一种微通道辅助高通量试剂定量分配及分析的芯片的制作方法

1.本发明属于微流控技术领域，更具体地，涉及一种微通道辅助高通量试剂定量分配及分析的芯片，是一种可应用于液态试剂或液态样本高通量定量分配及分析的芯片。


背景技术：

2.微流控技术作为一种新兴的科学技术，已经应用于化学、生物学、工程学和物理学等诸多领域，学科交叉性强，在时间、空间和分析对象的精密操控上进行了突破，能够解决生命分析的许多关键问题。微流控技术能够将原本只能在实验室才能完成的检测实验集成到一小块芯片上，不仅节约了耗材成本和时间成本，更重要的是能够集成多种检测技术于一体，提高检测效率。
3.随着微流控技术的不断发展，其在分析检测领域的优势越来越明显，不仅可以缩小试剂的损耗，同时微尺度下的微反应器更加有利于各种生化反应的进行。首先无论是保证各种反应的正常进行，还是对物质的浓度进行检测分析，我们都需要先对所需的各种反应试剂进行定量添加及混合，一般在实验室通过移液枪、滴管、量筒和移液管等工具，利用手工实现液体的定量分配及混合，但是这样通量不高，人为误差大，操作繁琐，因此许多研究者就借助微流控芯片技术的优势，设计了多种可以对液体进行自动定量分配的微流控芯片。但是目前大部分微流控芯片只能完成单一液体的定量或芯片结构相对复杂，或所利用原理设计较难实现。例如，2012年的授权专利cn101486004b，其巧妙地利用了微尺度下互不相容液体的流体剪切力的优势，但是只能完成单一液样的定量分配，同时2019年公布的专利申请号cn109806920a与其设计的原理及概念相类似，但是也只能完成单样本的定量分配；为了提高芯片内定量分配的通量，2020年授权专利cn108855254b提供了一种圆盘式芯片，芯片具有两层，定量混合时需要将两层芯片进行相对运动，虽然可以完成高通量的定量分配，但是相对运动导致其加工工艺及液体的密封会有所影响，同时仍然只能完成单一样本的定量分配。同时，2015年授权专利cn102989533b，同样设计了一种圆盘式芯片，巧妙地借助具有真空负压保留的pdms材料作为流体驱动力，提供负压吸附，可以完成两种样本的定量分配，但是需要精确地控制气压及阀门的控制，同时需要对pdms芯片层进行提前处理。但是，随着随时科学的不断发展，每个生化反应及物质浓度分析所涉及的反应试剂种类也会增加，因此，一种加工便捷，结构简单，可应用于多种试剂高通量定量分配分析的微流控芯片是这一分析领域所迫切需要的。


技术实现要素：

4.针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种微通道辅助高通量试剂定量分配及分析的芯片，其中通过设置疏水性微通道，利用它对试剂或样本的阻力作用，通过不同转速所对应的离心力是否能够克服这一阻力作用的作用机制，如此通过旋转转速即可控制疏水性微通道对试剂或样本的导通与否，配合沿液体分配引流通道外侧壁上容积大小预先设定的定量腔室、及反应腔的设计，无需在芯片上集成大量阀控，即可完
成试剂(或样本)的高通量定量分配及混合，能够有效解决现有技术中难于实现多种试剂(或样本)的同时定量分配、集成阀门过多导致芯片加工工艺复杂及芯片层数过多导致芯片键合困难，稳定性差等问题。
5.为实现上述目的，按照本发明提供了一种微通道辅助的用于试剂定量分配及分析的芯片，其特征在于，该芯片设置有旋转中心，内部具有一个或多个检测单元；所述检测单元包括相对于旋转中心自内而外设置的至少1条试剂定量分配通道；
6.其中，每一条试剂定量分配通道包括1条呈弧线形的液体分配引流通道(3，23)，用于对待定量分配的试剂或样本进行定量分配；
7.沿预先设定的旋转方向，将该液体分配引流通道(3，23)两端分别记为首端和尾端，则自首端向尾端，所述液体分配引流通道(3，23)距离所述旋转中心的距离保持不变或逐渐增大，所述首端与试剂存储腔室(1，21)相连，该试剂存储腔室(1，21)用于存储待定量分配的液态试剂或液态样本；
8.所述液体分配引流通道(3，23)具有相对设置的第一侧壁和第二侧壁，其中所述第一侧壁位于靠近旋转中心的内侧，所述第二侧壁位于远离旋转中心的外侧；在所述第二侧壁上还设置有若干个定量腔室(4，24)，所述定量腔室(4，24)的容积大小预先设定，以定量分配；
9.任意一个所述检测单元中：对于相邻的2条所述试剂定量分配通道，靠内侧试剂定量分配通道的定量腔室(4，24)通过疏水性微通道(8，28)与靠外侧试剂定量分配通道的液体分配引流通道(3，23)相连；如此全部试剂定量分配通道依次相连，最外侧试剂定量分配通道的定量腔室(4，24)还通过疏水性微通道(8，28)与更外侧的反应腔室(7，27)相连；其中，所述疏水性微通道(8，28)的内壁具有疏水性，且能够对液态试剂或液态样本产生阻力作用，如此通过旋转转速控制离心力，调控离心力与阻力的大小关系，即能够控制疏水性微通道(8，28)对试剂或样本的导通与否；所述反应腔室(7，27)则用于收集定量后的试剂或样本，这些试剂或样本将在所述反应腔室(7，27)内发生混合；
10.当该分析芯片绕所述旋转中心旋转、且所述疏水性微通道(8，28)对试剂或样本处于非导通状态时，该分析芯片能够对试剂或样本进行定量分配；
11.当该分析芯片绕所述旋转中心旋转、且所述疏水性微通道(8，28)对试剂或样本处于导通状态时，该分析芯片能够对定量分配后的试剂或样本进行混合。
12.作为本发明的进一步优选，任意一条试剂定量分配通道中，包括至少2个定量腔室(4，24)；其中最靠近所述首端的定量腔室(4，24)是作为牺牲腔室，用于容纳旋转离心时产生的过量试剂或过量样本。
13.作为本发明的进一步优选，对于位于外侧的所述试剂定量分配通道，除所述牺牲腔室外，自所述首端向所述尾端，所述定量腔室(4，24)的容积保持一致或逐渐增大；
14.对于位于内侧的所述试剂定量分配通道，除所述牺牲腔室外，自所述首端向所述尾端，所述定量腔室(4，24)的容积保持一致或逐渐减小。
15.作为本发明的进一步优选，所述疏水性微通道(8，28)的高度优选为10～500μm，宽度优选为10～500μm；相应的：
16.当旋转转速为500～1000rpm时，所述分析芯片能够对液态试剂或液态样本进行定量分配；
17.当旋转转速为2000～3000rpm时，所述分析芯片能够对定量分配后的液态试剂或液态样本进行混合。
18.作为本发明的进一步优选，所述疏水性微通道(8，28)的内壁上具有疏水涂层，所述疏水涂层具体是采用蜡、硅烷化试剂、teflon af、cytop或电子氟化液；所述电子氟化液优选为ecg1700。
19.作为本发明的进一步优选，所述疏水性微通道(8，28)具有弯折结构，用于增加它对液态试剂或液态样本的阻力；
20.优选的，位于外侧的所述试剂定量分配通道所对应的任意一个疏水性微通道(8，28)具有较多的弯折结构，位于内侧的所述试剂定量分配通道所对应的任意一个疏水性微通道(8，28)具有较少的弯折结构。
21.作为本发明的进一步优选，所述试剂存储腔室(1，21)上还设置有试剂加样口(2，22)，用于向所述试剂存储腔室(1，21)内补充待定量分配的液态试剂或液态样本；
22.所述反应腔室(7，27)还与有气孔(6，26)相连，用于平衡所述反应腔室(7，27)内的气压；
23.任意一个所述液体分配引流通道(3，23)的尾端还与废液腔室(5，25)相连通；
24.优选的，任意一个所述检测单元内的液体分配引流通道(3，23)与同一个废液腔室(5，25)相连通。
25.作为本发明的进一步优选，所述芯片具有2层结构，其中所述疏水性微通道(8，28)位于其中的1层结构中，所述试剂存储腔室(1，21)、所述试剂加样口(2，22)、所述液体分配引流通道(3，23)、所述定量腔室(4，24)、所述废液腔室(5，25)和所述反应腔室(7，27)均位于其中的另1层结构中；
26.优选的，所述芯片为圆盘式芯片。
27.通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，本发明的疏水性微通道辅助高通量试剂定量分配及分析的芯片，通过旋转式微流控芯片结构，利用离心力作为流体的驱动，简单的疏水性微通道作为流阻阀，完成单个反应的多种试剂(或样本)的高通量定量分配，适用于各种反应的高通量定量分析；同时芯片结构简单(尤其可设计成双层的芯片结构，疏水性微通道位于微通道层，其他结构可位于试剂层)，简化了芯片的加工工艺，提高了芯片检测的稳定性；同时整个复杂的定量分配过程由芯片及离心仪完成，不需要专业检测人员进行操作，同时结合微流控微型化的特点，节省试剂消耗，大大加快了检测速度，降低了检测成本。
28.本发明中的离心式芯片上具有多个检测单元可以完成多个样本的高通量处理，每个检测单元上可以完成多种试剂或样本的快速定量混合，每个检测单元上具有多个反应腔室，每个反应腔室为独立的反应腔室，可以完成多种生物化学反应。该离心式芯片可以通过低速离心或简单手动进样方式对液体进行精确定量分配，最后通过高速完成不同液体的混合。具体的，当采用低速离心或简单手动进样方式时，液体会进入定量腔室，但是不会突破疏水性微通道，多余的液体随分配通道进入废液池；定量完成之后采用高速离心，定量的液体会按由圆心向外定量腔室的顺序，依次进入反应腔室进行混合，由于低速离心时，试剂加样口会残留一些液体，这部分多余的液体会在高速离心的情况下进入牺牲腔室，而不会影响反应腔室的液体定量。基于本发明，其中任意一个检测单元，可以包括多组定量腔室，可
以实现多种反应试剂(或样本)的同时定量分配及混合。此外，混合方式可以有多种，例如可通过控制试剂或样本的顺序进入可以达到初步混合，也可以通过控制离心转速的加速度及离心方向的不断改变来完成混合。
29.具体说来，本发明能够取得以下有益效果：
30.(1)本发明芯片结构简单，加工工艺简便高效，不需要复杂的阀门控制，增加了芯片的稳定性；芯片整体结构尤其可以只有上下盖(即，微通道层及试剂层)，芯片结构相对简单，大大简化芯片加工工艺，加工制造简单，利于后期量产开发。
31.(2)该芯片可以实现多种反应的同时进行，同时可以完成一种反应中多种试剂的同时精确定量，因此可以实现多种试剂的高通量定量分配及反应分析。
32.(3)该芯片采用离心力驱动液体流动，可以通过控制离心速度来精确控制流体驱动力的大小。
33.综上，本发明提供了一种便宜加工量产，简单、快速、高通量的微流体自动定量分配芯片，可应用于免疫、核酸及病原菌等快速检测场景。
附图说明
34.图1为本发明高通量试剂定量分配的第一类分析芯片整体结构示意图。
35.图2为本发明高通量试剂定量分配的第一类分析芯片检测单元结构示意图。
36.图3为本发明高通量试剂定量分配的第二类分析芯片整体结构示意图。
37.图4为本发明高通量试剂定量分配的第二类分析芯片检测单元结构示意图。
38.图5为本发明高通量试剂定量分配的第一类分析芯片色素测试结果；其中，图5中的a为低速定量检测结果(转速具体为800rpm)，图5中的b为高速混合检测结果(转速具体为2500rpm)。
39.图6为本发明高通量试剂定量分配的第二类分析芯片色素测试结果；其中，图6中的a为低速定量检测结果(转速具体为800rpm)，图6中的b为高速混合检测结果(转速具体为2500rpm)。
40.图中各附图标记的含义如下：1
‑
试剂存储腔室，2
‑
试剂加样口，3
‑
液体分配引流通道，4
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定量腔室，5
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废液腔室，6
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气孔，7
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反应腔室，8
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疏水性微通道，21
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试剂存储腔室，22
‑
试剂加样口，23
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液体分配引流通道，24
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定量腔室，25
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废液腔室，26
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气孔，27
‑
反应腔室，28
‑
疏水性微通道，100
‑
第一类分析芯片，200
‑
第二类分析芯片。
具体实施方式
41.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
42.总的来说，本发明中微通道辅助高通量试剂定量分配及分析的芯片，可以为圆盘式分析芯片，一个圆盘式分析芯片上设计有一个或多个检测单元，所述单个检测单元包括试剂储存腔室、定量分配单元和辅助微通道单元，所述试剂储存腔室与定量分配单元连接；所述定量分配单元用于低速离心或手动进样时对液体进行定量分配，在一个检测单元上可
以有一个或多个定量分配单元；所述定量分配单元包括液体分配引流通道及定量腔室；所述微通道单元为连接定量腔室与反应腔室及定量腔室与定量腔室的微型通道。
43.定量腔室的容积大小由其设定的腔室大小决定，不受限于固定的形式。
44.微型通道为疏水性微通道，具有疏水性质，既可以是其本身是疏水材质，也可以是疏水修饰所致。疏水材质例如可以是聚二甲基硅氧烷(pdms)、碳粉、蜡膜等；疏水修饰试剂为蜡、硅烷化试剂、teflon af、cytop和ecg1700中的一种涂层在微通道表面。
45.以试剂均为以水为溶剂的试剂为例，由于疏水性微通道对它们的阻力效果，在低转速条件下，由于离心力较小、无法克服疏水性微通道的阻力，疏水性微通道将处于非导通状态(此时，疏水性微通道对试剂将处于非导通状态)，该分析芯片能够对试剂进行定量分配；在高转速条件下，由于离心力较大、超过了疏水性微通道的阻力，疏水性微通道将处于导通状态(此时，疏水性微通道对试剂将处于导通状态)。当然，对于不是水为溶剂的试剂(如乙醇为溶剂)，由于疏水性微通道对试剂的阻力仍客观存在，本发明分析芯片仍具有相似的高通量试剂定量分配技术效果，只是此时发生定量分配的低速条件、以及发生试剂混合的高速条件，它们具体的转速值区间会发生变化，同时也可以改变微通道疏水修饰的材料来增加对乙醇溶液的阻力。进一步的，为了提高疏水性微通道对试剂的阻力，疏水性微通道可设置成弯折的形状，弯折次数越多、阻力越大(当然，若直线形疏水性微通道已能满足阻力需要，疏水性微通道也可以采用直线形设计)。
46.而采用手动进样方式时(如利用注射泵)，把液体持续注入后，注入一段空气，与低速离心方式类似，可以将液体注入定量腔室，而多余的液体被空气推动进入牺牲腔室(当然，稳定性可能不及低速离心方式)。
47.另外，液体分配引流通道从试剂存储腔室一直延伸至废液腔室，可设计成不断地远离圆心(即，从加样口到废液腔之前不断更加远离圆心)，有助于离心时液体的流动(当然，也可以保持距离圆心的距离不变)。
48.液体分配引流通道与废液池连通，定量腔室的大小可预先设定、随意调整，定量腔室的大小决定了定量液体的体积大小，尤其可以完成对液体的同等或梯度定量。进一步的，可以实现反应腔室中样本浓度梯度的精确定量分配。定量腔室的高度例如可以为0.5～3mm，但不限于此。
49.根据同等定量还是梯度定量，可以将分析芯片分为两类，分别记为第一类分析芯片和第二类分析芯片。
50.下面结合具体实施例对这两类分析芯片进行详细说明：
51.实施例1(梯度定量)：
52.本发明中微通道辅助高通量试剂定量分配及分析的芯片，该芯片为圆盘式分析芯片，芯片结构包括微流通道层及试剂层(这2个层一上一下设置，并不限制哪个层在上、哪个层在下)，图1为本发明一种疏水性微通道辅助高通量试剂定量分配的第一类分析芯片整体结构示意图。所述圆盘式分析芯片包含一个或多个检测单元(图1中所示的为2个检测单元；当然检测单元的数量可灵活调整，例如，可以根据定量腔室的量来选择，若定量腔室数量较少，芯片的检测单元就可以相应增加)，图2为本发明一种疏水性微通道辅助高通量试剂定量分配的第一类分析芯片的检测单元结构示意图。所述检测单元包括试剂存储腔室1、试剂加样口2、液体分配引流通道3、定量腔室4、废液腔室5、气孔6、反应腔室7、疏水性微通道8
(其中，疏水性微通道8可单独设置在微流通道层，其他结构均可设置在试剂层)；所述剂存储腔室1设有用于加样的加样口2；所述液体分配引流通道3与所述试剂存储腔室1、定量腔室4及废液腔室5连通，用于低速离心时对试剂进行精确的定量分配；疏水性微通道8与定量腔室4及反应腔室7相互连通，用于高速离心时对定量腔室4中的液体进行引流，使精确定量的试剂按顺序进入最终反应腔室7并产生冲击混合及扩散效果；废液腔室5与液体分配引流通道3连通以用于收集废液。
53.本发明中的圆盘式分析芯片具有旋转中心，液体分配引流通道3相对于所述试剂存储腔室1和试剂加样口2，更远离旋转中心；定量腔室4相对于液体分配引流通道3更远离旋转中心(即，定量腔室4设置在液体分配引流通道3远离旋转中心的侧壁上)；废液腔室5与反应腔室相对于疏水性微通道8更远离旋转中心。
54.如图1、图2所示，在本实施例中，对于任意一条液体分配引流通道3，自其首端向尾端，具有若干个定量腔室4，其中出现的第1个定量腔室4是作为牺牲腔室(容积可以预先设定的大一些)；而由第2个定量腔室4开始：
55.(a)对于位于外侧的所述试剂定量分配通道，定量腔室4的容积逐渐增大；
56.(b)对于位于内侧的所述试剂定量分配通道，定量腔室4的容积逐渐减小。
57.图1、图2中示出的任意一个检测单元，均包括3条试剂定量分配通道，仅为示例，试剂定量分配通道的数量可根据实际情况灵活调整，只要包括至少1条试剂定量分配通道即可；例如，极端情况下一个检测单元可以只包括1条试剂定量分配通道(该试剂定量分配通道上的若干定量腔室4通过疏水性微通道8与反应腔室7相连)，仍然能够完成定量分配及混合的作用(此时反应腔室7内可以预埋些试剂，如粉剂，可以实现定量分配后的液态试剂与粉剂的混合)。
58.本实施例中，如图5所示，芯片的大小为直径120mm的圆盘式芯片，从三个腔室中由圆心向外，依次加入红，蓝，绿三种染色染料溶液。
59.将该芯片先在低速下进行定量、再在高速下进行混合，检测结果如图5所示。从图5中可以看出，低速离心下，三种染色的染料可以完成很好的精确定量，定量体积大小由定量腔室的容积决定；在高速离心下，所有液体按顺利被引流进入反应腔室，最终的反应体积基本保持一致，说明定量具有较高的精确性，可以实现多种试剂按梯度比例混合。
60.实施例2(同等定量)：
61.本发明一种疏水性微通道辅助高通量试剂定量分配及分析的芯片，所述芯片为圆盘式分析芯片，芯片结构包括微流通道层及试剂层，图3为本发明一种疏水性微通道辅助高通量试剂定量分配的第二类分析芯片整体结构示意图。所述圆盘式分析芯片包含一个或多个检测单元(图3中所示的为3个检测单元，检测单元的数量同样可灵活调整)，图4为本发明一种疏水性微通道辅助高通量试剂定量分配的第二类分析芯片的检测单元结构示意图。所述检测单元包括试剂存储腔室21、试剂加样口22、液体分配引流通道23、定量腔室24、废液腔室25、气孔26、反应腔室27、疏水性微通道28；所述剂存储腔室21设有用于加样的加样口22；所述液体分配引流通道23与所述试剂存储腔室21、定量腔室24及废液腔室25连通，用于低速离心时对试剂进行精确的定量分配；疏水性微通道28与定量腔室24及反应腔室27相互连通，用于高速离心时对定量腔室24中的液体进行引流，使精确定量的试剂按顺序进入最终反应腔室27并产生冲击混合及扩散效果；废液腔室25与液体分配引流通道23连通以用于
收集废液。
62.本发明中的圆盘式分析芯片具有旋转中心，液体分配引流通道23相对于所述试剂存储腔室21和试剂加样口22，更远离旋转中心；定量腔室24相对于液体分配引流通道23更远离旋转中心；废液腔室25与反应腔室相对于疏水性微通道28更远离旋转中心。
63.如图3、图4所示，在本实施例中，对于任意一条液体分配引流通道23，自其首端向尾端，具有若干个定量腔室24，其中出现的第1个定量腔室24是作为牺牲腔室(容积可以预先设定的大一些)；而由第2个定量腔室24开始，定量腔室24的容积保持固定。
64.由于圆盘式芯片依靠离心力驱动流体运动，离心力的大小与定量腔室24与圆心的距离相关，越远离圆心，在相同速度下离心力越大，因此疏水性微通道越远离圆心所需的阻力越大，弯曲的通道越多。
65.图3、图4中示出的任意一个检测单元，均包括6条试剂定量分配通道，仅为示例，试剂定量分配通道的数量可根据实际情况灵活调整，只要包括至少1条试剂定量分配通道即可；例如，极端情况下一个检测单元可以只包括1条试剂定量分配通道(该试剂定量分配通道上的若干定量腔室24通过疏水性微通道28与反应腔室27相连)，仍然能够完成定量分配及混合的作用(此时反应腔室27内可以预埋些试剂，如粉剂，可以实现定量分配后的液态试剂与粉剂的混合)。
66.本实施例中，如图6所示，芯片的大小为直径240mm的圆盘式芯片，一个检测单元上包含六个试剂加样口，可以完成六种试剂的精确定量，在六个由圆心向外试剂腔室中，依次加入红，绿，蓝，紫，浅红，黑六种不同颜色的染色染料溶液代表六种不同试剂。
67.将该芯片先在低速下进行定量、再在高速下进行混合，检测结果如图6所示。从图6中可以看出，低速离心下，六种不同颜色的染料可以完成很好的精确定量，定量体积大小由定量腔室的容积决定，在高速离心下，所有液体按顺利被引流进入反应腔室，最终的反应体积基本保持一致，说明定量具有较高的精确性，可以实现多种试剂的精确定量及混合。
68.另外，本发明中疏水性微通道辅助高通量试剂定量分配及分析的芯片的加工材料可为pmma、pc、pp、pdms等，加工方式包括cnc数控加工、激光雕刻、软光刻技术、3d打印及注塑形成模具等方式，但不限于此。例如，由于圆盘式芯片主要结构为微流通道层及试剂层，当利用cnc技术加工芯片时，芯片只有双层结构贴合；当利用激光雕刻技术加工时，芯片只需要加上上下盖片即可。当然，除圆盘式外的其他形状也适用，只要芯片具有旋转中心、且液体分配引流通道的分布满足以旋转中心为参照的弧线形的分布即可。
69.本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。