一种冠状病毒抗体联检试纸条、试剂卡及其制备方法与流程

1.本发明是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种以胶体金侧向层析技术为基础的捕获法制备的一种快速检测人新型冠状病毒抗体的胶体金试纸条、试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.新型冠状病毒sars-cov-2是一种引起covid-19的密切相关的冠状病毒，covid-19患者以发热、干咳、乏力为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等症状，重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官衰竭等。
3.新型冠状病毒隐蔽性强，有症状不明显轻症患者，甚至有无症状感染者。新型冠状病毒正对全球医疗健康系统和医疗机构造成严峻挑战，新型冠状病毒目前已在全球200多个国家出现指数级蔓延。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种人新型冠状病毒抗体联检检测试纸条、试剂卡及其制备方法，具有操作简便、反应快速、敏感度高、特异性强、适合现场检测等优点。对发热病人进行快速初筛，可提高疑似病例确诊率，如针对无症状人群大规模筛查，通过同时检测人体中igm抗体和igg抗体，有利于快速检出冠状病毒潜在感染者。
5.一种新型冠状病毒igm、igg抗体的检测试纸条，包括pvc底板，在pvc底板的一面顺次相互搭接地粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜（简称：nc膜）和吸水垫，其特征在于：所述结合垫为涂覆有重组新型冠状病毒抗原-胶体金复合物及鸡igy抗体-胶体金复合物的玻璃纤维素膜，所述硝酸纤维素膜分别包被有鼠抗人igm抗体的检测线、鼠抗人igg抗体的检测线、羊抗鸡igy抗体的质控线。
6.所述冠状病毒igm、igg抗体的检测试纸条，其特征在于：重组新型冠状病毒抗原-胶体金复合物及鸡igy抗体-胶体金复合物混合溶液喷至结合垫上，在37℃烘箱里干燥12-24h。
7.所述冠状病毒igm、igg抗体的检测试纸条，其特征在于：所述鼠抗人igg抗体、鼠抗人igm抗体、羊抗鸡igy抗体用抗体稀释液稀释后划到硝酸纤维素膜上包被并干燥而得，干燥条件为37℃干燥4小时。
8.所述冠状病毒igm、igg抗体的检测试纸条，其特征在于：所述抗原选自重组新型冠状病毒s蛋白、重组新型冠状病毒n蛋白中的一种或两种。
9.所述冠状病毒igm、igg抗体的检测试纸条，其特征在于：所述抗体稀释液由ph7.4磷酸盐缓冲液溶解蔗糖制备而成。
10.一种新型冠状病毒igm、igg抗体的检测试剂卡，其特征在于：所述试剂卡包括所述的检测试纸条和试剂卡壳。
11.一种新型冠状病毒igm、igg抗体的检测试剂盒，一种包括样本稀释液和所述的检测试剂卡。
12.所述冠状病毒igm、igg抗体的检测试剂盒，其特征在于：所述的样本稀释液为ph7.0
±
0.2的磷酸盐缓冲液。
13.一种新型冠状病毒igm、igg抗体的试纸条的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1）标记溶液制备：于1000ml沸水中加入10%氯金酸溶液1.0ml，边加边搅拌，充分沸腾10秒钟，加入10%柠檬酸钠溶液1.8ml，维持加热，反应30分钟后停止加热，继续搅拌至室温；2）标记重组新型冠状病毒抗原溶液制备：取100ml标记溶液中逐滴加入0.05m k2co
3 5.0ml（ph约为8.0），充分混匀，逐滴加入0.1mg/ml的重组新型冠状病毒抗原水溶液，充分混匀30min，逐滴加入10% 牛血清蛋白溶液13ml，缓慢搅拌30min，低温高速离心30min，弃上清，沉淀用胶体金稀释液溶解即得；3）标记抗体溶液制备：100ml标记溶液中逐滴加入0.05m k2co
3 5.0ml（ph约为8.0），充分混匀，逐滴加入0.1mg/ml的鸡igy抗体水溶液，充分混匀30min，逐滴加入10% 牛血清蛋白溶液13ml，缓慢搅拌30min，低温高速离心30min，弃上清，沉淀用胶体金稀释液溶解即得；4）抗体包被液配制：于100ml的0.2m ph7.4 磷酸盐缓冲液溶解蔗糖2g，以0.22
µ
m孔径的微孔滤膜滤过，2～8℃保存；5）c、t线包被溶液的配制：用抗体包被液分别稀释羊抗鸡igy抗体、鼠抗人igm抗体、鼠抗人igg至0.3-0.5mg/ml、0.5-0.8mg/ml、0.5-0.8mg/ml；6）玻璃纤维素膜标记：将标记重组新型冠状病毒抗原溶液与标记抗体溶液按照3:1-4:1的比例混合喷至裁剪好的结合垫上，喷液量4-5μl/cm，在37℃烘箱里干燥12-24h；7）硝酸纤维素膜划线处理：用喷金划膜仪在硝酸纤维素膜上均按1μl/cm将c、t线包被溶液划线，划线完成后将nc膜在37℃烘箱里干燥12-24h；8）试纸条制备：在温度18～28℃，湿度小于30%的环境下，取pvc底板，在pvc底板的一面顺次相互搭接地粘附样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；用裁剪机将贴好的pvc底板切成宽度≥2.5mm的试纸条。
14.一种新型冠状病毒igm、igg抗体的试剂卡的制备：取试纸条装入检测卡卡底的卡位处，卡盖的加样孔对准样品垫，观察窗对准检测线及质控线，组装成试剂卡，即可。
15.本发明与现有技术相比具有如下优点：1、诊断快速，10分钟内可完成检测。2、仅需加样一次，即可同时分别检测人体中igm抗体和igg抗体。3、操作简便，不需由专业人员操作。4、血清学检测的血液标本更易获取且标本质量有保证、很大程度上降低了医护人员在标本采集和检测过程中被感染的风险。
附图说明
16.以上所述是对本发明技术方案的概述，为进一步解释本发明，以下结合附图与实施方式对本发明做进一步的详细说明。
17.附图1:本发明一种人新型冠状病毒抗体检测试纸条的结构示意图。
18.附图2:本发明一种人新型冠状病毒抗体检测卡卡盖的结构示意图附图3:本发明一种人新型冠状病毒抗体检测卡卡底的结构示意图附图符号说明：1-igm检测线，2-igg检测线，3-质控线，4-样品垫，5-结合垫，6-硝酸纤
维素膜，7-pvc底板，8-吸水垫，9-加样孔，10-观察窗，11-检测试纸条卡位一端、12-检测试纸条卡位另一端。
具体实施方式
19.实施例1：一种人新型冠状病毒抗体检测试纸条、试剂卡制备及检测方法标记溶液制备：于1000ml沸水中加入10%氯金酸溶液1.0ml，边加边搅拌，充分沸腾10秒钟，加入10%柠檬酸钠溶液1.8ml，维持加热，反应30分钟后停止加热，继续搅拌至室温。
20.标记重组新型冠状病毒抗原溶液制备：取100ml标记溶液中逐滴加入0.05m k2co
3 5.0ml（ph约为8.0），充分混匀，逐滴加入0.1mg/ml的重组新型冠状病毒抗原水溶液，充分混匀30min，逐滴加入10% 牛血清蛋白溶液13ml，缓慢搅拌30min，低温高速离心30min，弃上清，沉淀用胶体金稀释液溶解即得。
21.标记抗体溶液制备：100ml标记溶液中逐滴加入0.05m k2co
3 5.0ml（ph约为8.0），充分混匀，逐滴加入0.1mg/ml的鸡igy抗体水溶液，充分混匀30min，逐滴加入10% 牛血清蛋白溶液13ml，缓慢搅拌30min，低温高速离心30min，弃上清，沉淀用胶体金稀释液溶解即得。
22.抗体包被液配制：于100ml的0.2m ph7.4 磷酸盐缓冲液溶解蔗糖2g，以0.22
µ
m孔径的微孔滤膜过滤，2～8℃保存。
23.c、t线包被溶液的配制：用抗体包被液分别稀释羊抗鸡igy抗体、鼠抗人igm抗体、鼠抗人igg至0.3mg/ml、0.5mg/ml、0.5mg/ml。
24.玻璃纤维素膜标记：将标记重组新型冠状病毒抗原溶液与标记抗体溶液按照3:1的比例混合喷至裁剪好的结合垫上，喷液量5μl/cm，在37℃烘箱里干燥12h。
25.硝酸纤维素膜划线处理：用喷金划膜仪在硝酸纤维素膜上均按1μl/cm将c、t线包被溶液划线，划线完成后将nc膜在37℃烘箱里干燥12h。
26.试剂卡组装：在干燥室内，温度18～28℃，湿度小于30%的环境下，取pvc底板，在pvc底板的一面顺次相互搭接地粘附样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；用裁剪机将贴好的pvc底板切成2.5mm宽的试纸条；再装入检测卡卡底的卡位处，将检测卡卡盖和卡底组装成试剂卡，其中卡盖的加样孔对准样品孔，观察窗对准检测线及质控线。
27.检测方法：1.将待测样本及所需试剂从储存条件下取出，平放；2.在测试前将样本充分混匀，取待测样本（血清、血浆或全血样本）10
µ
l加到检测卡上的样本孔内，立即在样本孔内滴加 2 滴样本稀释液。
28.检测结果：对45份临床确诊新型冠状病毒肺炎患者血清及45份排除新型冠状病毒肺炎患者血清进行检测，结果灵敏度95.56%，特异性97.78%。检测结果表明制备的检测试剂性能良好，有利于快速检出新型冠状病毒感染者。
29.实施例2：一种人新型冠状病毒抗体检测试纸条、试剂卡制备标记溶液制备：于1000ml沸水中加入10%氯金酸溶液1.0ml，边加边搅拌，充分沸腾10秒钟，加入10%柠檬酸钠溶液1.8ml，维持加热，反应30分钟后停止加热，继续搅拌至室温。
30.标记重组新型冠状病毒抗原溶液制备：取100ml标记溶液中逐滴加入0.05m k2co
3 5.0ml（ph约为8.0），充分混匀，逐滴加入0.1mg/ml的重组新型冠状病毒抗原水溶液，充分混匀30min，逐滴加入10% 牛血清蛋白溶液13ml，缓慢搅拌30min，低温高速离心30min，弃上
清，沉淀用胶体金稀释液溶解即得。
31.标记抗体溶液制备：100ml标记溶液中逐滴加入0.05m k2co
3 5.0ml（ph约为8.0），充分混匀，逐滴加入0.1mg/ml的鸡igy抗体水溶液，充分混匀30min，逐滴加入10% 牛血清蛋白溶液13ml，缓慢搅拌30min，低温高速离心30min，弃上清，沉淀用胶体金稀释液溶解即得。
32.抗体包被液配制：于100ml的0.2m ph7.4 磷酸盐缓冲液溶解蔗糖2g，以0.22
µ
m孔径的微孔滤膜过滤，2～8℃保存。
33.c、t线包被溶液的配制：用抗体包被液分别稀释羊抗鸡igy抗体、鼠抗人igm抗体、鼠抗人igg至0.5mg/ml、0.8mg/ml、0.8mg/ml。
34.玻璃纤维素膜标记：将标记重组新型冠状病毒抗原溶液与标记抗体溶液按照4:1的比例混合喷至裁剪好的结合垫上，喷液量4μl/cm，在37℃烘箱里干燥24h。
35.硝酸纤维素膜划线处理：用喷金划膜仪在硝酸纤维素膜上均按1μl/cm将c、t线包被溶液划线，划线完成后将nc膜在37℃烘箱里干燥24h。
36.试剂卡组装：在干燥室内，温度18～28℃，湿度小于30%的环境下，取pvc底板，在pvc底板的一面顺次相互搭接地粘附样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；用裁剪机将贴好的pvc底板切成3mm宽的试纸条；再装入检测卡卡底的卡位处，将检测卡卡盖和卡底组装成试剂卡，其中卡盖的加样孔对准样品孔，观察窗对准检测线及质控线。
37.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。。