一种多肽及其在制备治疗血小板增多症或抗肿瘤转移药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及一种多肽及其在制备治疗血小板增多症或抗肿瘤转移药物中的应用，属于生物医药技术领域。


背景技术：

2.血小板增多症是指可能由细胞因子驱动(反应性)机制引起，或者有不依赖生长因子(自发性)的克隆性/肿瘤性巨核细胞过度生成引起血小板增多，如骨髓增殖性肿瘤或慢性粒细胞白血病等。主要分为：1，反应性血小板增多是指不存在慢性骨髓增殖性疾病情况下，由于内科或外科情况导致血小板增多，当这些情况缓解后血小板计数恢复正常。2，自发性血小板增多是指确诊慢性骨髓增殖性肿瘤包括真性红细胞增多症、原发性骨髓纤维化、慢性粒细胞白血病、骨髓增生异常综合征难治性贫血伴环形铁粒幼细胞增多的患者同时伴有血小板增多。3，原发性血小板增多症是以巨核细胞增生为主的造血干细胞克隆性疾病。
3.临床上使用阿司匹林等方法治疗血小板增多症，然而长期使用阿司匹林可能会导致出血并发症。而且，当血小板计数大于1000
×
109/l时，抗血小板疗法不能减少血栓的发生，反而可能会增加出血的风险。而且低剂量的阿司匹林可能会促进获得性血管性血友病综合症的发展，加重凝血功能障碍。
4.目前，还没有关于利用诱导血小板凋亡的方法来治疗血小板增多症的报道。而众所周知，血小板凋亡类似于细胞程序性死亡一样，在免疫系统的参与下，凋亡的血小板表面上暴露出磷脂酰丝氨酸“吃我”的信号，然后在肝脏中被巨噬细胞识别并捕捉而清除。此过程类似细胞程序性死亡，并不会在体内引起强烈的炎症反应，因而副作用大大减低。
5.血小板具有一种固有的粘附能力，长期以来被认为是止血和血栓形成所必需的。除了用于血液凝血和血栓形成外，越来越明显的是，血小板的粘附潜能影响病理事件，而不仅仅是其在维持止血和血栓的形成。肿瘤转移是恶性肿瘤导致人类死亡的主因。当肿瘤细胞脱离原发肿瘤进入血液后会与血小板结合并激活血小板，活化的血小板聚集在肿瘤细胞周围与肿瘤形成聚集体，不但使得肿瘤细胞逃逸nk细胞的杀伤，还帮助肿瘤细胞在特定部位粘附于血管壁从而进入组织形成转移灶。由此可见，肿瘤细胞进入血后与血小板之间的相互作用成为了肿瘤细胞逃逸杀伤成功转移的先决条件。事实上，最新的研究结果表明，实验性降低循环血小板数量可以显著地减少直至彻底阻断肿瘤转移。
6.但是，目前还没有通过诱导血小板凋亡治疗血小板增多症和抗肿瘤转移的药物。


技术实现要素：

7.为解决上述技术问题，本发明提供一系列多肽序列，并首次通过实验证明了该系列多肽，尤其是含有九个氨基酸的多肽(m9aa)可在体外诱导血小板凋亡，并在体内诱导血小板减少，从而抑制肿瘤转移，可以用来研制新型的治疗血小板增多症和抗肿瘤转移药物，极其具有科研和经济价值。因此，本发明提供了多肽m9aa在制备治疗血小板增多症和抗肿
瘤转移药物中的用途。
8.本发明的第一个目的是提供一种多肽，所述多肽包含氨基酸序列irysghpsl，且所述多肽具有诱导血小板凋亡作用。其中p表示倒数第二位氨基酸被磷酸化修饰。
9.进一步地，所述的多肽的氨基酸序列为irysghpsl、sirysghpsl、vsirysghpsl、tvsirysghpsl、stvsirysghpsl、lstvsirysghpsl、llstvsirysghpsl、dllstvsirysghpsl、qdllstvsirysghpsl、gqdllstvsiirysghpsl、rgqdllstvsirysghpsl、grgqdllstvsirysghpsl、qgrgqdllstvsirysghpsl、sqgrgqdllstvsirysghpsl、lsqgrgqdllstvsirysghpsl、alsqgrgqdllstvsirysghpsl、salsqgrgqdllstvsirysghpsl和psalsqgrgqdllstvsirysghpsl。
10.在本发明中，最短只有8个氨基酸的多肽具有诱导血小板凋亡作用，在本发明实施例中，验证达到18个氨基酸的多肽仍具有诱导血小板凋亡作用，在实际应用过程中，在本发明基础多肽链的基础上，增加、减少或突变其中一种或几种氨基酸后，具有诱导血小板凋亡作用的多肽，依然在本发明的保护范围内。
11.进一步地，所述多肽还包括对其c末端、n末端、中间残基中的一处或多处位点进行烷基化修饰、氨基化修饰、乙酰化修饰、生物素标记、fitc标记、二硫键修饰、磷酸化修饰、脂肪酸修饰、聚乙二醇修饰中的一种或多种修饰后，具有诱导血小板凋亡作用的多肽。
12.本发明的第二个目的是提供所述的多肽在制备治疗血小板增多症的药物中的应用。
13.进一步地，所述的多肽通过诱导血小板凋亡来治疗血小板增多症。
14.进一步地，所述的治疗血小板增多症的药物为注射剂或口服剂。
15.进一步地，所述的治疗血小板增多症的药物的使用剂量为5～20mg/kg。
16.本发明的第三个目的是提供所述的多肽在制备抗肿瘤转移药物中的应用。
17.进一步地，所述的多肽通过诱导血小板凋亡减少血小板来阻断肿瘤在体内转移。
18.进一步地，所述的抗肿瘤转移药物为注射剂或口服剂。
19.进一步地，所述的抗肿瘤转移药物的使用剂量为5～20mg/kg。
20.本发明的第四个目的是提供一种药物组合物，所述的药物组合物中含有安全有效量的所述的多肽，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
21.在本发明中，所述“有效量”是指可对人或动物产生功能或活性，且可被人或动物所接受的量。所述“药学上可接受的”成分是是指适用于人或动物而无过度不良副反应的物质，即有合理的效益/风险比的物质。
22.本发明的有益效果是：
23.本发明首次通过实验探究了多肽m9aa诱导血小板凋亡的发生机制。并发现，多肽m9aa不仅能够在体外诱导人和小鼠血小板发生凋亡，而且能够在小鼠体内诱导凋亡依赖的血小板减少，同是抑制肿瘤的转移。为开发治疗血小板增多症和抗肿瘤转移药物提供了一个新的方向。
附图说明：
24.图1为m9aa同型但不同氨基酸数多肽体外诱导人血小板凋亡效果示意图。
25.图2为9个氨基酸的多肽m9aa体外诱导人洗涤血小板凋亡示意图。
26.图3为多肽m9aa剂量依赖性性诱导小鼠体内血小板清除效果示意图。
27.图4为每天给小鼠静脉注射多肽m9aa(7.5mg/kg)，持续注射14天，并每天采血检测小鼠外周血血小板数示意图。
28.图5为给小鼠静脉注射多肽m9aa(7.5mg/kg)，抑制b16f10细胞向肺部转移示意图。
29.图6为给小鼠静脉注射多肽m9aa(7.5mg/kg)，抑制肺癌细胞(llc)转移示意图
具体实施方式
30.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
31.实验用小鼠：野生型c57bl/6j(wild type，wt)小鼠，购自斯莱克实验动物有限责任公司(上海)。在此项研究中，根据中华人民共和国《实验动物管理条例》规定，所有实验动物相关操作均按照《实验动物管理条例》执行。而且，实验中所用到的所有小鼠均饲养于苏州大学spf级动物房内。在开展所有小鼠相关研究之前，小鼠均正常喂食喂水，执行12h/12h标准化饲养，实验结束后所有小鼠均脱颈处死，尽量避免所有小鼠在实验过程中承受太多痛苦。本实验所用小鼠选择6
‑
10周龄大小，雌雄各半。动物实验获得苏州大学医学伦理委员会批准。
32.洗涤血小板：分别采集人和小鼠血液，按照7：1的体积比将全血和葡萄糖柠檬酸钠(acid citrate dextrose，acd)(2.5％柠檬酸钠，2.0％葡萄糖，1.5％柠檬酸)抗凝，轻轻混匀抗凝后的全血，使用离心机200
×
g离心20分钟(minute，min)，得到富含血小板血浆(platelet
‑
rich plasma，prp)，prp经1700
×
g离心2min，弃去上清液，沉淀部分用cgs缓冲液(0.123mol/lna cl、0.033mol/l d
‑
葡萄糖、0.013mol/l枸橼酸三钠，ph6.5)重悬，离心1700
×
g，2min，弃去上清液，沉淀部分重悬于mtb(modified tyrode`s buffer)缓冲液(2.5mmol/l hepes、150mmol/l nacl、2.5mmol/l kcl、12mmol/l nahco3、5.5mmol/l d
‑
葡萄糖、1mmol/lcacl2、1mmol/l mgcl2，ph 7.4)缓冲液，最后调整血小板悬液的终浓度至3
×
108/ml。补充ca
2
，mg
2
至离子终浓度为1mm，室温静置1小时备用。
33.流式细胞术：多肽与自愿者血小板在37℃温育30min，后加入总体积每管350ml jc
‑
1使其终浓度为2μg/ml，室温下避光孵育5min后，使用流式细胞仪进行检测。流式细胞仪检测血小板凋亡的特征是jc
‑
1标记阳性聚集体的含量减少，这一结果主要反映在流式fl2通道中荧光数量的减少，而流式fl1通道的荧光数量增多。流式细胞仪检测fitc标记的lactadherin检测血小板表面的磷脂酰丝氨酸(ps)外翻。多肽与自愿者血小板在37℃温育30min后加入10ug/ml fitc
‑
lactadherin，充分混匀后，在室温条件下孵育20分钟，在流式细胞仪上机检测前，再加入400ml pbs，流式细胞仪上血小板凋亡的主要特征是fl1通道的荧光数量明显增多。
34.用fitc标记的小鼠cd62p抗体检测血小板p选择素表达。多肽与自愿者血小板在37℃温育30min后加入fitc标记的cd62p抗体，充分混匀后，室温条件下孵育20分钟后，流式检测前再加入400ml pbs，血小板活化的特征是fl1通道荧光数量增多。用fitc标记pac
‑
1标记活化αⅱbβ3，20ug/ml fitc
‑
pac
‑
1加入待测血小板中，充分混匀后，室温孵育20分钟后，流式检测前加入pbs补足总体积400ml，血小板活化的特征是fl1通道荧光数量增多。
35.实施例1：
36.体外合成多肽m5aa(sghpsl)、m6aa(ysghpsl)、m7aa(rysghpsl)、m8aa(irysghpsl)m9aa(sirysghpsl)、m12aa(stvsirysghpsl)、m18aa(rgqdllstvsirysghpsl)。以上七种多肽以100μm与人的洗涤血小板在37℃条件下共同孵育5分钟，后加入总体积每管350ml jc
‑
1使其终浓度为2μg/ml，室温下避光孵育5min后，使用流式细胞仪进行检测。流式细胞仪检测血小板凋亡的特征是jc
‑
1标记阳性聚集体的含量减少，这一结果主要反映在流式fl2通道中荧光数量的减少，而流式fl1通道的荧光数量增多。流式细胞仪检测fitc标记的lactadherin检测血小板表面的磷脂酰丝氨酸(ps)外翻。m9aa与自愿者血小板在37℃温育30min后加入10ug/ml fitc
‑
lactadherin，充分混匀后，在室温条件下孵育20分钟，在流式细胞仪上机检测前，再加入400ml pbs，流式细胞仪上血小板凋亡的主要特征是fl1通道的荧光数量明显增多。
37.用fitc标记的小鼠cd62p抗体检测血小板p
‑
选择素表达。m9aa与自愿者血小板在37℃温育30min后加入fitc标记的cd62p抗体，充分混匀后，室温条件下孵育20分钟后，流式检测前再加入400ml pbs，血小板活化的特征是fl1通道荧光数量增多。用fitc标记pac
‑
1标记活化αⅱbβ3，20ug/ml fitc
‑
pac
‑
1加入待测血小板中，充分混匀后，室温孵育20分钟后，流式检测前加入pbs补足总体积400ml，血小板活化的特征是fl1通道荧光数量增多。如图1所示，m8aa、m9aa、m12aa和m18aa可明显诱导血小板凋亡。
38.实施例2：
39.以9个氨基酸的多肽m9aa(sirysghpsl)为例，不同浓度的多肽m9aa和对照肽mm9aa(没有磷酸化修饰)(25μm、50μm、75μm、100μm)在体外与人的洗涤血小板在37℃条件下共同孵育5分钟，流式细胞仪检测血小板凋亡。如图2所示，多肽m9aa可以在体外剂量依赖性地诱导血小板凋亡。
40.实施例3：
41.通过尾静脉注射的方式，将多肽m9aa和对照肽mm9aa(5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg)注射到野生型c57bl/6j小鼠体内，然后在5分钟，2小时，4小时，24小时和48小时时间点采取小鼠血液，使用血细胞计数仪检测小鼠外周血血小板数量。结果如图3所示，多肽m9aa可以剂量依赖性地诱导小鼠体内血小板的清除。
42.实施例4：
43.通过尾静脉注射的方式，每天一次将多肽m9aa和对照肽mm9aa(7.5mg/kg)注射到野生型c57bl/6j小鼠体内，采取小鼠血液，计数小鼠外周血血小板数量。结果如图4所示，结果显示多肽m9aa可以持续诱导小鼠体内血小板减少。
44.实施例5：
45.wt c57bl/6j小鼠球后静脉注射注射m9aa(7.5mg/kg)清除小鼠体内血小板，两小时后尾静脉注射1
×
105b16f10细胞。给注射过肿瘤细胞的小鼠正常喂食两周后脱颈处死，取出肺观察b16f10细胞在肺部转移灶数量。结果如图5所示，小鼠注射m9aa清除体内血小板后可以显著地抑制b16f10细胞向肺部转移。
46.实施例6:
47.wt c57bl/6j小鼠皮下注射1
×
106/ml llc细胞，10天后手术切除原位肿瘤，以提高小鼠生存。然后每隔一天给予手术后小鼠持续两周静脉注射7.5mg/kg m9aa清除体内血小板治疗。治疗完成20天后脱颈处死小鼠取肺部组织观察，切片h&e染色，显微镜观察。结果
如图6所示，m9aa清除小鼠体内血小板后可以显著的抑制肺癌细胞(llc)向肺部转移。
48.以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。