一种分子辅助选择提高番鸭黑羽率的育种方法与流程

1.本发明属于家禽种质培育领域，具体地说，涉及一种分子辅助选择提高番鸭黑羽率的育种方法及在黑羽系番鸭核心群选留中的应用。


背景技术：

2.羽色是家禽及鸟类一个重要的质量性状，也是其区分和鉴别的重要特征之一，主要是黑色素和类胡萝卜素交互作用产生的结果。在家禽方面，羽色仅分为有色和无色(白色)2种，其颜色主要由2种黑色素的相对生成量决定，分别是黑色至棕色的真黑色素(或称优黑素)和黄色至红色的伪黑色素(或称褐黑素、脱黑素)。由于黑色素受许多遗传基因控制，并容易受季节变化、性别及地理环境等诸多因素的影响，其羽色变化是十分复杂的过程，是遗传效应和环境效应叠加的产物。
3.番鸭的羽色与品质存在一定的关联，羽色遗传与众多基因关联，且存在多态性，为加快优质家禽的改良育种，质量性状和数量性状的选择都是其主要研究领域，尤其羽色性状选择已成为鸡、鸭等家禽育种的研究重点。黑羽番鸭具有耐旱、省料、适应性强、瘦肉率高、营养丰富、肉质好，肉味鲜美等优点，符合了消费者的需求，养殖前景较好。但目前市场上纯黑色羽毛的番鸭较少，且群体整齐度不高。同时，由于黑羽番鸭羽色遗传的不稳定性，通过常规育种方法不能解决其羽色稳定遗传的问题，后代主要会出现白羽、黑羽和花羽3种羽色，这严重影响了外观品质的均一性和产品推广的同质性。为此，本专利通过进行番鸭深度测序，开展番鸭羽色遗传研究，挖掘可快速提升番鸭黑羽率的分子辅助选育技术，加快黑羽番鸭育种进展。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提出了一种在高通量测序基础上发掘与番鸭羽色性状相关的基因，并最终建立了以hist2h3d、myot为分子辅助选育基因的快速羽色鉴定方法。
5.本发明的技术方案是：
6.采集黑羽及白羽不同发育日龄的毛囊组织样本，提取rna，逆转录成cdna，并构建cdna文库。
7.进一步地，经illumina测序，利用高通量芯片筛选，获得差异表达基因序列；设置不同宽容度的筛选条件，获得差异表达基因。
8.进一步地，对上述筛选得到的表达量差异最大的基因序列进行聚类分析，筛选在黑色与白色/杂色番鸭中差异表达显著的基因。
9.进一步地，对上述筛选得到的表达量差异最大的基因序列进行go分类富集，分析这些差异表达基因主要涉及的生物过程、细胞组分或分子功能。
10.进一步地，通过生物信息学比较分析，最终确定与番鸭羽毛颜色相关的基因。
11.进一步地，基于上述确定的差异表达基因，分别挑选黑羽番鸭毛囊组织中若干低表达(hist2h3d、col3a1、fndc1、adamts12、sphkap)及高表达(myot、nt5dc1、mb)的基因，设
1motif 12)、sphkap(sphk1 interactor,akap domain containing)，3个高表达基因myot(myotilin)、nt5dc1(5,
‑
nucleotidase domain containing 1)、mb(myoglobin)分别设计实时荧光定量引物，引物如下表。
[0029][0030][0031]
(7)以β
‑
actin为内参，分别对不同羽色番鸭毛囊组织中目标基因的表达进行测定，具体pcr反应条件为：预变性95℃5min；变性95℃15s，退火60℃20s，延伸72℃40s，共40个循环。
[0032]
(8)选取黑羽番鸭中表达量上调或下调2倍的hist2h3d、adamts12、sphkap、myot以及mb等5个差异基因作为主要的番鸭羽色遗传标记基因，开展其稳定性及可靠性的鉴定。
[0033]
二、番鸭羽色遗传标记相关基因可靠性及稳定性验证
[0034]
随机选取不同羽色的番鸭各三只，取毛囊组织进行rna提取及逆转录，获得cdna用于实时荧光定量检测，荧光定量组分及程序如下表。
[0035][0036][0037]
检测结果，如下表。
[0038]
相关基因基因类型样本数(只)黑羽番鸭白羽番鸭hist2h3d低表达312.63
±
0.31col3a1低表达311.44
±
0.24fndc1低表达311.40
±
0.18adamts12低表达312.12
±
0.25sphkap低表达312.16
±
0.24myot高表达310.30
±
0.03nt5dc1高表达310.53
±
0.06mb高表达310.44
±
0.10
[0039]
mrna表达定量验证结果与高通量测序结果相吻合，为了进一步提高准确度，我们选取差异表达大于2倍的基因，包括hist2h3d、adamts12、sphkap、myot以及mb的5个差异基因作为主要的番鸭羽色遗传标记基因，开展基于羽色表达的分子辅助选育研究。
[0040]
三、基于羽色表达相关基因的番鸭黑羽系核心群体种质筛选
[0041]
在常规选育的基础上，分别选取120日龄和300日龄纯黑羽番鸭和白羽番鸭各30只，采集毛囊组织，检测hist2h3d、adamts12、sphkap、myot以及mb等5个差异基因的mrna相对表达情况。
[0042][0043]
由上表可知，上述5个差异基因在120日龄和300日龄中存在较为明显的差异表达，其中hist2h3d、myot表达较为稳定，故提出以hist2h3d、myot为羽色表达的主要候选基因。在此基础上，对番鸭黑羽系核心群进行了系统性候选基因的表达检测，并制定了较为详细的选留方案。具体如下：
[0044]
检测基因：hist2h3d、myot
[0045]
选留群体：黑羽系番鸭核心群
[0046]
选留时期：28日龄(正羽出现，采集毛囊组织样)
[0047]
选留方法：公番鸭选留hist2h3d表达最低的占总数10％
‑
20％同时兼顾myot表达最高的占总数10％
‑
20％的番鸭；母番鸭则选留hist2h3d表达最低的占总数40％
‑
45％同时兼顾myot表达最高的占总数40％
‑
45％的番鸭。
[0048]
早期选育结果
[0049][0050]
备注：120日龄前公番鸭死亡1只，母番鸭死亡6只；120日龄至300日龄母番鸭死亡1只。
[0051]
进入连续4个世代选育的黑羽系番鸭核心群采用传统的外貌特征进行羽色选留，其120日龄的黑羽率(全身为黑羽，下同)为78.8％(主要集中在颈部、尾部、翅部出现白羽)，300日龄的黑羽率为59.6％(发生较为明显的羽色变白现象，主要集中于产蛋期)。
[0052]
而经过早期选育后，黑羽系番鸭核心群120日龄的黑羽率达到了88.4％，300日龄的黑羽率达到了77.9％。且对选留下来的113只黑羽番鸭群体(公番鸭17只，母番鸭96只)进行后代留种，发现出雏后的番鸭黑羽率达到了95.5％(之前仅为87.8％)，其选育效果明显。
[0053]
综上所述，以hist2h3d、myot为羽色遗传的分子辅助选育基因，在4周龄末开展hist2h3d、myot的选留，可明显加快番鸭黑羽率的选育工作，降低非目标个体的饲养量时
间，节省育种费用，该方法具有较明显的番鸭羽色选育应用价值。