一种全血法鉴定鸡玫瑰冠基因型的引物、试剂盒及应用的制作方法

1.本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种全血法鉴定鸡玫瑰冠基因型的引物、试剂盒及应用。


背景技术：

2.鸡中最为常见的冠型为单冠，该性状主要是受遗传控制，一般在鸡品种间单冠的大小变异较丰富,而品种内较一致。突变的鸡冠性状包括玫瑰冠、豆冠、核桃冠、蔷薇冠、豌豆冠、多冠和无冠等,其中不同突变型内又分为若干表型。
3.玫瑰冠性状对单冠为常染色体显性遗传，且玫瑰冠性状纯合子个体精液质量差(混合输精时，纯合子个体的精液基本上无法和杂合子个体竞争)，导致生产中无法仅仅通过外观的选淘彻底将该性状提纯。
4.目前将玫瑰冠性状在群体中提纯的办法有两种：一是通过传统的测交手段，二是通过已有的分子手段。传统的测交手段涉及的工作步骤繁琐，周期长，过程中容易出错。目前已有的分子手段，其过程均涉及dna抽提、pcr扩增、凝胶电泳等步骤，需要专业仪器(离心机、pcr仪、电泳仪、凝胶成像系统等)协助的完成，而且还需要具有一定专业水平的技术人员，才能更好的进行操作，在育种企业中一般不易实施。因此，需要一种简单易操作，且准确率高的检测手段用于玫瑰冠基因型的鉴别。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种全血法鉴定鸡玫瑰冠基因型的引物、试剂盒及应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用该引物对全血模板进行恒温扩增，通过观察扩增体系的颜色就能准确判断玫瑰冠个体基因型，该方法操作简单、准确率高，易于推广。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种全血法鉴定鸡玫瑰冠基因型的引物，包括：
8.rose
‑
f3：ccagcattccctgtgacc；
9.rose
‑
b3：tacaaacccgaccccaaaga；
10.rose
‑
fip：acattcccaggccacgcagctgctctgggacgcaaat；
11.rose
‑
bip：attgcttcaggaaggggcaggcactcagcaaacaggaacaga。
12.本发明还提供一种全血法鉴定鸡玫瑰冠基因型的试剂盒，包含所述的引物。
13.本发明还提供一种全血法鉴定鸡玫瑰冠基因型的方法，包括以下步骤：
14.以鸡全血为模板，利用权利要求1所述的引物进行pcr扩增反应，然后再观察扩增产物的颜色进行辨别，若扩增产物为天蓝色则为单冠或玫瑰冠杂合子，若扩增产物为淡紫色则为玫瑰冠纯合子。
15.优选的是，扩增反应体系为：2
×
反应缓冲液12.5μl、rose
‑
f3和rose
‑
b3引物各1μl、rose
‑
fip和rose
‑
bip引物各1μl、bstdna聚合酶1μl、羟基萘酚蓝1μl、模板2μl，去离子水补充至25μl。
16.优选的是，扩增条件为：将配制好的扩增反应体系放置于恒温板中，64℃反应60分钟。
17.本发明还提供所述的引物或者所述的试剂盒在鉴定鸡玫瑰冠基因型中的应用。
18.本发明公开了以下技术效果：
19.本发明是以经简单处理的抗凝血样本为模板，利用本发明公开的引物通过pcr技术恒温扩增就能鉴定特定基因组位置的基因差异，进而就能准确鉴定玫瑰冠基因座的基因型。该方法仅用水浴锅或者恒温板，也不需要专业技术人员就能进行实验操作，然后通过肉眼最终观察到的扩增体系颜色，就能判断玫瑰冠个体基因型，这对于通过玫瑰冠基因型选淘玫瑰冠性状纯合子个体具有重要意义。可见，本发明公开的鉴别方法无需dna抽提过程、无需专业的设备、无需专业的人员等，操作简单，易于推广，并且对于育种选育提供理论依据和数据支持。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1为本发明实施例2扩增结果示意图；左边起前3个单冠白耳黄鸡，之后的6个为玫瑰冠纯合子丝羽乌骨鸡，最后一个为阴性对照。
具体实施方式
22.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
23.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
24.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
25.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
26.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
27.实施例1一种全血法鉴定鸡玫瑰冠基因型的方法
28.本实施例在于提供一种分子检测方法，利用经过简单处理的抗凝血为模板，通过常温pcr的方法来鉴定特定基因组位置的基因差异，进而鉴定玫瑰冠基因座的基因型。具体包括以下方法步骤：
29.步骤1：模板准备
30.(1)血样采集。翅下静脉采集被检鸡个体的血液约0.5ml，置于装有70μl 2％edta抗凝剂的离心管中。
31.(2)血样处理(100倍稀释)。抽取1μl的抗凝血，置于装有99μl te的离心管中，反复冻融。
32.步骤2：pcr扩增与目的位点分型
33.(1)以经过步骤1处理的抗凝血为模板，利用如表1所示的引物进行pcr扩增。
34.表1扩增引物
[0035][0036][0037]
扩增反应体系如表2所示。
[0038]
表2扩增反应体系
[0039][0040]
(2)恒温扩增。将配制好的扩增反应体系放置于恒温板中，64℃反应60分钟。
[0041]
(3)结果判定。自然光下，若扩增体系为天蓝色，则是携带野生型等位基因的个体(杂合子)；若扩增体系为淡紫色，则是玫瑰冠纯合子。
[0042]
实施例2验证引物的扩增效率以及特异性
[0043]
1、实验材料
[0044]
选取单冠的白耳黄鸡3只以及已知是玫瑰冠纯合子的丝羽乌骨鸡6只。
[0045]
2、实验方法
[0046]
步骤1：模板准备
[0047]
(1)血样采集。翅下静脉采集上述白耳黄鸡和丝羽乌骨鸡的血液约0.5ml，置于装有70μl 2％edta抗凝剂的离心管中。
[0048]
(2)血样处理(100倍稀释)。抽取1μl的抗凝血，置于装有99μl te的离心管中，反复冻融。
[0049]
步骤2：pcr扩增
[0050]
(1)以步骤1处理的抗凝血为模板，利用实施例1中表1所示的引物，以及表3所示的扩增反应体系进行pcr扩增。
[0051]
表3扩增反应体系
[0052][0053]
(2)恒温扩增。同实施例1的恒温扩增条件。
[0054]
(3)结果判定。自然光下，天蓝色为单冠的白耳黄鸡，淡紫色为玫瑰冠纯合子丝羽乌骨鸡(图1)。
[0055]
上述结果表明，通过该方法可准确的将单冠性状个体与玫瑰冠纯合子个体区分开来。
[0056]
实施例3单盲检测判定方法的可靠性
[0057]
本实施例采用单盲的方式，对已知基因型样本进行分型。试验材料选取通过测交确定的12只玫瑰冠杂合子丝羽乌骨鸡个体(rr)和12只玫瑰冠纯合子丝羽乌骨鸡个体(rr)。具体判定方法如下：
[0058]
步骤1：模板准备
[0059]
(1)血样采集。翅下静脉采集被检个体的血液约0.5ml，置于装有70μl 2％edta抗凝剂的离心管中。
[0060]
(2)血样处理(100倍稀释)。抽取1μl的抗凝血，置于装有99μl te的离心管中，反复冻融。
[0061]
步骤2：pcr扩增
[0062]
(1)以按照步骤1处理后的抗凝血为模板，利用如实施例1表1所示的引物，以及如表4所示的扩增体系进行pcr扩增。
[0063]
表4扩增反应体系
[0064][0065]
(2)恒温扩增。同实施例1的恒温扩增条件。
[0066]
步骤3：结果判定
[0067]
根据pcr扩增体系颜色判定基因型。将天蓝色个体判定为玫瑰冠杂合子个体(rr)，紫色判定为纯合子(rr)。判定结果见表5。
[0068]
表5分子检测鉴定丝羽乌骨鸡玫瑰冠基因型
[0069][0070][0071]
注：“ab”表示被检个体为玫瑰冠杂合子；
[0072]“aa”表示被检个体为玫瑰冠纯合子。
[0073]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。