一种小鼠原代肝脏枯否细胞的提取方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种简单易行具有普适性的小鼠原代肝脏枯否细胞的提取方法。


背景技术：

2.肝脏是一个重要的代谢器官，由多种细胞组成，其中肝实质细胞约占细胞总数的65％，肝脏内皮细胞、星状细胞、枯否细胞、肝脏相关淋巴细胞等非实质细胞占35％。同时肝脏也是重要的免疫活性器官，也被称为淋巴组织样器官，机体单核
‑
巨噬细胞90％在肝脏，肝脏内的枯否细胞是机体单核
‑
巨噬细胞的主要成分，占肝脏内细胞总数的25％；多数研究提取原代枯否细胞采用非灌流法即机械法将组织剪成小块再通过挤压、剪碎和震荡等机械手段使细胞从组织上脱落从而获得分离的细胞。另外一种非灌流法提取细胞是将肝脏组织剪碎后利用胶原酶或胰酶消化破坏细胞间的桥连或纤维成分进行细胞分离。但这种非灌流技术虽操作简单易行但分离细胞时往往存在着消化不完全、分离得到的细胞中存在多细胞团块等问题，不能很好地满足研究者所需。
3.1969年，berry和friend引入了灌流法提取原代细胞，灌流过程可使消化液与肝组织更加充分地接触，不仅提高了分离效率，还使分离所得细胞的活力和数量大大提升。灌流法已在多位研究者的努力改良下发展出了多种方法，如原位胶原酶灌注法、半原位胶原酶灌注法、离体胶原酶灌注法等。常用的是原位胶原酶灌注法，但该法依赖于蠕动泵，对于偶尔提取几次原代细胞进行研究的实验室来说，这无疑会造成实验设备的浪费，且往往因为静脉过细较难以实现理想的灌注效果。


技术实现要素：

4.本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种简单易行具有普适性的小鼠原代肝脏组织细胞的提取方法。
5.现有技术中，常参考大鼠原代肝脏细胞的提取方法，采用原位灌注胶原酶与蠕动泵结合，进行小鼠原代肝脏细胞的提取。由于小鼠门静脉非常细，采用蠕动泵时，灌注压力不易控制，且对于少量提取小鼠原代肝脏细胞的实验室来说，不依赖蠕动泵的提取方法更方便易行。
6.因此，本发明第一方面提供一种小鼠原代肝脏枯否细胞的提取方法，使用缓冲液从小鼠门静脉处原位灌注，从下腔静脉末端排出，肝脏颜色由暗红变为黄色后；使用胶原酶替换缓冲液进行灌注，胶原酶灌注时间维持6
‑
10min。
7.本发明提供的提取方法，简单易行，不依赖蠕动泵，灌注压力适中，且本发明在灌注过程中，不用考虑小鼠的生存状况，即灌注过程中，小鼠心脏保持跳动或停止跳动均不影响红细胞随着缓冲液排出。
8.本发明还发现，在实验中，由于小鼠门静脉直径很小，进行胶原酶灌注时，偶有注射器扎穿门静脉的情况出现。为了解决此问题，在本发明提供的提取方法中，采用缓冲液正
向原位灌注结合胶原酶逆向原位灌注消化肝脏组织；即在使用胶原酶灌注时，可以从下腔静脉处灌注，从门静脉处排出。
9.本发明发现，在进行胶原酶原位灌注时，除了可以采用胶原酶正向原位灌注(从门静脉灌注，从下腔静脉排出)，为了解决小鼠门静脉过细，原位灌注不好操作等缺陷，也可以采用胶原酶逆向灌注(下腔静脉处灌注，从门静脉处排出)。
10.本发明通过正向缓冲液原位灌注结合逆向胶原酶原位灌注的方法实现高活性高产率的细胞提取，为原代肝脏细胞提取提供一种新思路新途径。
11.基于此，本发明提供一种小鼠原代肝脏枯否细胞的提取方法，使用percoll分离液对采用上述提取方法消化后获得的肝脏组织进行梯度离心；所述percoll分离液为30％percoll和70％percoll。
12.具体地，在本发明提供的提取肝脏枯否细胞的方法中，所述梯度离心包括：
13.(1)对消化处理后的肝脏组织，离心35
‑
70g，3
‑
5分钟；
14.(2)收集上清，继续离心650g，5
‑
7分钟；
15.(3)弃上清，用hbss重悬沉淀，使用percoll分离液分离细胞，离心1800g，15
‑
20分钟，无制动；在启动离心机前，应先将离心机升速降速均调整到最低档，避免升降速度过快造成密度梯度破坏；
16.(4)取两个不同浓度percoll分离液的中间层细胞，用hbss重悬，离心650g，5
‑
7分钟。
17.本发明利用肝脏、门静脉和下腔静脉之间形成的闭合通路，再利用缓冲液正向灌注结合胶原酶正向或逆向灌注进行消化，而后通过多次离心便可提取获得高纯度高产量肝脏原代枯否细胞。
18.在本发明提供的提取肝脏枯否细胞的方法中，离心得到的细胞接种至六孔板后培养12
‑
16分钟后，弃去未贴壁细胞。本发明发现，由于肝脏枯否细胞易贴壁，培养12
‑
16分钟后，未贴壁细胞大多为非枯否细胞，此时弃去未贴壁细胞，会增加提取得到的枯否细胞的纯度。
19.在本发明提供的提取肝脏枯否细胞的方法中，离心温度为0
‑
4℃；在步骤(1)、步骤(2)或步骤(4)中，离心机选择最大制动。即在启动离心机前，应先将离心机升速降速均调整到最高档。
20.在本发明提供的提取肝脏枯否细胞的方法中，所述70％percoll溶液由7份100％percoll和3份1
×
pbs缓冲液配制而成；30％percoll溶液由3份100％percoll和7份1
×
pbs配制而成；所述100％percoll溶液由9份percoll原液和1份10
×
pbs缓冲液配制而成。
21.在本发明提供的提取肝脏枯否细胞的方法中，灌注前，将hbss缓冲液和胶原酶液置于35
‑
38℃水浴中预热4
‑
7分钟。
22.根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护上述的提取方法在小鼠肝脏组织细胞培养、以及在提高小鼠原代肝脏组织细胞纯度中的应用。
23.本发明的有益效果至少在于：
24.(1)本发明涉及到的仪器设备及耗材均为实验室常用，取材容易且成本较低；且本发明处理过程不用顾忌小鼠的生存状况。
25.(2)本发明能够在保证细胞纯度的基础上尽可能多地去除肝脏实质细胞，分离出
高得率的小鼠原代肝脏细胞。
26.(3)本发明经流式细胞术鉴定细胞纯度，将提取并洗涤纯化后的细胞经f4/80和cd11b流式抗体染色，经流式细胞仪检测，提取得到的小鼠原代肝脏枯否细胞的纯度单阳性达到98％以上。
附图说明
27.图1为本发明实施例1中分离得到的肝脏枯否细胞显微镜观察图。
28.图2为对本发明实施例1中分离得到的肝脏枯否细胞进行纯度检测的结果图。
29.图3为本发明实施例2中分离得到的肝脏枯否细胞显微镜观察图。
30.图4为对本发明实施例2中分离得到的肝脏枯否细胞进行纯度检测的结果图。
具体实施方式
31.以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
32.若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
33.本发明所用的小鼠均取自spf级动物房中健康的6
‑
8周龄、体重18
‑
25克的c57bl/6雄性小鼠，用100毫升70％乙醇清洗后，在生物超净台内进行后续试验。
34.以下实施例中采用的实验材料、仪器：
35.主要试剂耗材：健康小鼠、胶原酶ⅳ(invitrogen)、含ca
2 1×
hbss溶液(macgene)、1
×
pbs(macgene)、10
×
pbs(macgene)、percoll原液(ge health)、0.4％(w/v)台盼蓝溶液(sciencell)、rpmi 1640培养液(hyclone)、胎牛血清(gibco)、双抗(macgene)、异氟烷(rwd life science co.)、剪刀、镊子、医用胶带、一次性输液器、50ml/15ml尖头离心管(corning)、六孔板(corning)、血细胞计数器，0.22μm滤膜、一次性注射器(20ml)、一次性200目细胞筛网(falcon)。
36.主要仪器：细胞培养箱(thermo fisher)；台式离心机(thermo fisher)；37℃恒温培养箱(太仓市科教仪器厂)；生物超净台(sw
‑
cj
‑
1fd,苏州净化设备有限公司)；光学显微镜(奥林巴斯ckx41)；电热恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；不同规格微量移液器(thermo fisher)。
37.实施例1
38.本实施例提供高效获取小鼠肝脏枯否细胞的方法，步骤如下：
39.(1)准备两个50ml灭菌处理过的小口玻璃瓶，一瓶装40ml无菌hbss，另一瓶装40ml 0.04％(w/v)胶原酶ⅳ(由含ca
2
的1
×
hbss配制)，于37℃恒温水浴锅中加热后将两瓶倒置挂于生物超净台旁的高处备用。
40.(2)打开一次性输液器的进液端针头插入装有hbss的瓶中，打开输液器控制阀使液体充满输液器管道排出气泡，而后关闭控制阀固定输液器备用。
41.(3)配制100％percoll(9份percoll原液 1份10
×
pbs)、70％percoll(由1
×
pbs配制)、30％percoll溶液(由1
×
pbs配制)。
42.(4)称重。
43.(5)腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)使小鼠处于深度麻醉状态。
44.(6)将小鼠用酒精消毒后固定于托盘内，剪取一小段医用胶带固定小鼠四肢，在距后腿1
‑
2cm处中间位置剪一缺口而后沿小鼠身体边缘剪开至胸廓将皮肤掀起漏出全部肝脏组织。
45.(7)轻轻拨动小鼠脏器寻找下腔静脉和门静脉。
46.(8)将一次性输液器针头缓缓插入小鼠门静脉，用手保持此位置不动避免出针。
47.(9)打开输液器控制阀，开至1/2处即可，而后剪开下腔静脉末端，之后再将控制阀开至最大。
48.(10)灌注hbss至肝脏颜色由暗红变黄色后改为灌注胶原酶，持续灌注8分钟。
49.(11)灌注消化结束后，取下肝脏组织用pbs将外面覆盖的血冲掉并置于装有0.02％胶原酶ⅳ的无菌10cm培养皿中。
50.(12)用镊子轻轻搅动肝脏，直至变成溶液。
51.(13)而后用200目筛网过滤细胞悬液，滤后悬液放置于两个50ml离心管中，加hbss配平。
52.(14)35g，4℃条件下离心3分钟，最大制动。
53.(15)收上清至新的50ml离心管，加hbss配平，650g，4℃条件下离心7分钟，最大制动。
54.(16)弃上清，用微量移液器吸取10ml hbss轻轻重悬沉淀。
55.(17)在新的50ml离心管中依次轻铺(自上而下)70％percoll、30％percoll、重悬沉淀。
56.(18)1800g，4℃条件下离心15分钟，注意将离心机升速降速均调整到低档(升2降1)再进行离心。
57.(19)离心结束后弃最上层和最下层，留30％percoll和70％percoll交界处细胞并移至新的50ml离心管中，用hbss重悬后在650g，4℃条件下离心7分钟，最大制动。
58.(20)离心结束弃上清，用1ml rpmi
‑
1640细胞培养基重悬沉淀，取10μl悬液和10μl 0.4％台盼蓝混匀进行细胞计数和活力鉴定。
59.(21)以合适密度将细胞铺在六孔细胞培养板中，于细胞培养箱中培养15分钟后换液移去未贴壁细胞，加入新鲜培养基于细胞培养箱中培养大于24小时，进行下一步实验。
60.在倒置显微镜下对枯否细胞进行观察发现，刚分离出来的细胞呈现圆形，饱满且透亮度好(20倍物镜)，且含有的杂质较少。培养几天后细胞生长状态依然良好，见图1；根据流式细胞术测定的数据分析得到的的图像(图2)，可以观察到分离的枯否细胞纯度可双阳性高达91.4％，单阳性高达99％。
61.实施例2
62.本实施例与实施例1相同，提供高效获取小鼠肝脏枯否细胞的方法，区别在于，在步骤(10)中，当肝脏颜色由暗红变黄色后，将一次性输液器针头缓缓插入下腔静脉，改为逆向灌注胶原酶，胶原酶从门静脉排出，持续灌注8分钟。
63.在倒置显微镜下对枯否细胞进行观察发现，培养几天后细胞生长状态依然良好，见图3；根据流式细胞术测定的数据分析得到的的图像(见图4)。小鼠肝脏枯否细胞提取量维持在5
×
106‑8×
106个，可以观察到分离的枯否细胞纯度可双阳性高达89.7％，单阳性高
达98％。
64.实施例3
65.本实施例提供高效获取小鼠原代肝细胞的方法，包括以下步骤：
66.(1)准备两个50ml灭菌处理过的小口玻璃瓶，一瓶装40ml无菌hbss，另一瓶装40ml 0.04％(w/v)胶原酶ⅳ(由含ca
2
的1
×
hbss配制)，于37℃恒温水浴锅中加热后将两瓶倒置挂于生物超净台旁的高处备用。
67.(2)打开一次性输液器的进液端针头插入装有hbss的瓶中，打开输液器控制阀使液体充满输液器管道排出气泡，而后关闭控制阀固定输液器备用。
68.(3)配制100％percoll(9份percoll原液 1份10
×
pbs)、70％percoll(由1
×
pbs配制)、30％percoll溶液(由1
×
pbs配制)。
69.(4)称重。
70.(5)腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)使小鼠处于深度麻醉状态。
71.(6)将小鼠酒精消毒后固定于托盘内，剪取一小段医用胶带固定小鼠四肢，在距后腿1
‑
2cm处中间位置剪一缺口而后沿小鼠身体边缘剪开至胸廓将皮肤掀起漏出全部肝脏组织。
72.(7)轻轻拨动小鼠脏器寻找下腔静脉和门静脉。
73.(8)将一次性输液器针头缓缓插入小鼠门静脉，用手保持此位置不动避免出针。
74.(9)打开输液器控制阀，开至1/2处即可，而后剪开下腔静脉末端，之后再将控制阀开至最大。
75.(10)灌注hbss至肝脏颜色由暗红变黄色后改为灌注胶原酶，持续灌注8分钟。
76.(11)灌注消化结束后，取下肝脏组织用pbs将外面覆盖的血冲掉并置于装有0.02％胶原酶ⅳ的无菌10cm培养皿中。
77.(12)用镊子轻轻搅动肝脏，直至变成溶液。
78.(13)而后用200目筛网过滤细胞悬液，滤后悬液放置于两个50ml离心管中，加hbss配平。
79.(14)35g，4℃条件下离心3分钟，最大制动。
80.(15)收集沉淀，加入hbss重悬沉淀，35g，4℃条件下再次离心3分钟，最大制动。
81.(16)离心结束弃上清，用1ml rpmi
‑
1640细胞培养基重悬沉淀，取10μl悬液和10μl 0.4％台盼蓝混匀进行细胞计数和活力鉴定。
82.(17)以合适密度将细胞铺在六孔细胞培养板中，于细胞培养箱中培养过夜后换液移去未贴壁细胞，加入新鲜培养基于细胞培养箱中培养大于24小时，进行下一步实验。
83.在倒置显微镜下对肝细胞进行观察发现，刚分离出来的细胞呈现圆形，饱满且透亮度好(20倍物镜)，且含有的杂质较少。贴壁培养几天后细胞呈圆形，生长状态依然良好。
84.对比例1不同离心条件
85.本对比例1与实施例1相同，区别在于，本对比例中的离心条件是：
86.(1)50g，3分钟，4℃，吸取上清至新的50ml离心管中。
87.(2)550g，5分钟，4℃，弃上清，hbss重悬沉淀。
88.(3)在新的50ml离心管中依次轻铺(自上而下)70％percoll、30％percoll、重悬沉淀。
89.(4)800g，4℃条件下离心15分钟，注意将离心机升速降速均调整到低档(升2降1)再进行离心。
90.(5)离心结束后弃最上层和最下层，留30％percoll和70％percoll交界处细胞并移至新的50ml离心管中，用rpmi重悬进行计数铺板活力鉴定等。
91.在离心结束后，分层处未出现明显的细胞层。
92.对比例2
93.本对比例与实施例2相同，仅在胶原酶灌注消化结束后再用0.02％胶原酶ⅳ进行体外37℃消化15
‑
30分钟而后再进行过滤离心等操作。结果发现细胞计数时细胞量明显增多，但培养15分钟后换液发现贴壁细胞反而减少，说明增加酶消化时间造成了明显的细胞损伤，不必进行灌注后的体外消化。
94.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。