通用逆转录引物及miRNA的cDNA合成方法、合成试剂盒和miRNA检测方法与流程

技术特征：
1.一种通用逆转录引物，其核苷酸序列由以下通式(i)表示：r
‑
(dt)
n
‑
vn
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(i)其中，r为所述通用逆转录引物的5’端序列，其核苷酸序列如seq id no:1所示；vn为所述通用逆转录引物的3’端序列，其中v表示腺嘌呤残基、鸟嘌呤残基或胞嘧啶残基，n表示腺嘌呤残基、鸟嘌呤残基、胞嘧啶残基或胸腺嘧啶残基；(dt)
n
为所述通用逆转录引物的中间部分，表示n个连续的胸腺嘧啶残基，其中n为8
‑
20内的任意整数。2.根据权利要求1所述的通用逆转录引物，其核苷酸序列如seq id no:2所示。3.一种mirna的cdna合成方法，其包括在同一反应体系和同一反应条件下进行的以下反应步骤：s1：mirna加poly(a)尾反应：以mirna为靶标，以atp为反应原料，在poly(a)聚合酶的催化下，进行加poly(a)尾反应；s2：逆转录合成cdna反应：以步骤s1获得的已加poly(a)尾的mirna为靶标，利用权利要求1或2提及的通用逆转录引物，在逆转录酶的催化下，合成cdna。4.根据权利要求3所述的cdna合成方法，其中所述反应体系包含：10
‑
100mm tris
‑
hcl ph 8.3、20
‑
100mm nacl、10
‑
100mm kcl、1
‑
20mm mgcl2、5
‑
50mm dtt、1
‑
20nm权利要求1或2提及的通用逆转录引物、0.1
‑
1mm atp、0.1
‑
5u/μl poly(a)聚合酶、5
‑
50u/μl逆转录酶、0.1
‑
1.0mm dntp；所述反应条件为：37℃
‑
42℃保温20
‑
60min，随后65℃
‑
90℃保温5
‑
20min。5.一种mirna的cdna合成试剂盒，其包含权利要求1或2所述的通用逆转录引物；优选地，所述cdna合成试剂盒还包含用于进行mirna合成cdna反应的成分：atp、poly(a)聚合酶、逆转录酶、dntp和反应缓冲液，其中所述反应缓冲液包含tris
‑
hcl ph 8.3、nacl、kcl、mgcl2和dtt；进一步优选地，所述cdna合成试剂盒在使用时各成分在cdna合成反应体系中的浓度分别为：10
‑
100mm tris
‑
hcl ph 8.3、20
‑
100mm nacl、10
‑
100mm kcl、1
‑
20mm mgcl2、5
‑
50mm dtt、1
‑
20nm权利要求1或2提及的通用逆转录引物、0.1
‑
1mm atp、0.1
‑
5u/μlpoly(a)聚合酶、5
‑
50u/μl逆转录酶、0.1
‑
1.0mm dntp。6.一种通用扩增反向引物，其核苷酸序列由以下通式(ii)表示：p
‑
r
ꢀꢀꢀꢀ
(ii)其中，p为所述通用扩增反向引物的5’端序列，表示切刻内切酶的酶切位点及其保护性碱基，其中所述切刻内切酶的酶切位点选自seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6中的任一种；r为所述通用扩增反向引物的3’端序列，其核苷酸序列如seq id no:1所示；优选地，所述通用扩增反向引物的核苷酸序列如seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9和seq id no:10中的任一种所示。7.一种多核苷酸，其核苷酸序列如seq id no:1所示。8.一种定量检测mirna的方法，其在权利要求3或4提及的cdna合成方法的基础上还包括：s3：以步骤s2逆转录合成的cdna为模板进行rt
‑
sda和/或rt
‑
pcr定量检测；其中用于扩增cdna模板的反向引物为权利要求6提及的通用扩增反向引物。
9.一种mirna检测试剂盒，其包含权利要求1或2所述的通用逆转录引物和权利要求6所述的通用扩增反向引物。10.根据权利要求1或2所述的通用逆转录引物、权利要求3或4所述的cdna合成方法、权利要求5所述的cdna合成试剂盒、权利要求6所述的通用扩增反向引物、权利要求8所述的定量检测mirna的方法或权利要求9所述的mirna检测试剂盒，其中所述mirna选自以下中的一种或多种：真核生物的循环mirna、组织mirna、总rna和人工合成的mirna分子。

技术总结
本发明公开一种通用逆转录引物及miRNA的cDNA合成方法、合成试剂盒和miRNA检测方法。提供的通用逆转录引物的5’端为适用于SDA等温扩增和PCR变温扩增的通用扩增引物结合序列，因此利用该通用逆转录引物由miRNA合成的cDNA不仅适用于SDA等温检测miRNA的体系中，还可同时适用于PCR变温检测miRNA的体系中，因此可以实现SDA等温和PCR变温同时检测同一miRNA的目的，有效提高miRNA定量结果的准确性。提供的cDNA合成方法可在同一反应体系和同一反应条件下同步实现miRNA加poly(A)尾和逆转录反应，整个反应时间较短，可以实现快速合成cDNA的目的。的。的。


技术研发人员：赵俊 朱灵 杨柯 朱灿灿 汪磊 花昌义 邓国庆 刘勇
受保护的技术使用者：合肥中科易康达生物医学有限公司
技术研发日：2021.07.29
技术公布日：2021/11/4