一种β-丙內酯残留量检测方法及其应用与流程

一种
β
‑
丙內酯残留量检测方法及其应用
技术领域
1.本发明属于生物制品领域，具体涉及一种β
‑
丙內酯残留量检验方法及其应 用。


背景技术：

2.人用狂犬病疫苗的生产过程中，β
‑
丙內酯对病毒具有很强的灭活作用，但其 本身具有刺激性，现有方法通常采用气相色谱法检测灭活后β
‑
丙內酯残留量，目 前该法检测β
‑
丙內酯残留量时的检测限能达8.96ppm，当样品β
‑
丙內酯残留量 低于8.96ppm时，检验结果出现假阴性，导致检测结果不够准确。而检测限越低 能够证明药品安全性越高，且现有方法中气相色谱法色谱峰中杂质峰较多，检测 结果不够准确。气相色谱杂质峰较多，会使检测结果受杂质峰影响。为解决现状， 亟需一种操作简便，准确率高且检测限低的方法。


技术实现要素：

3.本发明目的在于提供一种β
‑
丙內酯残留量检测方法及其应用，所述方法够准 确地分离出单一β
‑
丙內酯，减少其它杂质，从而降低β
‑
丙內酯检测限到1.95ppm， 操作简便。
4.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
5.本发明一方面提供一种β
‑
丙內酯残留量检验方法，其特征在于：采用气相色 谱
‑
质谱联用法，包括以下步骤：
6.(1)气相色谱
‑
质谱联用的条件和程序
7.所述气相色谱条件为：毛细管色谱柱为ab ffap，载体为he气，流速 1ml/min，汽化室温度250℃，进样量0.4ul；
8.所述质谱条件为：质谱离子源温度200℃；接口温度250℃；定量离子42amu；
9.程序为：先经气相色谱再经质谱，条件均为初始温度100℃，保持1min，以 20℃/min速率升温至180℃；
10.(2)绘制标准曲线，确定线性、检测限；
11.(3)待测样品β
‑
丙內酯水解残留量测定：将待测样品按照步骤(1)进样测 定，再通过步骤(2)的标准曲线计算β
‑
丙內酯含量。
12.进一步地，步骤(2)中，绘制标准曲线，确定线性、检测限采用以下方法： 精密称取β
‑
丙內酯100μl，加乙腈(色谱纯)900μl，得到稀释度为1：10的β
‑ꢀ
丙內酯，再用乙腈依次稀释成为1:100、1:1000、1:2000、1：4000、1:8000:、1:16000、 1：32000、1：64000、1:128000、1:256000、1：512000，取1:1000～1：512000 分别进样，进行气相色谱
‑
质谱联用法测定，再以β
‑
丙內酯含量为横坐标，峰面 积为纵坐标，绘制标准曲线，同时以乙腈作空白对照，将信噪比大于3的供试品 浓度确定为本方法的检测限。
13.检测待测样品时，将待测样品进行气相色谱
‑
质谱联用法测定，通过所述标 准曲线，计算待测样品的β
‑
丙內酯含量。
14.本发明另一方面还提供上述β
‑
丙內酯残留量检验方法在人用狂犬病疫苗的 生产工艺中的应用。在人用狂犬病疫苗生产工艺中，加入β
‑
丙內酯灭活，37℃水 浴水解2h。在检
测β
‑
丙內酯含量时，分别于水解前后取样，进行气相色谱
‑
质谱 联用法测定，再通过标准曲线，计算β
‑
丙內酯含量。
15.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
16.本发明提供的方法能够准确地分离出单一β
‑
丙內酯，该方法检测灵敏度更 高，能够降低β
‑
丙內酯检测限到1.95ppm，且样品用量少，结果准确度高，方法 准确可靠，操作简便，该方法能够更准确地监控β
‑
丙内酯残留。较好的解决了狂 犬病疫苗生产中β
‑
丙内酯残留量检测问题，提高了疫苗生产的安全性、质量可控 性，满足人用狂犬病疫苗(vero细胞)浓缩液中残留的β
‑
丙内酯检测的需要， 为病毒灭活工艺验证提供了依据。
附图说明
17.图1为本发明实施例1中标准曲线图。
具体实施方式
18.通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的 实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
19.【实施例1】
20.(1)气相色谱
‑
质谱联用
21.毛细管色谱柱为ab ffap；载体为he气，流速1ml/min；汽化室温度250℃； 进样量0.4ul。质谱离子源温度200℃；接口温度250℃；定量离子42amu。程序： 初始温度100℃，保持1min，以20℃/min速率升温至180℃。
22.(2)确定线性、检测限
23.精密称取β
‑
丙內酯100μl，加乙腈(色谱纯)900μl，得a液。再用乙腈依 次稀释成为1:100、1:1000、1:2000、1：4000、1:8000:、1:16000、1：32000、1： 64000、1:128000、1:256000、1：512000，详见下表1，取c～l分别进样，进行 气相色谱
‑
质谱联用法测定。以β
‑
丙內酯含量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制 标准曲线，同时以乙腈作空白对照，将信噪比大于3的供试品浓度确定为本方法 的检测限。
24.表1
25.编号稀释比例乙腈(ul)对照品溶液(ul)含量(ppm)a1:10900μl原液100μl——b1:100900μla 100μl——c1:1000900μlb 100μl1000d1:2000500μlc 500μl500e1:4000500μld 500μl250f1:8000500μle 500μl125g1:16000500μlf 500μl62.5h1:32000500μlg 500μl31.2i1:64000500μlh 500μl15.6j1:128000500μli 500μl7.8k1:256000500μlj 500μl3.9
l1:512000500μlk 500μl1.95
26.(3)待测样品β
‑
丙內酯水解残留量测定
27.选取3批人用狂犬病疫苗(vero细胞)浓缩液按1:4000比例加入β
‑
丙內酯 灭活，37℃水浴水解2h，分别于水解前后取样，10000r/min离心5min后，
‑
20℃ 保存备用，进行气相色谱
‑
质谱联用法测定，通过标准曲线，检测β
‑
丙內酯含量。
28.(4)检测结果
29.标准品检测值如下表，并绘制标准曲线，确定线性、检测限；
30.表2
31.序号稀释比例含量(ppm)峰面积11:400025022352421:800012511172531:1600062.55101341:3200031.22494951:6400015.61122161:1280007.8544671:2560003.9239081:5120001.951089
32.标准曲线图见图1。标准曲线：y＝901.77x
‑
2210.1，相关系数r2＝0.9996，检测限为 1.95ppm。三批浓缩液检验结果见下表：
33.表3
[0034][0035]
结果判定：用该方法检测人用狂犬病疫苗浓缩液(vero细胞)中β
‑
丙內酯 残留量，标准曲线r2＞0.999、检测限＝1.95ppm。三批人用狂犬病疫苗(vero细 胞)浓缩液批号为n201910023d034
‑
02、199sn20191001
‑
01、n201910024d035
‑
02， 按1:4000比例加入β
‑
丙內酯灭活、水解后，β
‑
丙內酯残留量均低于7.88ppm， 可以保证水解后β
‑
丙內酯残留量已降低至安全浓度7.88ppm以下。
[0036]
【实施例2】
[0037]
将现有技术与本技术技术通过三批人用狂犬病疫苗β
‑
丙內酯残留量检测进 行比对，比对结果如下：
[0038]
表4
[0039][0040][0041]
本技术采用气相色谱
‑
质谱联用法，以β
‑
丙內酯含量为横坐标，峰面积为纵 坐标，绘制标准曲线，确定为本方法的检测限为1.95ppm，三批人用狂犬病疫苗 (vero细胞)浓缩按1:4000比例加入β
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丙內酯灭活、水解后能够检测出β
‑
丙內 酯残留量分别为5.17ppm、3.80ppm、3.58ppm，均低于现有技术的检测限，且检 测结果低于β
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丙內酯安全浓度，有利于提高药品安全性。