％，hplc定量纯度93.2％。
[0056]
(3)磷酸化反应
[0057]
将上述反应得到的烟酰胺核苷盐溶于200ml乙腈中，将23克三氯氧磷溶于50ml磷酸三甲酯中备用，在
‑
5℃
‑
0℃下，将磷酸三甲酯和三氯氧磷的混合溶液缓慢的滴加到上述溶液中，保持恒速缓慢的滴加，滴加时间1.5小时，hplc检测反应的进行程度，约3小时反应完毕。加入200ml左右的水淬灭反应；搅拌下加入150ml的乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，
浓缩至干，得到β
‑
烟酰胺单核苷酸粗品，收率87.5％，hplc定量纯度90.5％。
[0058]
(4)脱盐纯化
[0059]
将上述步骤得到的β
‑
烟酰胺单核苷酸粗品溶解于水中，用dd2离子树脂吸附，先用水洗，再用5％体积百分比cf3cooh洗脱，收集层析液，冻干得到β
‑
烟酰胺单核苷酸，收率72.3％，hplc定量纯度97.50％。
[0060]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。