白翎芽孢杆菌在降解抗抑郁药物中的新应用的制作方法

1.本发明属于污水治理领域，具体而言，本发明涉及保藏编号为cgmcc no.6939的白翎芽孢杆菌(bacillus baekryungensis)在降解抗抑郁药物中的新应用。


背景技术：

2.抑郁症在临床上是一种较为多见的精神类疾病。随着生活节奏的加快，人们精神压力逐渐增大，抑郁症的病发率呈逐年上升趋势，世界卫生组织统计抑郁症已成为一种全球性的高发病，目前位居世界10大病种的第5位，全球有超过3.5亿人患有抑郁性疾病。who全球疾病负担合作研究预测，到2020年，重度抑郁所导致的功能残疾将仅次于缺血性心脏病，居第2位。抗抑郁类药物多用于治疗抑郁症、恐慌症、睡眠失调等精神类疾病。相较于其他疾病而言，抑郁症服药周期较长，这加剧了抗抑郁类药物的消耗。抗抑郁药物被人体摄入后，仅有部分被吸收利用，大部分经代谢后仍以其母体或具有药物活性的代谢产物(活性代谢产物)形式排出体外，随污水排放进入污水处理厂和水环境。抗抑郁类药物不但会导致鱼类、软体动物等的胚胎异常发育，还具有干扰人类内分泌系统等毒理效应，并可能诱发环境菌群产生抗药性而破坏生态平衡。
3.目前，抗抑郁类药物在污水处理中的去除主要依靠生物降解，活性污泥和颗粒的吸附作用。其中，生物降解主要包括氧化、水解、去甲基作用。treating wastewater from a pharmaceutical formulation facility by biological process and ozone[j].water research,2013,47(13)：4349
‑
4356.中公开了一种采用活性污泥处理医药废水的方法，但是结果表明，活性污泥对于抗抑郁药的去除率较低，该方法对于西酞普兰、文拉法辛的去除率均低于5％。氧化法对于污水中抗抑郁类药物的降解效率较高，例如fate of citalopram during water treatment with o3,clo2,uv and fenton oxidation[j].chemosphere,2012,89(2)：129
‑
135.中使用臭氧降解西酞普兰，对于西酞普兰的降解率可达80％以上。而使用臭氧联合二氧化氯处理，当臭氧剂量达到0.1mg/l时，西酞普兰的去除率可达90％以上。虽然这种化学氧化法对于抗抑郁药的降解效果好，但是目前其降解效果受多种因素的影响，而且降解机理也不明确，容易产生二次污染。
[0004]
因此，开发一种对于抗抑郁药降解效果好，降解率高的降解方法是目前需要解决的技术问题。


技术实现要素：

[0005]
本发明的一个目的在于提供一种抗抑郁药的降解方法。
[0006]
本发明的发明人在研究中发现，白翎芽孢杆菌(bacillus baekryungensis)对于抗抑郁具有良好的降解效果，尤其是对于氟伏沙明、苯乙肼和沙夫肼的降解更为显著。
[0007]
从而，一方面，本发明提供了白翎芽孢杆菌(bacillus baekryungensis)在降解抗抑郁药或制备降解抗抑郁药菌剂中的应用，其中，所述白翎芽孢杆菌(bacillus baekryungensis)的保藏编号为cgmcc no.6939。
[0008]
本发明中的保藏编号为cgmcc no.6939的白翎芽孢杆菌(bacillus baekryungensis)是已经在现有技术中公开的菌种，例如cn106244486a。因此无需提交保藏证明。
[0009]
根据本发明的具体实施方案，优选地，本发明所述抗抑郁药包括氟伏沙明、苯乙肼和沙夫肼中的一种或多种。
[0010]
本发明中，氟伏沙明、苯乙肼和沙夫肼的结构式分别如下式(i)、式(ii)和式(iii)所示：
[0011][0012]
根据本发明的具体实施方案，优选地，本发明所述的降解抗抑郁药的菌剂为固体菌剂或液体菌剂。在一些具体的实施方案中，所述降解抗抑郁药的菌剂为固体菌剂，所述固体菌剂通过将本发明中的白翎芽孢杆菌接种至固体培养基制备而成，其中，固体培养基为lb固体培养基，也可以采用现有技术中其他适合白翎芽孢杆菌生长的培养基；在另一些具体的实施方案中，所述降解抗抑郁药的菌剂为液体菌剂，所述液体菌剂通过将本发明中的白翎芽孢杆菌接种至液体培养基，例如lb液体培养基中制备而成，同样的，也可以采用现有技术中其他适合白翎芽孢杆菌生长的液体培养基。
[0013]
另一方面，本发明还提供了一种降解抗抑郁药的方法，所述方法包括：
[0014]
取白翎芽孢杆菌，活化制备种子液；
[0015]
将所述种子液接种至待处理的样品中，混匀后进行培养即可；其中：所述白翎芽孢杆菌的保藏编号为cgmcc no.6939；
[0016]
所述待处理的样品包括含有抗抑郁药物的液体培养基或含有抗抑郁药物的医疗废水；当待处理的样品为含有抗抑郁药物的液体培养基时，培养基中抗抑郁药物的浓度不超过400mg/l；当待处理的样品为含有抗抑郁药物的污水时，污水中抗抑郁药物的浓度不超过50mg/l。在一些具体的实施方案中，含有抗抑郁药物的液体培养基为lb液体培养基；在另一些具体的实施方案中，在降解含抗抑郁药物的污水时可以在接种前对污水中的抗抑郁药的浓度进行检测，如果浓度大于50mg/l，可以对其进行适当的稀释，例如采用蒸馏水进行稀释。就目前情况而言，一般污水中的抗抑郁药物的浓度不会超过50mg/l。
[0017]
根据本发明的具体实施方案，本发明中的污水包括生活污水、医疗废水以及被抗抑郁药污染的湖泊或河流。
[0018]
根据本发明的具体实施方案，优选地，本发明的方法中，种子液的接种量为待处理样品的体积的5％
‑
10％。。
[0019]
根据本发明的具体实施方案，优选地，本发明的方法中，所述培养时间为6h
‑
72h。在一些具体的实施方案中，所述培养时间为6h
‑
48h，更优选为30h
‑
48h；
[0020]
在另一些具体的实施方案中，所述培养时间为12h
‑
72h，更优选为36
‑
72h。
[0021]
根据本发明的具体实施方案，优选地，所述培养的条件为：温度为24℃
‑
28℃，振荡频率为160r/min
‑
200r/min。
[0022]
根据本发明的具体实施方案，优选地，所述种子液的制备方法包括：
[0023]
取保藏编号为cgmcc no.6939的白翎芽孢杆菌，接种至培养基中，在24
‑
28℃、160r/min
‑
200r/min条件下培养12
‑
24h，然后划线，挑取单菌落重复培养2
‑
3次后挑取单菌落进行斜面培养；
[0024]
采集斜面上的菌体，调整细胞浓度，制成种子液。
[0025]
在一些具体的实施方案中，采集斜面上的菌体可以采用使用生理盐水冲洗的方式，并采用生理盐水调整细胞浓度。
[0026]
根据本发明的具体实施方案，优选地，所述种子液的浓度为106‑
109cfu/ml。
[0027]
根据本发明的具体实施方案，优选地，所述抗抑郁药包括氟伏沙明、苯乙肼和沙夫肼中的一种或多种。
[0028]
综上所述，本发明提供了白翎芽孢杆菌在降解抗抑郁药方面的新应用。保藏编号为cgmcc no.6939的白翎芽孢杆菌对于抗抑郁药有着良好的降解效果。其中，对于抗抑郁药氟伏沙明，当其浓度为100mg/l时，白翎芽孢杆菌对其的降解率能达到98％，当浓度达到400mg/l时，白翎芽孢杆菌对氟伏沙明的降解率也能够达到67％，说明白翎芽孢杆菌对氟伏沙明有着良好的降解效果；同时，对浓度分别为100mg/l、400mg/l的苯乙肼，白翎芽孢杆菌对其的降解效率也能达到97％和65％。此外，将白翎芽孢杆菌直接接种在含有氟伏沙明的生活废水中，在氟伏沙明的浓度为10mg/l
‑
30mg/l时，降解效率达到100％，当浓度为50mg/l时，72h降解效率也达到94％，说明将白翎芽孢杆菌直接接种至生活污水中，没有出现不降解或降解滞后的效应，从而，白翎芽孢杆菌在生活污水，特别是在医疗废水处理中具有较大的应用前景。
附图说明
[0029]
图1为实施例1中的白翎芽孢杆菌降解氟伏沙明试验结果图。
[0030]
图2为实施例2中的白翎芽孢杆菌降解苯乙肼的试验结果图。
[0031]
图3为实施例3中的白翎芽孢杆菌降解污水中的氟伏沙明实验结果图。
具体实施方式
[0032]
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
[0033]
实施例1采用本发明白翎芽孢杆菌降解培养基中的抗抑郁药氟伏沙明的方法
[0034]
1材料与仪器
[0035]
1.1材料
[0036]
菌种：本发明白翎芽孢不动杆菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心。
[0037]
氟伏沙明、苯乙肼：购自中国标准物质中心。
[0038]
1.2主要仪器
[0039]
wondasil c18柱，购自岛津技迩(上海)商贸有限公司。
[0040]
2试验方法
[0041]
菌种活化：挑取白翎芽孢杆菌菌株至lb液体培养基中，28℃，180r/min振荡培养
12h，然后连续划线，挑取单菌落培养两次(28℃)，挑取单菌落接种至lb斜面28℃培养24h小时备用。
[0042]
用无菌生理盐水洗下斜面上菌体并调整细胞浓度为108cfu/ml，制成种子液。
[0043]
将白领芽孢杆菌的种子液按5％接种量接种于含有100mg/l、200mg/l、400mg/l的氟伏沙明的lb液体培养基中，分装30ml/250ml锥形瓶，设接种5％无菌水为空白对照，28℃、108cfu/ml振荡培养。取样时间为0
‑
48h，期间每6h取样1瓶，作为样品进行检测。
[0044]
样品前处理及检测条件：从锥形瓶中取均匀培养液1ml至刻度管，用乙腈定容至10ml，混匀后于10000r/min离心10min，取上清液供液相色谱(hplc)分析用。
[0045]
测定条件：色谱柱为wondasil c18柱(150mm
×
4.60mm，5.0μm)；流动相为乙腈：水(85:15，v/v)，流速为1.0ml/min；紫外检测器，其波长为210nm，进样量10μl。
[0046]
3结果分析
[0047]
结果如图1和表1所示：
[0048]
表1白翎芽孢杆菌降解氟伏沙明试验结果
[0049][0050]
如图1和表1所示，本发明白翎芽孢杆菌降解100mg/l的氟伏沙明时，降解率可达98％，降解200mg/l的氟伏沙明，在30h的降解率达到80％，而且在48h时，还可达到88％；降解400mg/l的氟伏沙明时，降解率可达67％。
[0051]
试验结果表明，白翎芽孢杆菌可以有效降解抗抑郁药氟伏沙明，且降解速度快，降解率高。
[0052]
实施例2采用本发明白翎芽孢杆菌降解培养基中的抗抑郁药苯乙肼的方法
[0053]
本实施例除了降解的对象为苯乙肼，与实施例1不同之外，其余的实验条件和方法均与实施例1相同。试验结果如图2和表2所示。
[0054]
表2白翎芽孢杆菌降解苯乙肼的试验结果
[0055][0056]
如图2和表2所示，本发明白翎芽孢杆菌降解100mg/l的苯乙肼时，降解率可达97％，降解200mg/l的苯乙肼，在30h的降解率达到78％，而且在48h时，还可达到88％；降解400mg/l的苯乙肼时，降解率可达65％。
[0057]
实施例3采用白翎芽孢杆菌降解医院废水中的氟伏沙明
[0058]
1材料与仪器
[0059]
1.1材料
[0060]
菌种：本发明白翎芽孢不动杆菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心。
[0061]
氟伏沙明：购自中国标准物质中心。
[0062]
1.2主要仪器
[0063]
wondasil c18柱，购自岛津技迩(上海)商贸有限公司。
[0064]
2试验方法
[0065]
菌种活化：挑取白翎芽孢杆菌至lb液体培养基中，28℃，180r/min振荡培养12h，然后连续划线，挑取单菌落培养两次(28℃)，挑取单菌落接种至lb斜面28℃培养24h小时备用。
[0066]
用无菌生理盐水洗下斜面上菌体并调整细胞浓度为108cfu/ml，制成种子液。
[0067]
从苏州科技城医院取废水样品，添加氟伏沙明，使其质量浓度分别为50mg/l、30mg/l、20mg/l、10mg/l，将降解菌株的种子液按5％接种量接种(实验组)，设接种量5％无菌水为空白对照，28℃培养，每12h取样，用实施例1所述方法测定样品中氟伏沙明的残留量。
[0068]
通过hplc检测样品中氟伏沙明的残留量，空白污水样品中氟伏沙明含量变化较小，实验组的污水样品中氟伏沙明降解率如图3和表3所示。
[0069]
表3白翎芽孢杆菌降解污水中的氟伏沙明
[0070][0071][0072]
实验结果表明，白翎芽孢杆菌可以有效降解污水中的氟伏沙明，且降解速度快，降解率高。
[0073]
对比例1采用地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌降解培养基中的氟伏沙明
[0074]
1材料与实验仪器：地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌均购自北京北纳创联生物。其他实验用的材料与实验仪器均与实施例1相同。
[0075]
2实验方法
[0076]
菌种活化：分别挑取地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌至lb液体培养基中，180r/min振荡培养12h，然后连续划线，挑取单菌落培养两次(28℃)，挑取单菌落接种至lb斜面28℃培养24h小时备用。
[0077]
用无菌生理盐水洗下斜面上菌体并调整细胞浓度为108cfu/ml，制成种子液。
[0078]
分别将地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的种子液按5％接种量接种于含有100mg/l的氟伏沙明的lb液体培养基中，设接种5％无菌水为空白对照，分装30ml/250ml锥形瓶，28℃、108cfu/ml振荡培养。取样时间为24h和48h，作为样品进行检测。
[0079]
样品前处理及检测条件：与实施例1相同。
[0080]
结果分析：实验结果如表4所示。
[0081]
表4地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌降解氟伏沙明结果表
[0082]
菌种浓度24h降解率(％)48h降解率(％)地衣芽孢杆菌100mg/l
‑‑
解淀粉芽孢杆菌100mg/l
‑‑
[0083]
注：
“‑”
表示与空白对照组没有显著性差异。
[0084]
从表4的实验结果可以看出，地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌对于抗抑郁药氟伏沙明与空白对照相比没有显著性差异，说明地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌对于抗抑郁药物氟伏沙明没有降解效果。
[0085]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在不偏离本发明要求保护的精神和实质的前提下，可以对本发明的各个技术特征进行替代、修改和组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。