花色苷合成相关蛋白IbMYB113及其编码基因与应用的制作方法

花色苷合成相关蛋白ibmyb113及其编码基因与应用
技术领域
1.本发明属于植物生物技术领域，具体涉及花色苷合成相关蛋白ibmyb113及其编码基因克隆与应用。


背景技术：

2.甘薯是世界上重要的粮食作物、经济作物和能源作物之一，薯皮色主要有白色、浅黄、黄色、浅红色、红色、紫色、深紫色等；薯肉色主要有白色、黄色、橙色、红色、紫色、深紫色、混合色等。红色和紫色甘薯品种主要是含有花色苷，因具有漂亮的薯块外观和优秀的保健功能非常受消费者青睐。
3.花色苷是一种水溶性天然色素，广泛存在于高等植物中，是类黄酮代谢途径中最主要的代谢产物。目前自然界已经发现超过635种花色苷，植物中常见的主要有6种，分别是天竺葵色素、矢车菊素、飞燕草素、芍药色素、矮牵牛色素和锦葵色素。对植物而言，花色苷参与许多重要的生物学过程，花色苷在植物地上部分如花器官、果实、叶片和茎中积累，使其具有鲜艳颜色而吸引虫媒传粉者和果实传播者，也可以保护植物防御紫外线伤害，抵抗病虫害等；花色苷在植物地下部分如块根块茎类作物马铃薯块茎和甘薯块根中积累，受环境因素影响较小，光稳定性和热稳定性较好，可提高植物对生物胁迫和非生物胁迫的抗性。对人类而言，花色苷具有抗氧化，抗突变，抗炎症，清除游离自由基，降低癌症、关节炎、心血管疾病、糖尿病和神经性疾病的风险，保护生物体机能等多种保健功能。
4.植物中花色苷的生物合成主要涉及苯丙氨酸裂解酶(pal)、肉桂酸
‑4‑
羟化酶(c4h)、4
‑
香豆酰coa连接酶(4cl)、查尔酮合成酶(chs)、查尔酮异构酶(chi)、黄烷酮
‑3‑
羟化酶(f3h)、类黄酮
‑
3'
‑
羟化酶(f3'h)、类黄酮
‑
3',5'
‑
羟化酶(f3'5'h)、二氢黄酮醇还原酶(dfr)、花青素合成酶(ans)、糖基转移酶(gts)等结构基因，以及myb、bhlh和wd40等三类转录因子。目前甘薯花色苷的研究主要集中在紫甘薯中花色苷的合成与积累，ibchs、ibchi、ibf3'h、ibdfr、ibans、ibufgt以及ibgstf4等结构基因已经得到克隆，并且发现一个重要的转录因子ibmyb1
‑
2。ibmyb1
‑
2可以调控紫甘薯薯肉花色苷的生物合成与积累，然而受限于甘薯的多倍性、基因组杂合、遗传背景复杂，甘薯中新的花色苷合成调控基因还没有被发现，如甘薯红色薯皮中花色苷的生物合成与积累的调控基因还不清楚，需要进一步研究。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种花色苷合成相关蛋白ibmyb113及其编码基因克隆与应用。
6.本发明所克隆的花色苷合成相关蛋白，名称为ibmyb113，来源于甘薯(ipomoea batatas)，其氨基酸序列如seq id no:2所示，由236个氨基酸残基组成。
7.本发明所克隆的ibmyb113蛋白的编码基因，为编码seq id no:2所示氨基酸序列的核酸分子。
8.具体的，本发明所克隆的ibmyb113蛋白的编码基因，可以是如seq id no:1所示的
核苷酸序列。
9.本发明提供了含有所述ibmyb113蛋白编码基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
10.所述含有ibmyb113蛋白编码基因的重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入seq id no:1所示的核苷酸序列得到的重组质粒。
11.具体的，所述重组载体可为将质粒phellsgate12的限制性内切酶xhoi和xbai位点之间的小片段替换为seq id no:1所示的核苷酸序列，得到的重组质粒phellsgate12
‑
ibmyb113。
12.所述含有ibmyb113蛋白编码基因的重组微生物可为将上述含有ibmyb113蛋白编码基因的重组载体导入农杆菌或大肠杆菌得到的重组工程菌。
13.具体的，所述重组微生物可为将重组质粒phellsgate12
‑
ibmyb113导入根癌农杆菌gv3101，得到的重组农杆菌gv3101
‑
phellsgate12
‑
ibmyb113。
14.本发明还提供了所述蛋白质ibmyb113，或，所述ibmyb113蛋白的编码基因，或，所述含有ibmyb113蛋白的编码基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系，在调控植物花青素合成及种类和含量中的应用。所述植物为烟草；所述烟草为红花大金元。
15.本发明还提供了所述蛋白质ibmyb113，或，所述ibmyb113蛋白的编码基因，或，所述含有ibmyb113蛋白的编码基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系，在培育花色苷合成与积累增加的转基因植物、促进植物飞燕草色素和矢车菊色素合成与积累中的应用。所述植物为烟草；所述烟草为红花大金元。
16.本发明还提供了一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将ibmyb113蛋白的编码基因或核酸分子导入受体植物，获得转基因植物；与受体植物相比，转基因植物花色苷含量提高。所述ibmyb113蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。所述ibmyb113蛋白的编码基因可以是如seq id no:1所示的核苷酸序列。
17.具体的，本发明提供的一种培育转基因植物的方法：将phellsgate12质粒中xhoi和xbai两个限制性酶切位点之间的小片段替换为ibmyb113蛋白的编码基因或核酸分子(可以是如seq id no:1所示的核苷酸序列)，得到的重组载体phellsgate12
‑
ibmyb113，将该重组载体导入植物中，获得ibmyb113过表达的转基因植物；与受体植物相比，转基因植物花色苷含量提高，特别是飞燕草色素和矢车菊色素的合成与积累明显增强，含量显著增加。
18.本发明提供的ibmyb113蛋白及其编码基因，通过农杆菌介导的遗传转化将该基因导入普通栽培烟草
‘
红花大金元’中，获得转基因烟草植株。实验证明，与对照相比，过表达ibmyb113蛋白编码基因的转基因植株表现为全株紫色，高效液相色谱(hplc)检测其飞燕草色素和矢车菊色素含量显著增加。
‘
红花大金元’是市场主要栽培品种之一，烟叶产量品质较佳，通过遗传改良产生高花色苷含量的转基因烟草，可以直接用于生产飞燕草色素和矢车菊色素产品，具有广阔的应用潜力。因此，本发明提供的ibmyb113蛋白及其编码基因对于促进植物花色苷的合成与积累具有重要的理论意义和应用价值。
附图说明
19.图1是wt和ibmyb113
‑
oe转基因烟草植株幼苗表型图，wt为空载体phellsgate12转化的烟草植株，ibmyb113
‑
oe为表达载体phellsgate12
‑
ibmyb113转化的烟草植株。
20.图2是wt和ibmyb113
‑
oe转基因烟草植株花青素hplc检测图。
21.图3是wt和ibmyb113
‑
oe转基因烟草植株花青素含量图，nd表示未检测到。
具体实施方式
22.以下结合附图和具体实施案例对本发明作进一步详细描述，以下实施案例仅为了更好地阐释本发明，但并不限定本发明。
23.以下实施案例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下实施案例中所用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途经得到。
24.实施案例1.甘薯花色苷合成相关蛋白ibmyb113及其编码基因的克隆
25.ibmyb113基因的克隆步骤如下：
26.1.采用北京全式金生物技术有限公司生产的trizol试剂进行甘薯总rna的提取，具体操作步骤如下：
27.①
取适量甘薯红色薯皮在研钵中用液氮迅速研磨成粉；
28.②
将磨好的样品约0.1g转入1.5ml离心管，加入1.0ml trizol试剂，涡旋震荡15sec后室温静置5min；
29.③
加入0.2ml氯仿，涡旋震荡15sec后室温静置3min；
30.④
4℃、12000rpm离心15min，取上清液约550μl至另一新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，充分混匀，室温静置10min；
31.⑤
4℃、12000rpm离心10min，弃上清，留沉淀；
32.⑥
加入1.0ml 75％酒精，洗脱沉淀1次，4℃、7500rpm离心5min，弃上清，留白色沉淀；
33.⑦
超净工作台风干5
‑
10min，彻底去除残余酒精；
34.⑧
加入40μl depc水，56℃金属浴2min溶解沉淀；
35.⑨
取4μl进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测rna质量，其余保存至
‑
80℃冰箱。
36.2.cdna第一链的合成
37.采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的iii 1st strand cdna synthesis kit( gdna wiper)试剂盒(r312
‑
01)进行cdna第一链合成，具体操作步骤如下：
38.①
取上一步提取的甘薯总rna 3μl加入rnase
‑
free离心管中，然后加入rnase
‑
free ddh2o补足至8μl，65℃金属浴5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min；
39.②
加入2μl 5
×
gdna wiper mix，用移液枪轻轻吹打混匀，42℃金属浴2min；
40.③
分别加入以下试剂：2μl 10
×
rt mix、2μl hiscript iii enzyme mix、1μl oligo(dt)
20
vn、5μl rnase
‑
free ddh2o，用移液枪轻轻吹打混匀，在pcr仪上50℃45min、85℃5sec；
41.④
取2μl于0.5ml离心管中，稀释10倍用于后续实验，并保存至
‑
20℃冰箱。
42.3.根据甘薯红色薯皮的转录组测序结果，筛选获得g17108转录本作为花色苷合成相关的候选基因，kegg功能注释为myb转录因子，通过同源序列比对找到g17108转录本的全长cdna序列，并设计正向引物和反向引物进行pcr扩增。引物交由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列如下：
43.正向引物(forward primer)：5'
‑
gtatagcataccctgtcatgg
‑
3'
44.反向引物(reverse primer)：5'
‑
ataaagatttcgtacacgactt
‑
3'
45.4.以步骤2获得的cdna为模板，用步骤3设计的引物对进行pcr扩增反应。dna聚合酶为北京全式金生物技术有限公司生产的dna polymerase。
46.pcr反应体系如下：
[0047][0048]
pcr反应程序如下：
[0049][0050]
pcr扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，获得长度约720bp的片段。
[0051]
5.使用上海捷瑞生物工程有限公司生产的pcr产物纯化试剂盒(离心柱型)将pcr产物纯化；纯化后的pcr产物使用上海生工生物工程股份有限公司生产的t载体pcr产物快速连接试剂盒进行t载体克隆，经菌落pcr法确认t载体中插入片段长度大小一致；将阳性菌落挑至含有氨苄青霉素的lb液体培养中，37℃、200rpm培养过夜，使用北京全式金生物技术有限公司生产的plasmid miniprep kit(em101)提取质粒，送上海生工生物工程股份有限公司测序。以上实验操作均按照试剂盒说明书进行。
[0052]
测序结果表明，该pcr扩增产物具有如seq id no.1所示的核苷酸序列，将seq id no.1所示的核苷酸序列命名为ibmyb113基因，长度为711bp，其编码的蛋白质命名为ibmyb113蛋白或蛋白ibmyb113，氨基酸序列如seq id no.2所示，由236个氨基酸残基组成。
[0053]
实施案例2.甘薯ibmyb113蛋白在调控植物花色苷合成与积累中的应用
[0054]
一、过表达ibmyb113转基因全紫烟草的获得
[0055]
1.植物表达载体构建
[0056]
使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的ii one step cloning kit(c112)构建植物表达载体，具体步骤如下：
[0057]
①
线性化载体制备：用限制性内切酶xhoi和xbai双酶切载体phellsgate12，回收约13798bp的线性化载体片段。
[0058]
②
插入片段获得：以实施案例1获得ibmyb113质粒dna为模板，在ibmyb113基因正反向扩增引物的5'端引入线性化载体两末端同源序列，即正向引物oe
‑
f：5'
‑
ttggagaggacacgctcgagatggctaattcatcatgtgc
‑
3'(下划线为上游载体末端同源序列)，反向引物oe
‑
r：5'
‑
tcattaaagcaggactctagttagcttaaaagttgggaaa
‑
3'(下划线为下游载体末端同源序列)，进行pcr扩增，获得含有线性化载体末端同源序列的ibmyb113基因片段。
[0059]
③
重组转化：将步骤
①
得到的线性化载体和步骤
②
得到含有线性化载体末端同源序列的ibmyb113基因片段进行重组反应，得到重组产物；将重组产物转化到dh5α大肠杆菌
感受态细胞，过夜培养形成数百个白色单菌落。
[0060]
④
植物表达载体获得：挑取步骤
③
产生的若干个白色菌落进行菌落pcr鉴定，将阳性菌落接种至含有壮观霉素的lb液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，使用北京全式金生物技术有限公司生产的plasmid miniprep kit(em101)提取质粒，得到重组质粒phellsgate12
‑
ibmyb113，即为植物表达载体，保存于
‑
20℃冰箱，并将该重组质粒送上海生工生物工程股份有限公司测序。测序结果表明，重组质粒phellsgate12
‑
ibmyb113为用序列表中seq id no.1所示的核苷酸替换phellsgate12质粒限制性内切酶xhoi和xbai位点之间的小片段，得到的重组质粒。植物表达载体phellsgate12
‑
ibmyb113表达序列表中seq id no.2所示的ibmyb113蛋白。
[0061]
2.植物表达载体转化农杆菌
[0062]
①
从
‑
80℃取出提前制备的100μl的gv3101感受态细胞，
‑
20℃冰箱取出上述步骤1得到的植物表达载体phellsgate12
‑
ibmyb113，置于冰上解冻；
[0063]
②
取5μl植物表达载体phellsgate12
‑
ibmyb113加入到100μl的gv3101感受态细胞中，轻轻吹打混匀；
[0064]
③
依次冰浴20min、液氮速冻1min、37℃水浴5min、冰上静置3min；
[0065]
④
加入1ml无抗生素的lb液体培养基，28℃、200rpm培养4h；
[0066]
⑤
5000rpm离心1min，收集菌体，弃上清，留约100μl上清将菌体重悬；
[0067]
⑥
将菌液在含有50μg/ml利福平(rif)和50μg/ml壮观霉素(spe)的lb固体培养基平板上均匀涂布，28℃倒置培养2
‑
3天；
[0068]
⑦
挑取白色单菌落进行菌落pcr鉴定，将阳性菌落接种至含有50μg/ml利福平(rif)和50μg/ml壮观霉素(spe)的lb液体培养基中，28℃、200rpm培养至菌液od600值达到0.8～1.0，即得到重组农杆菌gv3101
‑
phellsgate12
‑
ibmyb113，放入4℃冰箱保存备用。
[0069]
3.农杆菌介导的烟草遗传转化
[0070]
①
准备栽培烟草
‘
红花大金元’种子，75％酒精、2％次氯酸钠表面消毒后播种于ms固体培养基，25℃、光照16h/黑暗8h培养4
‑
5周；
[0071]
②
选择健壮嫩绿的烟草叶片置于提前灭菌的培养皿中，使用手术刀切去叶脉和叶边缘，均匀划出伤口，切取足够多的2cm
×
2cm的烟草叶盘；
[0072]
③
配制含有100μm乙酰丁香酮(as)的ms液体培养基，适当稀释步骤2得到的重组农杆菌gv3101
‑
phellsgate12
‑
ibmyb113至od600值为0.5～0.6，将烟草叶盘转入稀释后重组农杆菌中侵染浸泡8min；
[0073]
④
使用无菌滤纸吸干烟草叶盘上多余的菌液，将烟草叶盘正面整齐放置在共培养培养基(ms 1.0μg/ml 6
‑
ba 0.1μg/ml naa 100μmas)上，在黑暗条件下共培养48h；
[0074]
⑤
将共培养的烟草叶盘转移到筛选再生培养基(ms 1.0μg/ml 6
‑
ba 0.1μg/ml naa 400mg/l头孢噻肟(cef) 100mg/l卡那霉素(kan))上，25℃、光照16h/黑暗8h培养，诱导产生愈伤组织，并每30d继代1次，至分化成芽；
[0075]
⑥
切取再生芽，继代于生根培养基(ms 200mg/l cef 50mg/l kan)上，培养至长成完整植株，获得转基因烟草植株。
[0076]
4.过表达ibmyb113转基因烟草表型鉴定和花青素含量测定
[0077]
根据步骤3，以phellsgate12空载体转化的烟草为对照，即野生型烟草wt，以
phellsgate12
‑
ibmyb113表达载体转化的烟草做比较分析，即ibmyb113
‑
oe；观察表型，烟草叶盘在筛选再生培养基上约30d开始诱导出愈伤组织，并且继代3次后，诱导的愈伤组织分化成芽，将芽转接至生根培养基。如图1所示，wt烟草整株均为绿色，ibmyb113
‑
oe烟草整株均为紫色，与wt烟草相比，ibmyb113
‑
oe烟草表现为明显的花色苷合成与积累。
[0078]
在生根培养基上培养30
‑
60d后，得到转基因烟草幼苗。参照中华人民共和国农业行业标准《ny/t2640
‑
2014植物源性食品中花青素的测定
‑
高效液相色谱法》检测wt和ibmyb113
‑
oe转基因烟草植株的花青素种类和含量，实验重复三次取平均值。hplc检测结果如图2所示，在wt烟草幼苗中未检测到花青素的峰图，在ibmyb113
‑
oe烟草幼苗中检测到飞燕草色素和矢车菊素两种花青素的峰图，并且矢车菊素的峰面积大于飞燕草色素峰面积。根据峰面积计算含量，结果如图3所示，wt烟草幼苗中未检测到花青素(no detect，nd)，ibmyb113
‑
oe烟草幼苗中飞燕草色素和矢车菊素含量平均含量均高于25mg/100g，总花青素含量达到59mg/100g，与wt烟草幼苗相比，ibmyb113
‑
oe烟草幼苗花青素含量极显著增加。
[0079]
上述实验结果表明，过表达ibmyb113基因能显著促进烟草花色苷合成与积累，更具体是促进烟草中飞燕草色素和矢车菊色素的合成与积累。
[0080]
本发明通过转录组测序、分子克隆和遗传转化等分子生物学技术，在甘薯红色薯皮中克隆和鉴定新的花色苷生物合成和调控基因，并在栽培烟草品种
‘
红花大金元’中进行基因功能验证，可为植物花色苷生物合成调控网络提供理论依据，并为作物品质改良和高花色苷作物新品种培育提供新的基因资源。
[0081]
以上对本发明进行了详细阐述，应该理解到，以上所述的实施案例仅是为了更好的理解本发明，可以对本发明作进一步的改进，并不用以对本发明做任何形式上的限制。总之，在本发明的精神和原则范围内所作的任何修饰、变更或改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。