同时检测幽门螺旋杆菌耐药位点、毒力基因分型及质子泵抑制剂代谢基因分型的试剂盒的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及同时检测幽门螺旋杆菌耐药位点、毒力基因分型及质子泵抑制剂类药物代谢基因分型的试剂盒。


背景技术：

2.幽门螺杆菌(h.pylori)是定植于胃上皮细胞的微需氧革兰氏阴性细菌，感染了世界约50％至70％的人口，有些发展中国家感染率甚至高达80％以上，是全球最普遍的病原体之一，可导致胃肠道疾病，包括消化性溃疡、胃边缘区/黏膜相关淋巴样组织(malt)淋巴瘤和胃癌。幽门螺杆菌已被世界卫生组织和国际癌症研究机构(iarc)定为i类致癌物。据统计，全世界超过6％的癌症和大约90％的非贲门型胃癌病例均归因于幽门螺杆菌感染。根据世界卫生组织(who)资料，2018年因感染引发的癌症占24.2％，其中45％归因为hp感染。根除幽门螺杆菌将显着降低胃癌和消化性溃疡的发生率，并降低与控制这些发病率相关的成本，尤其在高流行人群中，根除幽门螺杆菌具有明显成本效益。目前，幽门螺杆菌的根除方案主要包括质子泵抑制剂(ppi)、胃粘膜保护剂和一种或两种抗生素，构成三联或四联疗法。用于根除幽门螺杆菌的抗生素包括克拉霉素、甲硝唑、喹诺酮类(左氧氟沙星)、阿莫西林、四环素、利福平等。在1990年代初，根除幽门螺杆菌的比率超过80％。但是近年来，随着全球幽门螺杆菌菌株对最常用抗生素的细菌耐药性不断增加，在过去20年中，许多国家的抗生素耐药性已超过15
‑
20％的门槛，克拉霉素、阿莫西林和甲硝唑的耐药性水平最高分别达50％、30％和95％。多药耐药性的出现显著影响幽门螺杆菌根除标准疗法的疗效，导致幽门螺杆菌的根除率在全球范围内不断下降。为了最好地优化幽门螺杆菌感染的管理，幽门螺杆菌的治疗应基于局部和个体抗菌素耐药性模式，针对具体患者量身定制有效的抗生素治疗策略可能会大大减少治疗失败并降低抗生素耐药性。
3.另一方面，并不是所有幽门螺杆菌阳性患者都推荐进行根除治疗，过度治疗会造成医疗资源的浪费、造成人群耐药比率的增加，而且抗生素使用还能产生的肠道菌群紊乱的风险。大量研究表明caga和vaca为幽门螺杆菌的主要毒力因子，caga分为阳性和阴性，其中阳性毒力大于阴性，vaca基因根据信号区(s区)和中间区(m区)基因序列的差异，可以分为s1/m1、s1/m2、s2/m1、s2/m2四种型，毒力程度可以按照s1/m1>s1/m2>s2/m1>s2/m2的顺序依次减弱。流行病学调查显示，vaca s1/m1型与caga阳性显著相关，vaca s1/m1和caga阳性菌株与胃溃疡，胃癌的发生显著相关。因此我们可以根据毒力基因检测结果，结合临床症状及医生的建议来决定是否进行hp根除治疗，给予医生有力的判断依据。
4.质子泵抑制剂(proton pump inhibitors,ppis)作为目前抑酸性作用最强的一类药物，特异性高、持续时间长久，广泛应用于消化系统疾病治疗。但是对ppi不良反应认识的不足导致目前全球ppi滥用。由于用药的个体间差异大，ppi的使用受到约束。ppi的生物利用度和代谢主要受药物代谢酶cyp2c19的影响。cyp2c19编码基因的突变，可造成cyp2c19酶代谢活性的改变，进而出现不同患者服用以cyp2c19为关键代谢酶的药物后，体内血药浓度
差异，甚至产生不同临床反应。目前，发现的cyp2c19等位基因超过38个，但是在药物代谢中起作用的主要是cyp2c19*2、cyp2c19*3，其均为功能缺失型等位基因。另外，cyp2c19*17也在ppi代谢过程中起到些微作用，其他等位基因发生突变的概率极小。cyp2c19同工酶被分为四种不同的代谢类型：超快代谢型(ultrarapid metabolizers,um)(*1/*17,*17/*17),可能由于功能区基因的非正常复制或非正常扩增造成酶活性明显增高；快代谢型(extensive metabolizer,em)(*1/*1),功能区基因正常表达,表达正常活性酶，em也是正常人群的代谢表型；中间代谢型(intermediatemetabolizer,im)(*1/*2,*1/*3,*17/*2,*17/*3)，可能携带有一个功能缺陷的等位基因或无功能的等位基因，表达的药物代谢酶的活性较正常稍有降低；慢代谢型(poor metabolizer,pm)(*2/*2,*2/*3,*3/*3)，可能携带有两个无效的等位基因,致使表达的药物代谢酶的活性显著降低。pm型的同工酶基因出现突变，产生终止密码，使蛋白合成过早终止，从而产生无活cyp2c19酶，失去对物质的羟化代谢能力。所以，对cyp2c19进行基因分型检测，能够指导医生对ppi类药物进行精准剂量使用。
5.在耐药性检测方面，内窥镜引导的幽门螺杆菌培养和表型药敏试验(dst)是检测耐药性的金标准技术。但由于需要进行侵入式内窥镜检查才能从患者那里获得胃活检标本，并且幽门螺杆菌运输和培养均需要严格的条件，难度较大且很费时，至少需要10天才能完成细菌培养和抗生素敏感性测试，既费时又费钱，因此不建议在进行一线治疗之前进行完整的表型dst。随着分子检测技术的不断发展和完善，分子检测在病原微生物感染诊断及治疗监测上的临床应用日益广泛，可以作为培养法药敏试验的一种有效替代方法。目前常用的病原微生物分子检测方法主要包括：基于pcr的电泳法、实时荧光定量pcr(qpcr)、基因芯片技术、测序技术(sanger测序技术、焦磷酸测序技术、高通量ngs测序技术)等。pcr是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，具有灵敏度高、特异性强、简便快速、对标本的纯度要求低等特点，是目前应用最为广泛的病原学检测技术。目前用于确定幽门螺杆菌抗性的分子检测方法主要包括限制性片段长度多态性pcr(pcr
‑
rflp)、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，fish)、实时荧光定量pcr和等位基因特异性pcr等，检测样本包括活检标本、胃液、菌落甚至粪便，这些方法在检测23s rrna和gyra基因突变以预测克拉霉素和左氧氟沙星耐药性方面显示了良好的灵敏度和特异性。中国专利cn109797203a“幽门螺杆菌检测体系及检测试剂盒和应用”和cn111334592a“一种用于检测幽门螺杆菌耐药基因的核酸组合物及其试剂盒和应用”分别公开了用于幽门螺杆菌的鉴定、分型及抗生素耐药性的荧光定量pcr扩增体系，但是目前荧光定量pcr法由于本身的技术性限制，一个检测反应最多只能实现几个位点的同时检测，检测通量有限，当需要检测更多种基因变异点位时就会受到限制。另一方面，利用常规的荧光定量pcr方法可能无法满足大样本量快速检测的需求。中国专利cn105368825a“幽门螺杆菌抗生素耐药性分析试剂盒及耐药性检测方法”和cn105506160a“幽门螺杆菌定量和毒力多重基因检测体系及其试剂盒和应用”均公开了一种基于多重pcr
‑
毛细管电泳法在同一个反应体系内对幽门螺杆菌常用抗生素耐药性的分析，但是毛细管电泳法只能根据片段大小进行分型，对多重pcr扩增的均一性和特异性具有很高的要求。ngs高通量测序技术和芯片技术，近年来作为一种高通量高精度的核酸检测技术，由于无需对病原体进行分离培养，打破了传统微生物检验的局限性，在临床微生物学研究领域展现了广阔的应用前景。中国专利cn103060455b“一种幽门螺
杆菌感染个体化治疗检测基因芯片及应用”公开了是一种用于幽门螺杆菌感染个体化治疗的检测型基因芯片，可同时对人基因组cyp4502c19*2、cyp4502c19*3多态性和幽门螺杆菌克拉霉素、喹诺酮类耐药位点进行检测。但是由于芯片检测和高通量测序(下一代和第三代测序)的设备和流程复杂昂贵，检测成本高，耗时长，目前主要用于基因型和表型耐药性之间的关联性研究方面，在幽门螺杆菌临床分子检测中很少使用。因此，如何有效利用核酸分子检测的手段，快速、高效、高通量、且准确判断幽门螺杆菌耐药情况是迫切需要解决的问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种利用多重pcr
‑
飞行时间质谱同时检测幽门螺杆菌耐药基因(克拉霉素耐药相关的23s基因、喹诺酮类耐药相关的gyra基因、甲硝唑耐药的rdxa基因、阿莫西林耐药相关pbp1a、呋喃唑酮相关耐药基因oord和pord基因)、毒力基因(caga和vaca基因)和质子泵抑制剂药物代谢基因cyp2c19分型位点的方法、配套引物/探针组合及试剂盒、以及这种检测方法在临床hp根除治疗用药指导方面的应用。毒力基因的检测结果可以用于辅助医生评估hp根除治疗的意义，耐药基因检测用于决定选择抗生素的种类，而对质子泵抑制剂代谢基因的检测，可以精准指导ppi类药物的用药剂量。
7.本发明的第一方面，提供了一种利用多重pcr
‑
飞行时间质谱诊断幽门螺旋杆菌感染的试剂盒，所述试剂盒包括第一引物对组，所述第一引物对组包括序列如seq id no.1至seq id no.14所示的引物。
8.在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二引物对组，所述第二引物对组包括序列如seq id no.15至seq id no.30所示的引物。
9.在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三引物对组，所述第三引物对组包括序列如seq id no.31至seq id no.48所示的引物。
10.在另一优选例中，所述试剂盒还包括第一探针组，所述第一探针组包括序列如seq id no.49至seq id no.55所示的探针。
11.在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二探针组，所述第二探针组包括序列如seq id no.56至seq id no.63所示的探针。
12.在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三探针组，所述第三探针组包括序列如seq id no.64至seq id no.72所示的探针。
13.在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内含有所述第一引物对组。
14.在另一优选例中，所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器内含有所述第二引物对组。
15.在另一优选例中，所述试剂盒包括第三容器，所述第三容器内含有所述第三引物对组。
16.在另一优选例中，所述试剂盒包括第四容器，所述第四容器内含有所述第一探针组。
17.在另一优选例中，所述试剂盒包括第五容器，所述第五容器内含有所述第二探针组。
18.在另一优选例中，所述试剂盒包括第六容器，所述第六容器内含有所述第三探针组。
19.在另一优选例中，所述试剂盒包括第七容器，所述第七容器内含有pcr预混液；优选地，所述pcr预混液主要包括热启动taq酶、dntps、mg
2
。
20.在另一优选例中，所述试剂盒包括第八容器，所述第八容器内含有虾碱性磷酸酶(sap)。
21.在另一优选例中，所述试剂盒包括第九容器，所述第九容器内含有延伸酶。
22.在另一优选例中，所述试剂盒包括第十容器，所述第十容器内含ddntp。
23.在另一优选例中，所述试剂盒包括第十一容器，所述第十一容器内含延伸反应缓冲液。
24.在另一优选例中，所述试剂盒包括第十二容器，所述第十二容器内含纯水。
25.本发明的第二方面，提供了一种利用多重pcr
‑
飞行时间质谱诊断幽门螺旋杆菌感染的方法，所述方法包括步骤：
26.(1)提供待测样本，对所述待测样本中的核酸进行pcr扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物；
27.(2)使用虾碱性磷酸酶(sap)处理步骤(1)获得的扩增产物；
28.(3)使用延伸探针对步骤(2)处理过的扩增产物进行单碱基延伸反应，获得延伸产物；
29.(4)纯化所述延伸产物；
30.(5)采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi
‑
tof
‑
mass)系统对纯化后延伸产物进行分子量检测，根据分子量标记确定待测样本是否发生某位点耐药突变；
31.其中，所述步骤(1)中，分别使用第一引物对组、第二引物对组、和第三引物对组、进行pcr扩增；
32.优选地，所述第一引物对组包括序列如seq id no.1至seq id no.14所示的引物；
33.所述第二引物对组包括序列如seq id no.15至seq id no.30所示的引物；
34.所述第三引物对组包括序列如seq id no.31至seq id no.48所示的引物。
35.在另一优选例中，所述步骤(3)中，分别使用第一探针组、第二探针组、和第三探针组进行单碱基延伸反应；
36.优选地，所述第一探针组包括序列如seq id no.49至seq id no.55所示的探针；
37.所述第二探针组包括序列如seq id no.56至seq id no.63所示的探针；
38.所述第三探针组包括序列如seq id no.64至seq id no.72所示的探针。
39.在另一优选例中，所述方法为非诊断目的。例如，可以对环境样本进行检测，以鉴别环境样本中的耐药幽门螺旋杆菌。
40.本发明的第三方面，提供了引物对组的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于诊断幽门螺旋杆菌感染；
41.所述引物对组为第一引物对组、第二引物对组、和第三引物对组中的一组或多组引物对组；其中，
42.所述第一引物对组包括序列如seq id no.1至seq id no.14所示的引物；
43.所述第二引物对组包括序列如seq id no.15至seq id no.30所示的引物；
44.所述第三引物对组包括序列如seq id no.31至seq id no.48所示的引物。
45.本发明的第四方面，提供了探针组的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于诊断幽门螺旋杆菌感染；
46.所述探针组为第一探针组、第二探针组、和第三探针组中的一组或多组探针组；
47.所述第一探针组包括序列如seq id no.49至seq id no.55所示的探针；
48.所述第二探针组包括序列如seq id no.56至seq id no.63所示的探针；
49.所述第三探针组包括序列如seq id no.64至seq id no.72所示的探针。
50.应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
51.图1为克拉霉素耐药典型23s_a2143g
‑
c突变的核酸质谱峰图；
52.图1
‑
1为克拉霉素耐药典型23s_a2143g
‑
c突变的最低检测限1000拷贝/ml的核酸质谱峰图；
53.图1
‑
2为23s_a2143g
‑
c检测阴性对照的核酸质谱峰图；
54.图2为喹诺酮类耐药典型gyra_t
‑
c261a
‑
g突变的核酸质谱峰图；
55.图2
‑
1为喹诺酮类耐药典型gyra_t
‑
c261a
‑
g突变的最低检测限1000拷贝/ml的核酸质谱峰图；
56.图2
‑
2为gyra_t
‑
c261a
‑
g检测阴性对照的核酸质谱峰图；
57.图3为阿莫西林耐药典型pbp1a_ct1242ag突变的核酸质谱峰图；
58.图3
‑
1为阿莫西林耐药典型pbp1a_ct1242ag突变的最低检测限1000拷贝/ml的核酸质谱峰图；
59.图3
‑
2为pbp1a_ct1242ag检测阴性对照的核酸质谱峰图；
60.图4为甲硝唑耐药典型rdx_g616a突变的核酸质谱峰图；
61.图4
‑
1为甲硝唑耐药典型rdx_g616a突变的最低检测限1000拷贝/ml的核酸质谱峰图；
62.图4
‑
2为rdx_g616a检测阴性对照的核酸质谱峰图；
63.图5为四环素耐药典型16s_926
‑
928ttc突变的核酸质谱峰图；
64.图5
‑
1为四环素耐药典型16s_926
‑
928ttc突变的最低检测限1000拷贝/ml的核酸质谱峰图；
65.图5
‑
2为16s_926
‑
928ttc检测阴性对照的核酸质谱峰图。
66.图6为呋喃唑酮耐药典型pord_g353a突变的核酸质谱峰图；
67.图6
‑
1为呋喃唑酮耐药典型pord_g353a突变的最低检测限1000拷贝/ml的核酸质谱峰图；
68.图6
‑
2为pord_g353a检测阴性对照的核酸质谱峰图。
69.图7为vs
‑
zp
‑
f0延伸引物产生的质谱图，用于检测毒力基因vaca，但不区分s1/s2分型特异性延伸引物峰。
70.图8为vs
‑
zp
‑
f1延伸引物产生的质谱图，用于检测vaca毒力基因的s1分型。
71.图9为caga毒力基因特异性位点caa
‑
1核酸质谱峰图caga特异性位点1(caga1)质谱峰图
72.图10为caga毒力基因特异性位点caga
‑
2核酸质谱峰图。
73.图11为caga毒力基因特异性位点caga
‑
3核酸质谱峰图。
74.图12为对照引物对1和对照延伸探针1组合的核酸质谱峰图。
具体实施方式
75.基于多重pcr
‑
飞行时间质谱，本发明提供了用粪便样本可同时进行三种无创检测：检测6种常用的幽门螺杆菌抗生素(包括克拉霉素、甲硝唑、喹诺酮类、阿莫西林和四环素、呋喃唑酮)的耐药基因位点变异、检测2种毒力基因5个位点及2种质子泵药物代谢基因的3个位点并分型的方法，并提供配套引物/探针组合及试剂盒。基于massarray基质辅助激光解吸电离时间飞行质谱(maldi
‑
tof)系统(sequenom,inc.,san diego,ca,usa)，能够实现在同一个反应体系内同时对5种毒力基因分型位点(caga基因、vaca基因的s区，vaca基因的m区)、药物代谢基因cyp2c19的分型的3个snp位点(rs4986893、rs4244285和rs12248560)，16个常见hp耐药位点，5种毒力基因分型位点和cyp2c19的3种分型同时检测分析，包括五种耐药种类：四环素耐药(16s的2个位点)、克拉霉素耐药(23s rrna的2个位点)、喹诺酮类耐药(gyra的3个位点)、阿莫西林耐药(pbp1a的2个位点)、甲硝唑耐药(rdxa的2个位点)、呋喃唑酮耐药(oord的2个位点和pord的3个位点)。本发明提供的检测方法具有高精度、高敏感性、高通量、低成本、快速检测的优势。
76.多重pcr(multiplex pcr)，又称多重引物pcr或复合pcr，它是在同一pcr反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的pcr反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般pcr相同。
77.影响多重pcr反应的因素有很多，比如：
78.(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是dna聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。
79.(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。
80.(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行pcr反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。
81.(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方dna介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。
82.虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。
83.本技术的测定方法基于多重pcr技术和飞行时间质谱对24个常见幽门螺旋杆菌耐药位点、毒力基因位点、药物代谢基因位点，设计24个特异性位点引物，选择特异性保守序
列，设计pcr引物，用一对pcr引物，在引物的5’端带有10个碱基(acgttggatg)序列，使总长度达到29个碱基或以上，从分子量上将引物与探针区别开。在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针长度15
‑
21个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记。
84.多重pcr
‑
飞行时间质谱检测技术虽然能够进行超高通量的检测，但是其对pcr扩增产物的质量要求较高。本发明人在研究中发现，现有的能够进行多重荧光pcr法检测的引物和探针，直接应用于多重pcr
‑
飞行时间质谱检测中，存在很多缺陷，比如无法进行单碱基延伸反应导致质谱检测的假阴性，灵敏度较低且重复性差难以满足临床应用。因此，本发明人针对每个检测位点，重新设计了多对引物和延伸探针，在单位点检测能够满足要求的情况下，进行多重组合检测验证，经过大量试验筛选，最终获得了灵敏度高、特异性好，且检测结果稳定的适用于飞行时间质谱检测的多重pcr检测体系和延伸探针。
85.因此，在一个优选地实施方式中，本发明提供了可同时检测幽门螺杆菌耐药基因突变、毒力基因分型及质子泵抑制剂类药物代谢基因分型的方法、引物和探针组合，还包括检测所需的检测试剂。
86.在另一个优选地实施方式中，本发明提供了基于多重pcr飞行时间质谱，由一个粪便样本同时进行3个项目检测的检测方法，包括以下步骤：
87.1、pcr反应：通过第一轮pcr扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物。
88.2、虾碱性磷酸酶(sap)处理：使未结合的剩余核酸脱磷酸(dntps)失活，预防干扰下一步碱基延伸反应。
89.3、碱基延伸反应：在第二轮扩增中进行单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，得到的延伸产物与所述延伸探针及其它延伸产物之间的分子量差异不小于16da。
90.4、树脂脱盐：纯化延伸反应产物，吸附体系中的na、k离子。
91.5、质谱检测：将纯化后产物采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi
‑
tof
‑
mass)系统进行分子量检测，根据分子量标记确定待测样本是否发生某位点耐药突变，则可判型类别，软件自动处理报告判型结果。
92.优选的，在每次反应中加入阴性对照，所述阴性对照为正常人的血液dna。
93.与现有检测幽门螺旋杆菌耐药的其它技术或同类技术相比，本发明技术方案充分发挥了pcr
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质谱联用同时检测多个位点的优势，同时，还可以对毒力基因位点、药物代谢基因位点进行检测。不需要荧光标记、不需要洗涤、反应在微量体系中进行、样本上样量很少(浓度大于1ng/μl均可检出)等优势，使得试剂耗材成本与检测pcr重数成反比，从而实现以多条探针，在一批反应中可以同时最多检测16个耐药基因位点变异，2种毒力基因5个位点，及2种质子泵药物代谢基因的3个位点。首轮pcr扩增区域为50
‑
130bp的基因型特异性片段，第二轮pcr采用特异性探针末端单点法扩增，可以允许使用更多循环，最大限度地提高了检测灵敏度和特异性，使检测灵敏度达到1am级单个拷贝水平，避免了检测漏诊造成地假阴性问题。同时，该特异性片段扩增设计技术会彻底排除pcr产物污染和同源序列探针错配引起地假阳性问题，为多重检测呼吸道病原体提供了可靠的实验方法。
94.基于多重pcr飞行时间质谱的幽门螺旋杆菌核酸检测的引物和探针组合，所述的组合用于检测16种常见hp耐药位点，包括六种耐药种类：四环素耐药(16s rrna的2个位
点)、克拉霉素耐药(23s rrna的2个位点)、喹诺酮类耐药(gyra的3个位点)、阿莫西林耐药(pbp1a的2个位点)、甲硝唑耐药(rdxa的2个位点)、呋喃唑酮耐药(oord的2个位点、pord的3个位点)；2种毒力基因分型(包括caga基因，及vaca基因s片段和m片段分型位点)；质子泵抑制剂类药物代谢基因型分型(包括cyp2c19*1、*2、*3、*17)。
95.所述的引物和探针组合包括，
96.1)引物序列组合，如表1所示；pcr引物panel分为3个组合，分别为：
97.w1多重引物组合：seq id no.1至seq id no.14；
98.w2多重引物组合：seq id no.15至seq id no.30；
99.w3多重引物组合：seq id no.31至seq id no.48。
100.其中，f为正向引物，r为反向引物。扩增反应时，每个反应管内含有一个多重引物组合。
101.2)探针序列组合，如表2所示；延伸引物panel相对应也分为3个组合：
102.w1：seq id no.49至seq id no.55；
103.w2：seq id no.56至seq id no.63；
104.w3：seq id no.64至seq id no.72。
105.表1.引物序列
106.[0107][0108]
表2.探针序列
[0109]
[0110][0111]
发明人针对24个常见幽门螺旋杆菌耐药位点、毒力基因位点、药物代谢基因位点，设计24个特异性位点引物，选择特异性保守序列，设计pcr引物，用一对pcr引物，在引物的5’端带有10个碱基(acgttggatg)序列，使总长度达到29个碱基或以上，从分子量上将引物与探针区别开。在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针长度15
‑
21个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记。
[0112]
表1和表2列出的合成多核苷酸，均采用常规的多核苷酸合成方法合成。纯化方式为epage。
[0113]
除上面提到的引物和探针外，本发明还提供了幽门螺旋杆菌耐药位点核酸检测试剂盒，所述检测试剂盒中各组分的具体含量如下：
[0114]
表3
[0115]
[0116][0117]
本发明的主要优点在于：
[0118]
目前，多数的检测手段主要是通过荧光定量pcr检测，而无法实现同时检测多个耐药位点、毒力基因、质子泵药物代谢基因，同样用测序手段，但其成本较高，本发明包括以下优点：
[0119]
(1)本发明通过大量的筛选和深入的研究，最终获得了适用于飞行时间质谱检测的多重引物探针组合，使得多重pcr
‑
飞行时间质谱检测幽门螺旋杆菌耐药位点成为可能；同时，采用粪便一种样本，可同步进行无创检测三种检测项目。从而极大地提高了检测效率，显著地降低了检测成本。
[0120]
(2)可以同时检测16种常见hp耐药位点，包括六种耐药种类：四环素耐药(16s rrna的2个位点)、克拉霉素耐药(23s rrna的2个位点)、喹诺酮类耐药(gyra的3个位点)、阿莫西林耐药(pbp1a的2个位点)、甲硝唑耐药(rdxa的2个位点)、呋喃唑酮耐药(oord的2个位点、pord的3个位点)；2种毒力基因分型(包括caga基因，及vaca基因s片段和m片段分型位点)；质子泵抑制剂类药物代谢基因型分型(包括cyp2c19*1、*2、*3、*17)。
[0121]
(3)本发明的方法灵敏度较高，检测浓度可低至1000拷贝/ml。
[0122]
(4)本发明的方法具有极高的检测效率，可在同一批次内进行数百通量的检测，因而极大地提高了检测效率。
[0123]
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
[0124]
实施例1
[0125]
本发明实施方式提供的可同时检测/或鉴定幽门螺旋杆菌耐药位点、毒力基因和的质子泵抑制剂类药物代谢基因型分型的方法，待检测样本有：荧光定量检测已知阳性粪便样本、阴性粪便样本。包括如下步骤：
[0126]
(1)针对24个常见幽门螺旋杆菌耐药位点、毒力基因位点、药物代谢基因位点，设
计24个特异性位点引物，选择特异性保守序列，设计pcr引物，用一对pcr引物，在引物的5’端带有10个碱基(acgttggatg)序列，使总长度达到29个碱基或以上，从分子量上将引物与探针区别开。在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针长度15
‑
21个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记。24个位点的探针见表2。
[0127]
(2)通过pcr扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物。
[0128]
样本选取：选择荧光定量结果分别为克拉霉素耐药、喹诺酮类耐药、阿莫西林耐药、甲硝唑耐药、四环素耐药和呋喃唑酮耐药的阳性样本；合成了部分位点突变的阳性质粒，把质粒稀释成1000拷贝/ml。
[0129]
pcr反应体系配制见表4.
[0130]
表4
[0131]
试剂最终浓度体积1
×
(μl)1mm pcr primer mix0.2mm1.002.5
×
pcr mix1unit2.00dna template(0.5
‑
2ng/μl) 1.00rnase
‑
free watern/a1.00total 5.00
[0132]
先95℃10分钟对mix中pcr酶进行热启动，随后做pcr循环扩增。反应条件为95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共45个循环；最终72℃延伸5分钟，完成后恒温于4℃。
[0133]
(3)通过虾碱性磷酸酶(sap)处理，使得未结合的剩余核酸(dntps)脱磷酸失活，预防干扰下一步碱基延伸反应。sap消化酶反应体系见表5。
[0134]
表5
[0135]
试剂体积1
×
(μl)ddh2o1.75sap enzyme0.25total2.00
[0136]
反应条件为37℃孵育10分钟，去除剩余dntps；然后用85℃5分钟使sap酶失活，完成后恒温于4℃。
[0137]
(4)通过碱基延伸反应，在单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，得到的延伸产物与所述延伸探针及各型别延伸产物之间的分子量差异不小于16da，延伸反应体系见表6。
[0138]
表6
[0139]
[0140][0141]
*延伸反应探针mix的浓度，按照各型分子量大小进行线性关系调节。
[0142]
循环反应为200个短阶梯程序，包含两个循环嵌合，开始为95℃变性30秒，随后在95℃变性5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共40个循环中，每个插入脱火和延伸5个小循环；最终72℃延伸3分钟，完成后恒温于4℃。
[0143]
(5)采用树脂脱盐纯化延伸反应产物。
[0144]
(6)将纯化后产物采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱系统进行分子量检测，根据分子量标记确定待测样本是否发生某位点突变。
[0145]
(7)图1中，横坐标为分子量，纵坐标为峰强度。图中纵行虚线同色为该基因型延伸探针的分子量位置，如果不存在该型别探针峰不变；如果被检测样本拷贝数大于1000，探针可被完全消耗，左侧峰消失转至右侧；右侧的同色虚线表示延伸产物分子量位置。用软件阅读谱图，自动分析和报告结果，导出数据。数据解释为，每一个位点或内参基因的延伸探针在质谱图不同的质量处有相应的分子量峰，在探针发现目标基因工作时出现单碱基延伸产物，探针分子量峰发生转移为产物分子峰，分析结果报告为阳性。阳性结果分为四种判读情况：a、结果可靠；b、中度可靠；c、一般可靠；d、低度可靠。前三种视为延伸反应有效，可确诊为该位点发生突变，对应某种耐药，第四种需要人工辅助判断，观察探针是否消耗，判断为可疑感染或阴性结果。对可疑感染样本，在必要时可作重复性验证试验。
[0146]
(8)本试验对荧光定量结果显示分别为克拉霉素耐药、喹诺酮类耐药、阿莫西林耐药、甲硝唑耐药、四环素耐药和呋喃唑酮的阳性样本进行质谱检测，结果发现检测结果与荧光定量结果一致，都可以检测出相应的耐药位点(如图1、2、3、4、5、6所示)；对阳性质粒检测结果如图1
‑
1、2
‑
1、3
‑
1、4
‑
1、5
‑
1、6
‑
1所示；以及检测时的阴性对照结果如图1
‑
2、2
‑
2、3
‑
2、4
‑
2、5
‑
2、6
‑
2所示。
[0147]
(9)vs
‑
zp
‑
f0延伸引物能够识别vaca基因，但不区分s1/s2分型，vs
‑
zp
‑
f1延伸引物用于检测s1型，如果vs
‑
zp
‑
f1有延伸峰则为s1型，如果没有延伸峰，而vs
‑
zp
‑
f0有延伸峰，则为s2型，如果vs
‑
zp
‑
f0和vs
‑
zp
‑
f1都没有延伸峰，则说明未检出vaca基因。
[0148]
(10)caga
‑
1、caga
‑
2、caga
‑
3为在caga基因在相对保守区域设计的3个不同位置的特异性位点，因为caga基因序列变异性大，因此设置3个位点，任何一个特异性位点检出，则为caga基因阳性
[0149]
(11)vaca基因s1型和caga阳性同时检出为hp为强毒株，强烈建议在医生指导下进行根除治疗。
[0150]
(12)本发明对荧光定量为阳性的粪便样本进行质子泵抑制剂类药物代谢基因型分型的质谱检测，质子泵代谢类型及频率、基因型分型及频率经过整理发现符合常规(见表7)；本发明还发现各分型的比率与已知数据库pharmgkb(east asian)或文献(尹胜菊等，《中国人群药物代谢cyp2c19及cyp2d6基因型分布频率》)的数据相似(如下表8)。
[0151]
表7.质子泵代谢与基因型分型及频率
[0152][0153]
表8.cyp2c19各等位基因分布频率对比(％)
[0154][0155]
结论：本发明能够同时检测幽门螺旋杆菌六种耐药的基因突变、毒力基因分型及质子泵抑制剂类药物代谢基因分型的方法及试剂盒，共计24个检测位点。且检测灵敏度低至1000拷贝/ml。
[0156]
实施例2特异性测定
[0157]
以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、白色念珠菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、甲型副伤寒沙门氏菌和人基因组dna核酸为模板，经本发明多重pcr
‑
飞行时间质谱检测试剂盒检测，结果未出现假阳性结果，表明本发明试剂盒具有良好特异性。
[0158]
实施例3临床样本检测
[0159]
利用本发明所建立的高灵敏度检测/或鉴定幽门螺旋杆菌耐药位点的方法，对100例幽门螺旋杆菌阳性患者核酸样本进行检测，采用市售单重荧光定量pcr检测试剂盒进行验证。
[0160]
结果显示：
[0161]
100例阳性样本中，单重荧光定量pcr和本发明的多重pcr
‑
飞行时间质谱检测方法均检出100例阳性，阳性检出率为100％。其中，鉴别出四环素耐药11例，克拉霉素耐药35例，喹诺酮类耐药32例，阿莫西林耐药3例，甲硝唑耐药56例，呋喃唑酮耐药3例，其余样本为敏
感菌株感染。
[0162]
对比例1引物对和延伸探针的筛选
[0163]
本发明人通过大量的实验，人工设计大量的引物和延伸探针，再对其进行优化选择并验证，最终确定了可以用于飞行时间质谱检测的多重pcr扩增引物和延伸探针序列及其组合。
[0164]
本对比例以23s_a2143g
‑
c位点为例，展示了部分效果不理想的引物和延伸探针。
[0165]
23s_a2143g
‑
c位点引物和延伸探针序列：
[0166]
对照引物对1：
[0167]
f
‑
1：acgttggatggtgaaattgtagtggaggtg(seq id no.:73)
[0168]
r
‑
1：acgttggatgttcccattagcagtgctaag(seq id no.:74)
[0169]
对照引物对2：
[0170]
f
‑
2：acgttggatggctgtctcaaccagagattc(seq id no.:75)
[0171]
r
‑
2：acgttggatgcgcatgatattcccattagc(seq id no.:76)
[0172]
对照延伸探针1：
[0173]
p
‑
1：tcatacccgcggcaagacgga(seq id no.:77)
[0174]
本发明引物对：seq id no.9和10
[0175]
本发明延伸探针：seq id no.53
[0176]
具体方法同实施例1，先用单重pcr扩增然后使用不同延伸探针进行单碱基延伸，再对延伸产物进行质谱检测。将对照引物对1分别和对照延伸探针1、本发明延伸探针(seq id no.53)进行组合，检测灵敏度仅能达到1
×
105拷贝/ml。对照引物对2和对照延伸探针1组合在单重检测体系中能够正常工作，然而在多重体系中则无法通过质谱检测获得阳性结果(如图12所示)。
[0177]
本发明引物对(seq id no.9和10)和本发明延伸探针(seq id no.53)的组合，检测灵敏度能够达到1
×
103拷贝/ml。
[0178]
对比例2多重检测体系的构建
[0179]
由于多重反应体系引物之间的竞争抑制、引物特异性差异、退火温度不一致、以及引物二聚体等原因，很难获得有效的多重pcr扩增引物以及单碱基延伸探针组合。
[0180]
因而，需要将针对各突变位点筛选出的候选引物对和延伸探针进行多重组合，优化多重检测体系。本对比例列举了部分效果不理想的多重检测体系。
[0181]
对照多重检测体系1：
[0182]
表9
[0183]
序号位点1gyra_t
‑
c261a
‑
g2gyra_g271a
‑
t3gyra_a272g
‑
t416s_926
‑
928ttc516s_926
‑
928aga623s_a2142g
‑
c723s_a2143g
‑
c
8rdxa_g565t9rdxa_g616a
[0184]
对照多重检测体系2：
[0185]
表10
[0186]
序号位点1pbp1a_ct1242ag2pbp1a_c1667g323s_a2142g
‑
c423s_a2143g
‑
c5oord_a041g6oord_a122g7pord_g353a8pord_a356g9pord_c357t
[0187]
具体方法同实施例1，对照多重检测体系1为w1多重引物组合的优化之前体系，其中16s_926
‑
928ttc和16s_926
‑
928aga两个位点出现竞争抑制现象，从而导致检测不出的情况。
[0188]
对照多重检测体系2为w3多重引物组合优化前体系，其中23s_a2143g
‑
c和pord_g353a两个位点由于新组合形成后，导致个别位点的延伸产物的分子量或其延伸探针及各型别延伸产物之间的分子量差异大于16da，无法作为多重检测体系进行工作。
[0189]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。