L-谷氨酸亚适量高产菌株及其构建方法与NH与流程

no.5481)的dna为模板，将基因组中的通道蛋白ncgl1221与过表达质粒pxt01重连在一起，使其与质粒一起过量表达，获得ncgl1221过表达菌株gkg
‑
047(pxt01/ncgl1221)，其中所述基因ncgl1221序列为seqidno.1，所述pxt01的序列为序列表seqidno.4所示序列。
11.优选的，上述l
‑
谷氨酸亚适量高产菌株的构建方法，具体步骤如下：
12.(1)再生基因片段ncgl1221的制备：以谷氨酸棒杆菌gkg
‑
047菌体(cgmccno.5481)的dna为模板，使用引物ncgl1221f和ncgl1221r进行pcrncgl1221片段(其中ncgl1221f和ncgl1221r的5’端分别加入限制性内切酶kpnⅰ和ecorⅰ的线性载体同源序列，kpnⅰ序列为ggtacc，ecorⅰ序列为gaattc)，所述引物ncgl1221f的序列为序列表seqidno.2所示序列，引物ncgl1221r的序列为序列表seqidno.3所示序列；
13.(2)过表达重组质粒的构建：对过表达质粒pxt01用kpnⅰ和ecorⅰ进行双酶切线性化，然后将再生的基因片段ncgl1221与线性化后的pxt01进行同源重组连接，构成过表达重组质粒，所述pxt01的序列为序列表seqidno.4所示序列；
14.(3)将过表达重组质粒化转至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，涂布于0.05μg/ml(kan50)浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落；摇管培养，并提取出重组质粒pxt01(ncgl1221)；
15.(4)将重组质粒导入到谷氨酸棒杆菌gkg
‑
047的感受态菌株中；
16.(5)将提出的重组质粒pxt01(ncgl1221)电转到谷氨酸棒杆菌gkg
‑
047的感受态菌株中并涂布于0.05μg/ml(cm50)浓度的氯霉素抗性平板，32℃培养24小时；挑选单菌落进行pcr，琼脂糖凝胶电泳检验pcr片段长度是1590
‑
1620，即为导入重组质粒后的目的菌株gkg
‑
047(pxt01/ncgl1221)，同时将挑选出的菌株用体积分数为20％的甘油保藏。
17.上述菌株gkg
‑
047(pxt01/ncgl1221)保藏于
‑
80℃冰箱中。
18.一种nh
4
分阶段控制发酵方法，具体步骤如下：
19.(1)菌体活化：将gkg
‑
047(pxt01/ncgl1221)接种到斜面培养基上传代活化，传代两次，所述斜面培养基为蛋白胨5g/l，牛肉膏10g/l，酵母粉4g/l，kh2po41g/l，mgso40.2g/l，nacl1g/l，琼脂粉25g/l，ph＝6.8
‑
7.0；
20.(2)种子培养：将活化好的菌株用无菌水洗脱，洗脱后全部接种到配置好的种子培养基中进行种子培养，所述种子培养基为：葡萄糖40g/l，玉米浆干粉10g/l，kh2po42.5g/l，mgso4·
7h2o0.8g/l，mnso45mg/l，feso45mg/l，v
h
10mg/l；种子培养条件为：温度维持在34℃，溶氧控制在20
‑
40％，ph通过氨水控制在7.0
‑
7.2；
21.(3)发酵培养：当种子培养基中的菌体量(od
600
)达到40以上时，按20％的接种量接种到发酵培养基中，发酵条件为：发酵温度维持在34℃，溶氧控制在20
‑
40％，发酵前中期ph通过氨水控制在7.0
‑
7.2，发酵后期采用流加naoh和氨水混合液调节ph，维持在7.0
‑
7.2，所述发酵培养基为葡萄糖60g/l，玉米浆30g/l，豆浓20ml/l，kh2po42.5g/l，mgso4·
7h2o1.2g/l，kcl1g/l，mnso410mg/l，feso410mg/l，v
h
3mg/l，v
b1
0.5mg/l。
22.优选的，上述nh
4
分阶段控制发酵方法，所述发酵后期为发酵18
‑
26h。
23.优选的，上述nh
4
分阶段控制发酵方法，所述发酵后期为发酵22h。
24.优选的，上述nh
4
分阶段控制发酵方法，所述naoh和氨水混合液的混合比例为1:1
‑
9。
25.优选的，上述nh
4
分阶段控制发酵方法，所述naoh和氨水混合液的混合比例为1:7。
26.有益效果：
27.基因ncgl1221编码谷氨酸运输蛋白，其具有机械敏感通道蛋白活性，谷氨酸主要通过该蛋白以被动扩散的方式分泌出细胞，将基因ncgl1221与过表达质粒pxt01连接，形成过表达重组质粒，通过这种方法使得谷氨酸机械敏感通道蛋白过量表达，实现谷氨酸棒杆菌能够高效分泌谷氨酸，从而降低胞内谷氨酸浓度，保证菌体活力及产酸能力不被高浓度谷氨酸所抑制，实现谷氨酸产量的提升。
28.nh
4
分阶段控制发酵方法，通过对菌体所处的不同阶段进行分析，从而对不同阶段的nh
4
的浓度进行阶段性控制，解除了nh
4
对于菌体活力以及产酸能力的抑制，提高了菌体量以及谷氨酸产量，对于整个行业的发酵精细化控制提供了建设性意见。
附图说明
29.图1为过表达质粒ptx01的质粒图；
30.图2为过表达质粒ptx01(ncgl1221)的质粒图。
31.保藏说明
32.生物材料(株)：gkg
‑
047；分类命名谷氨酸棒杆菌corynebacteriumglutamicum
33.保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
34.保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
35.保藏日期：2011年11月22日
36.保藏编号：cgmcc no.5481
具体实施方式
37.实施例1
38.将基因组中的通道蛋白ncgl1221与过表达质粒pxt01重连在一起，使其与质粒一起过量表达,获得ncgl1221过表达菌株 gkg
‑
047(pxt01/ncgl1221)。其中所述基因ncgl1221序列为seq id no.1.
39.(1)再生基因片段ncgl1221的制备。以谷氨酸棒杆菌gkg
‑
047菌体 (cgmcc no.5481)的dna为模板，使用引物ncgl1221f和ncgl1221r进行 pcr ncgl1221片段(其中ncgl1221f和ncgl1221r的5’端分别加入限制性内切酶kpnⅰ和ecorⅰ的线性载体同源序列，其中，kpnⅰ序列为ggtacc， ecorⅰ序列为gaattc)。
40.(2)过表达重组质粒的构建。对过表达质粒pxt01(如图1所示)用 kpnⅰ和ecorⅰ进行双酶切线性化，然后将再生的基因片段ncgl1221与线性化后的pxt01进行同源重组连接，构成过表达重组质粒。
41.(3)将过表达重组质粒化转至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，涂布于 0.05μg/ml(kan50)浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落；摇管培养，并提取出重组质粒pxt01(ncgl1221)(如图2所示)；
42.(3)将重组质粒导入到谷氨酸棒杆菌gkg
‑
047的感受态菌株中。
43.(4)将提出的重组质粒pxt01(ncgl1221)电转到谷氨酸棒杆菌gkg
‑
047 的感受态菌株中并涂布于0.05μg/ml(cm50)浓度的氯霉素抗性平板，32℃培养24小时；挑选单菌落进行pcr，琼脂糖凝胶电泳检验pcr片段长度是 1590
‑
1620，即为导入重组质粒后的目的菌株
gkg
‑
047(pxt01/ncgl1221)，同时将挑选出的菌株用体积分数为20％的甘油保藏；
44.5l发酵罐验证实验：
45.(1)菌体活化：将保藏在
‑
80℃冰箱中的gkg
‑
047(pxt01/ncgl1221)接种到斜面上传代活化，传代两次。所述斜面培养基为蛋白胨5g/l，牛肉膏10g/l，酵母粉4g/l，kh2po41g/l，mgso40.2g/l，nacl1g/l，琼脂粉25g/l，ph＝6.8
‑
7.0；
46.(2)种子培养：将活化好的菌株用无菌水洗脱，洗脱后全部接种到配置好的种子培养基中进行种子培养。种子培养基为：葡萄糖40g/l，玉米浆干粉10g/l，kh2po42.5g/l，mgso4·
7h2o0.8g/l，mnso45mg/l，feso45mg/l，v
h
10mg/l。种子培养条件为：温度维持在34℃左右，溶氧控制在20
‑
40％，ph通过氨水控制在7.0左右。
47.(3)发酵培养：当种子培养基中的菌体量(od
600
)达到40以上时，按20％的接种量接种到发酵培养基中，发酵条件为：度维持在34℃左右，溶氧控制在20
‑
40％，ph通过氨水控制在7.0左右。发酵培养基为葡萄糖60g/l，玉米浆30g/l，豆浓20ml/l，kh2po42.5g/l，mgso4·
7h2o1.2g/l，kcl1g/l，mnso410mg/l，feso410mg/l，v
h
3mg/l，v
b1
0.5mg/l。
48.实施例2
49.nh
4
分阶段控制发酵策略：
50.(1)菌体活化：将保藏在
‑
80℃冰箱中的gkg
‑
047(pxt01/ncgl1221)接种到斜面上传代活化，传代两次。所述斜面培养基为蛋白胨5g/l，牛肉膏10g/l，酵母粉4g/l，kh2po41g/l，mgso40.2g/l，nacl1g/l，琼脂粉25g/l，ph＝6.8
‑
7.0；
51.(2)种子培养：将活化好的菌株用无菌水洗脱，洗脱后全部接种到配置好的种子发酵液中进行种子培养。种子培养基为：葡萄糖40g/l，玉米浆干粉10g/l，kh2po42.5g/l，mgso4·
7h2o0.8g/l，mnso45mg/l，feso45mg/l，v
h
10mg/l。种子培养条件为：温度维持在34℃左右，溶氧控制在20
‑
40％，ph通过氨水控制在7.0左右。
52.(3)发酵培养：当种子培养基中的菌体量(od
600
)达到40以上时，按20％的接种量接种到发酵培养基中，发酵条件为：度维持在34℃左右，溶氧控制在20
‑
40％，发酵前中期ph通过氨水控制在7.0左右，发酵22h采用流加naoh和氨水(比例1:7)混合液调节ph，并维持在7.0
‑
7.2。发酵培养基为葡萄糖60g/l，玉米浆30g/l，豆浓20ml/l，kh2po42.5g/l，mgso4·
7h2o1.2g/l，kcl1g/l，mnso410mg/l，feso410mg/l，v
h
3mg/l，v
b1
0.5mg/l。
53.实施例3
54.参照实施例2，不同之处在于，发酵18h采用流加naoh和氨水混合液调节ph。
55.实施例4
56.参照实施例2，不同之处在于，发酵26h采用流加naoh和氨水混合液调节ph。
57.实施例5
58.参照实施例2，不同之处在于，流加的naoh和氨水混合液的混合比例为1:1。
59.实施例6
60.参照实施例2，不同之处在于，流加的naoh和氨水混合液的混合比例为1:3。
61.实施例7
62.参照实施例2，不同之处在于，流加的naoh和氨水混合液的混合比例为1:5。
63.实施例8
64.参照实施例2，不同之处在于，流加的naoh和氨水混合液的混合比例为1:9。
65.实施例9
66.参照实施例2，不同之处在于，所用菌株为gkg
‑
047。
67.表1实施例生物量、l
‑
谷氨酸产量和糖酸转化率对比指标
[0068][0069]
通过对实施例1和实施例2的对比分析可以发现，对谷氨酸通道蛋白 ncgl1221进行过表达后，菌体产酸提高了5.6％，糖酸转化率提高了0.4％，结果表明通过加强通道蛋白的表达，谷氨酸分泌加强，胞内反馈抑制减弱，从而谷氨酸产量得以提高。通过对实施例2、实施例3和实施例4的对比分析发现，随着naoh和氨水的混合溶液开始流加时间的退后，三者的最终菌体量逐渐下降，说明随着流加时间的退后，菌体活力下降越多，降低nh
4
所带来的正面效应就越小。通过实施例2、实施例5、实施例6、实施例7和实施例8的实验结果进行分析，结果显示，随着混合比例的降低，谷氨酸产量先是明显提高，之后又出现了下降趋势。出现这种现象的原因是因为,当混合比例较高时，nh
4
的浓度仅能维持菌体生长，因此菌体几乎不产谷氨酸，当混合比例下降时，nh
4
的补充使得α
‑
酮戊二酸能够还原氨基化，从而谷氨酸得以产生，但当nh
4
的浓度过高时，菌体活力被抑制，菌体裂解死亡现象加重，菌体产酸能力和谷氨酸产量下降严重。因此，综合考虑，当发酵进行到22h开始流加比例为1:7的naoh和氨水混合液调节ph时，效果最好，最终菌体量为70.8，l
‑
谷氨酸产量为177g/l，糖酸转化率为68.2％。
[0070]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。