一种用于鹅性别鉴定的PCR引物、试剂盒及其方法与流程

一种用于鹅性别鉴定的pcr引物、试剂盒及其方法
1.本技术为申请日为2021年01月28日，申请号为202110120742.8，发明名称为一种用于家禽性别鉴定的pcr引物、试剂盒及其方法的中国发明专利的分案申请。
技术领域
2.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于鹅性别鉴定的pcr引物、试剂盒及其方法。


背景技术：

3.商业化家禽品种大都是以配套系模式生产的，父系一般生长速度较快，母系一般繁殖效率较高，因此都需要早期进行性别鉴定，父系要提前淘汰母雏，母系要提前淘汰公雏。肉用型家禽的公禽一般生长速度较快，公母分群饲养，养殖效益会更好。蛋用型家禽出雏时只保留母雏，公雏直接淘汰。因此家禽早期性别鉴定在生产中具有重要的意义。
4.目前家禽早期的性别鉴定除了伴性遗传(金银色羽、横斑羽、快慢羽)等方法外，主要通过翻肛观察生殖突起进行鉴别。但翻肛鉴别须在雏禽出生24小时内进行，超过这个时间段，雏禽肛门难以翻开，生殖突起萎缩甚至陷入泄殖腔深处，不便观察翻肛鉴别劳动强度大、工作环境差、专业性高，误鉴率也较高。
5.因此，需要开发一种简单方便，能够快速、准确鉴别家禽性别的方法。


技术实现要素：

6.本发明目的在于解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种设计合理，可用于家禽早期性别快速鉴定的pcr引物。
7.本发明通过以下技术方案实现本发明的目的：
8.本发明目的之一在于提供一种性别鉴定用pcr引物，所述引物序列如seq id no.1/seq id no.2所示。即所述引物的核苷酸序列为：
9.正向引物(seq id no.1)：5'
‑
atgaaagagtttcagcacttga
‑
3'；
10.反向引物(seq id no.2)：5'
‑
ttcataataggagctcgagcca
‑
3'。
11.本发明目的之二在于提供包含本发明所述的性别鉴定用pcr引物的试剂盒。
12.在本发明的一种实施例中，本发明所述的试剂盒包含本发明所述的pcr引物、pcr反应液，在一些实施例中，还可以包含dna提取液。
13.本发明目的之三在于提供本发明所述的pcr引物或本发明所述的试剂盒在养殖业中的应用。
14.本发明目的之四在于提供本发明所述的pcr引物或本发明所述的试剂盒在鸭性别鉴定中的应用。
15.本发明所述的在鸭性别鉴定中的应用，通过本发明所述的引物进行pcr扩增，电泳结果呈现1147bp一条带的为公鸭，呈现1147bp和851bp的两条带时为母鸭。
16.本发明目的之五在于提供本发明所述的pcr引物或本发明所述的试剂盒在鸡性别
鉴定中的应用。
17.本发明所述的在鸡性别鉴定中的应用，通过本发明所述的引物进行pcr扩增，电泳结果呈现983bp一条带的为公鸡，呈现983bp和798bp的两条带时为母鸡。
18.本发明目的之六在于提供本发明所述的pcr引物或本发明所述的试剂盒在鸽性别鉴定中的应用。
19.本发明所述的在鸽性别鉴定中的应用，通过本发明所述的引物进行pcr扩增，电泳结果呈现937bp一条带的为公鸽，呈现937bp和1153bp的两条带时为母鸽。
20.本发明目的之七在于提供本发明所述的pcr引物或本发明所述的试剂盒在番鸭性别鉴定中的应用。
21.本发明所述的在番鸭性别鉴定中的应用，通过本发明所述的引物进行pcr扩增，电泳结果呈现1153bp一条带的为公番鸭，呈现1153bp和832bp的两条带时为母番鸭。
22.本发明目的之八在于提供本发明所述的pcr引物或本发明所述的试剂盒在鹅性别鉴定中的应用。
23.本发明所述的在鹅性别鉴定中的应用，，电泳结果呈现1145bp一条带的为公鹅，呈现1145bp和833bp的两条带时为母鹅。
24.本发明目的之九在于提供本发明所述的pcr引物或本发明所述的试剂盒在鹌鹑性别鉴定中的应用。
25.本发明所述的在鹌鹑性别鉴定中的应用，电泳结果呈现1068bp一条带的为公鹌鹑，呈现1068bp和791bp的两条带时为母鹌鹑。
26.本发明还提供一种鸭、鸡、鸽、番鸭、鹅或鹌鹑性别快速鉴定方法，包括以下步骤：
27.1)提取待测家禽的基因组dna；
28.2)以步骤1)中提取的dna为模板，利用本发明所述引物对，进行pcr扩增反应；
29.3)pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，
30.当待测家禽为鸭时，电泳结果呈现1147bp一条带的为公鸭公鸡，呈现1147bp和851bp的两条带时为母鸭；
31.当待测家禽为鸡时，电泳结果呈现983bp一条带的为公鸡，呈现983bp和798bp的两条带时为母鸡；
32.当待测家禽为鸽时，电泳结果呈现937bp一条带的为公鸽，呈现937bp和1153bp的两条带时为母鸽；
33.当待测家禽为番鸭时，电泳结果pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果呈现1153bp一条带的为公番鸭，呈现1153bp和832bp的两条带时为母番鸭；
34.当待测家禽为鹅时，电泳结果呈现1145bp一条带的为公鹅，呈现1145bp和833bp的两条带时为母鹅；
35.当待测家禽为鹌鹑时，电泳结果呈现1068bp一条带的为公鹌鹑，呈现1068bp和791bp的两条带时为母鹌鹑。
36.本发明所述的方法，步骤1)提取待测家禽的基因组dna可以按照本领域常规方法提取，例如可以选用包括但不限于羽毛、血液、组织、器官等进行待测家禽的基因组dna的提取。
37.本发明所述的方法，步骤2)中pcr反应体系可以为本领域的常规体系，在本发明的
一种具体的实施方式中，为：2
×
pcr mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μl，10μmol/l正向和反向引物各1μl，50
‑
100μg/ml模板dna2μl，超纯水21μl。
38.本发明所述的方法，步骤2)中pcr反应程序可以为本领域的常规体系，在本发明的一种具体的实施方式中，为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
39.本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明通过设计的pcr引物，进行pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳，利用电泳结果的条带数来确定家禽的性别，具有操作简单方便，鉴别结果快速准确，便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景，此外，基于本发明方法开发的检测试剂盒，可产生可观的经济效益和良好的社会价值。
40.本发明的引物对家禽品种限制性小，因此对于所述的本发明所述的鸭、鸡、鸽、番鸭、鹅或鹌鹑没有具体品种的限制，其中，本发明中所述的“鸭”是指鸭科鸭属绿头鸭种，所述的“番鸭”又称洋鸭，是鸭科、栖鸭属疣鼻栖鸭。
附图说明
41.图1为本发明实施例1鸭的pcr扩增产物的电泳图谱。
42.图2为本发明实施例2鸭的pcr扩增产物的电泳图谱。
43.图3为本发明实施例3鸡的pcr扩增产物的电泳图谱。
44.图4为本发明实施例4鸡的pcr扩增产物的电泳图谱。
45.图5为本发明实施例6鸽子的pcr扩增产物的电泳图谱。
46.图6为本发明实施例7鸽子的pcr扩增产物的电泳图谱。
47.图7为本发明实施例8番鸭的pcr扩增产物的电泳图谱。
48.图8为本发明实施例9番鸭的pcr扩增产物的电泳图谱。
49.图9为本发明实施例10鹅的pcr扩增产物的电泳图谱。
50.图10为本发明实施例11鹅的pcr扩增产物的电泳图谱。
51.图11为本发明实施例12鹌鹑的pcr扩增产物的电泳图谱。
52.图12为本发明实施例13鹌鹑的pcr扩增产物的电泳图谱。
具体实施方式
53.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
54.实施例1
55.1已知性别鸭鉴定
56.1.1样品采集
57.采集10只已知性别的成年北京鸭，编号1
‑
5为公鸭，6
‑
10为母鸭，使用本发明设计引物扩增鸭基因组。
58.正向引物(seq id no.1)：5'
‑
atgaaagagtttcagcacttga
‑
3'；
59.反向引物(seq id no.2)：5'
‑
ttcataataggagctcgagcca
‑
3'。
60.1.2 pcr扩增
61.pcr反应体系为：
[0062]2×
pcr mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μl，10μmol/l正方向引物各1μl，50
‑
100μg/ml模板dna 2μl，超纯水21μl。
[0063]
pcr反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
[0064]
1.3电泳检测
[0065]
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸭电泳检测只有一条1147bp的条带，母鸭电泳检测时有1147bp和851bp的两条带，见结果如图1(其中1～5为公鸭，6～10为母鸭)。
[0066]
以上结果表明本发明能够快速准确对鸭进行性别鉴定，并且简单易于操作。
[0067]
实施例2
[0068]
2未知性别鸭鉴定
[0069]
2.1样品采集
[0070]
采集16只未知性别的绍兴鸭雏鸭，使用本发明设计引物(seq id no.1)和(seq id no.2)扩增鸭基因组。
[0071]
2.2 pcr扩增
[0072]
pcr反应体系为：
[0073]2×
pcr mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μl，10μmol/l正方向引物各1μl，50
‑
100μg/ml模板dna 2μl，超纯水21μl。
[0074]
pcr反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
[0075]
2.3电泳检测
[0076]
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸭电泳检测只有一条1147bp的条带，母鸭电泳检测时有1147bp和851bp的两条带，见结果如图2(其中3、4、6、7、11、12、15、16为公鸭，1、2、5、8、9、10、13、14为母鸭)。
[0077]
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
[0078]
实施例3
[0079]
1已知性别鸡鉴定
[0080]
1.1样品采集
[0081]
采集8只已知性别的成年崇仁麻鸡，编号1
‑
4为公鸡，5
‑
8为母鸡，使用本发明设计引物扩增鸡基因组。
[0082]
正向引物(seq id no.1)：5'
‑
atgaaagagtttcagcacttga
‑
3'；
[0083]
反向引物(seq id no.2)：5'
‑
ttcataataggagctcgagcca
‑
3'。
[0084]
1.2 pcr扩增
[0085]
pcr反应体系为：
[0086]2×
pcr mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μl，10μmol/l正方向引物各1μl，50
‑
100μg/ml模板dna 2μl，超纯水21μl。
[0087]
pcr反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
[0088]
1.3电泳检测
[0089]
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸡电泳检测只有一条983bp的条带，母鸡电泳检测时有983bp和798bp的两条带，见结果如图3(其中1～4为公鸡，5～8为母鸡)。
[0090]
以上结果表明本发明能够快速准确对鸡进行性别鉴定，并且简单易于操作。
[0091]
实施例4
[0092]
2未知性别鸡鉴定
[0093]
2.1样品采集
[0094]
采集24只未知性别的隐性白鸡的雏鸡，使用本发明设计引物(seq id no.1)和(seq id no.2)扩增鸡基因组。
[0095]
2.2 pcr扩增
[0096]
pcr反应体系为：
[0097]2×
pcr mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μl，10μmol/l正方向引物各1μl，50
‑
100μg/ml模板dna 2μl，超纯水21μl。
[0098]
pcr反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
[0099]
2.3电泳检测
[0100]
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸡电泳检测只有一条983bp的条带，母鸡电泳检测时有983bp和798bp的两条带，见结果如图4(其中1、4、5、7、8、9、12、14、17、20、21、22为公鸡，2、3、6、10、11、13、15、16、18、19、23、24为母鸡)。
[0101]
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
[0102]
实施例5
[0103]
3资源保护应用
[0104]
3.1将本单位地方鸡血液样本基因库中的大骨鸡、白耳黄鸡、河南斗鸡、北京油鸡、仙居鸡、茶花鸡、丝羽乌骨鸡、狼山鸡、藏鸡、清远麻鸡、瓦灰鸡、金湖乌凤鸡、茶花鸡、寿光鸡、鹿苑鸡、东乡黑鸡、边鸡、文昌鸡、固始鸡等19个品种使用本发明设计引物(seq id no.1)和(seq id no.2)扩增鸡基因组。
[0105]
3.2 pcr扩增
[0106]
pcr反应体系为：
[0107]2×
pcr mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μl，10μmol/l正方向引物各1μl，50
‑
100μg/ml模板dna 2μl，超纯水21μl。
[0108]
pcr反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
[0109]
3.3电泳检测
[0110]
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸡电泳检测只有一条983bp的条带，母鸡电泳检测时有983bp和798bp的两条带，鉴定结果与个体性别记录的结果一致，见表1。
[0111]
表1 19个不同鸡地方品种检测结果
[0112][0113][0114]
实施例6
[0115]
1已知性别白羽王鸽鉴定
[0116]
1.1样品采集
[0117]
采集8只已知性别的成年白羽王鸽，编号1
‑
4为公鸽，5
‑
8为母鸽，使用本发明设计引物扩增鸽基因组。
[0118]
正向引物(seq id no.1)：5'
‑
atgaaagagtttcagcacttga
‑
3'；
[0119]
反向引物(seq id no.2)：5'
‑
ttcataataggagctcgagcca
‑
3'。
[0120]
1.2 pcr扩增
[0121]
pcr反应体系为：
[0122]2×
pcr mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μl，10μmol/l正方向引物各1μl，50
‑
100μg/ml模板dna 2μl，超纯水21μl。
[0123]
pcr反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
[0124]
1.3电泳检测
[0125]
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸽电泳检测只有一条937bp的条带，母鸽电泳检测时有937bp和1153bp的两条带，见结果如图5(其中1～4为公鸽，5～8为母鸽)。
[0126]
以上结果表明本发明能够快速准确对鸽进行性别鉴定，并且简单易于操作。
[0127]
实施例7
[0128]
2未知性别欧洲肉鸽鉴定
[0129]
2.1样品采集
[0130]
采集17只未知性别的欧洲肉鸽的雏鸽，使用本发明设计引物(seq id no.1)和(seq id no.2)扩增鸽基因组。
[0131]
2.2 pcr扩增
[0132]
pcr反应体系为：
[0133]2×
pcr mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μl，10μmol/l正方向引物各1μl，50
‑
100μg/ml模板dna 2μl，超纯水21μl。
[0134]
pcr反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
[0135]
2.3电泳检测
[0136]
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸽电泳检测只有一条937bp的条带，母鸽电泳检测时有937bp和1153bp的两条带，见结果如图6(其中1、2、4、7、8、12、14、15为公鸽，3、5、6、9、10、11、13、16、17为母鸽)。
[0137]
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
[0138]
实施例8
[0139]
1已知性别白羽番鸭鉴定
[0140]
1.1样品采集
[0141]
采集10只已知性别的成年白羽番鸭，编号1
‑
5为公番鸭，6
‑
10为母番鸭，使用本发明设计引物扩增番鸭基因组。
[0142]
正向引物(seq id no.1)：5'
‑
atgaaagagtttcagcacttga
‑
3'；
[0143]
反向引物(seq id no.2)：5'
‑
ttcataataggagctcgagcca
‑
3'。
[0144]
1.2 pcr扩增
[0145]
pcr反应体系为：
[0146]2×
pcr mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μl，10μmol/l正方向引物各1μl，50
‑
100μg/ml模板dna2μl，超纯水21μl。
[0147]
pcr反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
[0148]
1.3电泳检测
[0149]
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公番鸭电泳检测只有一条1153bp的条带，母番鸭电泳检测时有1153bp和832bp的两条带，见结果如图7(其中1～5为公番鸭，6～10为母番鸭)。
[0150]
以上结果表明本发明能够快速准确对番鸭进行性别鉴定，并且简单易于操作。
[0151]
实施例9
[0152]
2未知性别黑羽番鸭鉴定
[0153]
2.1样品采集
[0154]
采集17只未知性别的黑羽番鸭雏番鸭，使用本发明设计引物(seq id no.1)和(seq id no.2)扩增番鸭基因组。
[0155]
2.2 pcr扩增
[0156]
pcr反应体系为：
[0157]2×
pcr mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μl，10μmol/l正方向引物各1μl，50
‑
100μg/ml模板dna 2μl，超纯水21μl。
[0158]
pcr反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
[0159]
2.3电泳检测
[0160]
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公番鸭电泳检测只有一条1153bp的条带，母番鸭电泳检测时有1153bp和832bp的两条带，见结果如图8(其中2、3、5、7、10、11、13、14、17为公番鸭，1、4、6、8、9、12、15、16为母番鸭)。
[0161]
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
[0162]
实施例10
[0163]
1已知性别扬州鹅鉴定
[0164]
1.1样品采集
[0165]
采集10只已知性别的成年扬州鹅，编号1
‑
5为公鹅，6
‑
10为母鹅，使用本发明设计引物扩增鹅基因组。
[0166]
正向引物(seq id no.1)：5'
‑
atgaaagagtttcagcacttga
‑
3'；
[0167]
反向引物(seq id no.2)：5'
‑
ttcataataggagctcgagcca
‑
3'。
[0168]
1.2 pcr扩增
[0169]
pcr反应体系为：
[0170]2×
pcr mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μl，10μmol/l正方向引物各1μl，50
‑
100μg/ml模板dna 2μl，超纯水21μl。
[0171]
pcr反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
[0172]
1.3电泳检测
[0173]
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鹅电泳检测只有一条1145bp的条带，母鹅电泳检测时有1145bp和833bp的两条带，见结果如图9(其中1～5为公鹅，6～10为母鹅)。
[0174]
以上结果表明本发明能够快速准确对鹅进行性别鉴定，并且简单易于操作。
[0175]
实施例11
[0176]
2未知性别莱茵鹅鉴定
[0177]
2.1样品采集
[0178]
采集17只未知性别的莱茵鹅雏鹅，使用本发明设计引物(seq id no.1)和(seq id no.2)扩增鹅基因组。
[0179]
2.2 pcr扩增
[0180]
pcr反应体系为：
[0181]2×
pcr mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μl，10μmol/l正方向引物各1μl，50
‑
100μg/ml模板dna 2μl，超纯水21μl。
[0182]
pcr反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
[0183]
2.3电泳检测
[0184]
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鹅电泳检测只有一条1145bp的条带，母鹅电泳检测时有1145bp和833bp的两条带，见结果如图10(其中1、4、7、8、11、13、15、16为公鹅，2、3、5、6、9、10、12、14、17为母鹅)。
[0185]
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
[0186]
实施例12
[0187]
1已知性别日本鹌鹑鉴定
[0188]
1.1样品采集
[0189]
采集8只已知性别的成年日本鹌鹑，编号1
‑
4为公鹌鹑，5
‑
8为母鹌鹑，使用本发明设计引物扩增鹌鹑基因组。
[0190]
正向引物(seq id no.1)：5'
‑
atgaaagagtttcagcacttga
‑
3'；
[0191]
反向引物(seq id no.2)：5'
‑
ttcataataggagctcgagcca
‑
3'。
[0192]
1.2 pcr扩增
[0193]
pcr反应体系为：
[0194]2×
pcr mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μl，10μmol/l正方向引物各1μl，50
‑
100μg/ml模板dna 2μl，超纯水21μl。
[0195]
pcr反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
[0196]
1.3电泳检测
[0197]
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鹌鹑电泳检测只有一条1068bp的条带，母鹌鹑电泳检测时有1068bp和791bp的两条带，见结果如图11(其中1～4为公鹌鹑，5～8为母鹌鹑)。
[0198]
以上结果表明本发明能够快速准确对鹌鹑进行性别鉴定，并且简单易于操作。
[0199]
实施例13
[0200]
2未知性别中国白羽鹌鹑鉴定
[0201]
2.1样品采集
[0202]
采集17只未知性别的中国白羽鹌鹑雏鹌鹑，使用本发明设计引物(seq id no.1)和(seq id no.2)扩增鹌鹑基因组。
[0203]
2.2 pcr扩增
[0204]
pcr反应体系为：
[0205]2×
pcr mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μl，10μmol/l正方向引物各1μl，50
‑
100μg/ml模板dna 2μl，超纯水21μl。
[0206]
pcr反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
[0207]
2.3电泳检测
[0208]
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鹌鹑电泳检测只有一条1068bp的条带，母鹌鹑电泳检测时有1068bp和791bp的两条带，见结果如图12(其中3、5、6、9、10、11、13、16为公鹌鹑，1、2、4、7、8、12、14、15、17为母鹌鹑)。
[0209]
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。