用于产生糖蛋白、鉴定糖基化途径的平台的制作方法

技术特征：
1.一种用于在体外对肽或多肽序列进行糖基化的无细胞系统，所述肽或多肽序列包含天冬酰胺残基，并且所述系统包含以下组分：(i)糖基转移酶，其是催化将单糖转移至天冬酰胺残基的氨基以提供n
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连接的聚糖的n
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糖基转移酶(ngt)，或在无细胞蛋白质合成(cfps)反应混合物中表达ngt的表达载体；(ii)包含单糖供体任选地单糖的糖基化混合物；其中所述肽或多肽序列在体外在所述糖基化混合物中被糖基化以提供包含n
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连接的聚糖的肽或多肽序列。2.权利要求1的系统，其还包含以下组分：(iii)催化将单糖转移至n
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连接的聚糖的第二糖基转移酶，或在无细胞蛋白质合成(cfps)反应混合物中表达第二糖基转移酶的表达载体；其中所述糖基化混合物包含glc供体、gal供体、galnac供体、glcnac供体、丙酮酸供体、岩藻糖供体、唾液酸供体或其混合物，并且其中n
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连接的聚糖被选自glc、gal、galnac、glcnac、丙酮酸、fuc、sia和非天然糖的一种或多种部分糖基化。3.权利要求2的系统，其还包含以下组分：(iv)催化将单糖转移至n
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连接的聚糖的第三糖基转移酶，或在无细胞蛋白质合成(cfps)反应混合物中表达第三糖基转移酶的表达载体；其中所述糖基化混合物包含glc供体、gal供体、galnac供体、glcnac供体、丙酮酸供体、岩藻糖供体、唾液酸供体或其混合物，并且其中n
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连接的聚糖进一步被选自glc、gal、galnac、glcnac、丙酮酸、fuc、sia和叠氮基
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sia的一种或多种部分糖基化。4.权利要求1的系统，其中所述系统包含无细胞蛋白质合成(cfps)反应混合物，并且所述第一糖基转移酶、所述第二糖基转移酶和所述第三糖基转移酶中的一种或多种存在于或表达于所述cfps反应混合物中。5.权利要求1的系统，其中所述系统包含一种或多种无细胞蛋白质合成(cfps)反应混合物，并且所述第一糖基转移酶、所述第二糖基转移酶和所述第三糖基转移酶中的一种或多种存在于或表达于所述cfps反应混合物中并且所述一种或多种cfps反应混合物经组合以提供所述系统。6.权利要求1的系统，其还包含所述肽或多肽序列或表达所述肽或多肽序列的表达载体。7.权利要求1的系统，其还包含原核cfps反应混合物。8.权利要求1的系统，其还包含原核cfps反应混合物，所述原核cfps反应混合物包含从大肠杆菌制备的裂解物。9.权利要求1的系统，其中所述糖基转移酶是选自以下的细菌n
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连接的糖基转移酶(ngt)：胸膜肺炎放线杆菌(actinobacillus pleuropneumoniae)ngt(apngt)、大肠杆菌(escherichia coli)ngt(ecngt)、流感嗜血杆菌(haemophilus influenza)ngt(hingt)、溶血曼海姆菌(mannheimia haemolytica)ngt(mhngt)、杜雷嗜血杆菌(haemophilus dureyi)ngt(hdngt)、海藻百伯史坦菌(bibersteinia trehalosi)ngt(btngt)、嗜沫聚合杆菌(aggregatibacter aphrophilus)ngt(aangt)、小肠结肠炎耶尔森菌(yersinia enterocolitica)ngt(yengt)、鼠疫耶尔森菌(yersinia pestis)ngt(ypngt)和金格金氏杆菌(kingella kingae)ngt(kkngt)或其经修饰的形式。
10.权利要求1的系统，其中所述糖基转移酶是具有seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15、17或19中任一项的氨基酸序列或与seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15、17或19中任一项的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的细菌n
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连接的糖基转移酶(ngt)，或所述第一糖基转移酶是具有seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16、18或20中任一项的氨基酸序列或与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16、18或20中任一项的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的经修饰的细菌n
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连接的糖基转移酶(ngt)。11.权利要求2的系统，其中所述第二糖基转移酶是选自胸膜肺炎放线杆菌α1
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6葡萄糖基转移酶(apα1
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6)、淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)β1
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4半乳糖基转移酶lgtb(nglgtb)、脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis)β1
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4半乳糖基转移酶lgtb(nmlgtb)和脆弱拟杆菌(bacteriodes fragilis)β1
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3n
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乙酰半乳糖胺转移酶(bfgalnact)的α1
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6葡萄糖基转移酶、β1
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4半乳糖基转移酶或β1
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3n
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乙酰半乳糖胺转移酶。12.权利要求3的系统，其中所述第三糖基转移酶是选自以下的β1
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3n
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乙酰葡糖胺转移酶、丙酮酸转移酶、α1
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3岩藻糖基转移酶、α1
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2岩藻糖基转移酶、α1
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4半乳糖基转移酶、α1
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3半乳糖基转移酶、α2
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6唾液酸转移酶、α2
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3,6唾液酸转移酶、α2
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3唾液酸转移酶或α2
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3,8唾液酸转移酶：淋病奈瑟菌β1
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3n
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乙酰葡糖胺转移酶(nglgta)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)丙酮酸转移酶(sppvg1)、幽门螺杆菌(helicobacter pylori)α1
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3岩藻糖基转移酶(hpfuta)、幽门螺杆菌α1
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2岩藻糖基转移酶(hpfutc)、脑膜炎奈瑟菌α1
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4半乳糖基转移酶(nmlgtc)、牛α1
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3半乳糖基转移酶(btggta)、智人α2
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6唾液酸转移酶(hssiat1)、美人鱼发光杆菌(photobacterium damselae)α2
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6唾液酸转移酶(pdst6)、鳆发光杆菌(photobacterium leiognathid)α2
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6唾液酸转移酶(plst6)、多杀巴斯德氏菌(pasteurella multocida)α2
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3,6唾液酸转移酶(pmst3,6)、弧菌属(vibrio sp)jt
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faj
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16α2
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3唾液酸转移酶(vsst3)、明亮发光杆菌(photobacterium phosphoreum)α2
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3唾液酸转移酶(ppst3)、空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)α2
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3唾液酸转移酶(cjcst
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i)和空肠弯曲杆菌α2
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3,8唾液酸转移酶(cjcst
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ii)。13.权利要求1的系统，其中所述系统的一种或多种组分呈冻干形式。14.一种包含n
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连接的聚糖的肽或多肽序列，所述n
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连接的聚糖包含选自以下的部分：唾液酸化形式的乳糖、岩藻糖基化形式的乳糖、唾液酸化形式的lacnac(乳糖
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(聚)lacnac)、岩藻糖基化形式的lacnac(乳糖
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(聚)lacnac)、丙酮酸化的乳糖、丙酮酸化的lacnac(乳糖
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(聚)lacnac)、葡萄糖、聚α1,6
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连接的葡萄糖、用β1,3galnac修饰的葡萄糖、乳糖、用(聚)lacnac修饰的乳糖(乳糖
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(聚)lacnac)、用α1,4半乳糖修饰的乳糖、用寡唾液酸修饰的乳糖和αgal表位。14.一种经修饰的细菌细胞，其包含或表达权利要求1的系统的一种或多种组分。15.一种由权利要求14的经修饰的细胞制备的裂解物，其适用于无细胞蛋白质合成(cfps)反应。16.一种用于制备糖基化肽或多肽序列的方法，所述方法包括培养权利要求14的经修饰的细菌细胞，其中所述经修饰的细胞包含或表达肽或多肽序列和n
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连接的糖基转移酶。17.一种用于体外制备糖基化肽或多肽序列的方法，所述方法包括使在包含单糖供体的糖基化混合物中的包含天冬酰胺残基的肽或多肽序列与糖基转移酶反应，所述糖基转移
酶是催化将单糖从单糖供体转移至天冬酰胺残基的氨基以提供n
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连接的聚糖的n
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糖基转移酶(ngt)，其中所述肽或多肽序列在体外在所述糖基化混合物中被糖基化以提供包含n
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连接的聚糖的肽或多肽序列。18.权利要求17的方法，其中所述肽或多肽序列在第一cfps反应混合物中表达，所述ngt在第二cfps反应混合物中表达，并且所述方法包括将第一cfps反应混合物和第二cfps反应混合物组合。19.权利要求17的方法，其还包括使包含聚糖的肽与第二糖基转移酶反应，并且所述第二糖基转移酶催化将单糖转移至n
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连接的聚糖，其中所述糖基化混合物包含glc供体、gal供体、galnac供体、glcnac供体、丙酮酸供体、岩藻糖供体、唾液酸供体或其混合物，并且其中所述n
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连接的聚糖被选自glc、gal、galnac、glcnac、丙酮酸、fuc、sia和非天然糖的一种或多种部分糖基化。21.权利要求20的方法，其中所述肽或多肽序列在第一cfps反应混合物中表达，所述ngt在第二cfps反应混合物中表达，并且所述第二糖基转移酶在第三cfps反应混合物中表达，并且所述方法包括组合第一cfps反应混合物、第二cfps反应混合物和第三反应混合物中的两种或更多种。22.权利要求19的方法，其还包括使包含聚糖的肽与第三糖基转移酶反应并且所述第三糖基转移酶催化将单糖转移至n
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连接的聚糖，其中所述糖基化混合物包含glc供体、gal供体、galnac供体、glcnac供体、丙酮酸供体、岩藻糖供体、唾液酸供体或其混合物，并且其中所述n
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连接的聚糖进一步被选自glc、gal、galnac、glcnac、丙酮酸、fuc、sia和非天然糖的一种或多种部分糖基化。23.权利要求22的方法，其中所述肽或多肽序列在第一cfps反应混合物中表达，所述ngt在第二cfps反应混合物中表达，所述第二糖基转移酶在第三cfps反应混合物中表达，所述第三糖基转移酶在第四cfps反应混合物中表达，并且所述方法包括组合第一cfps反应混合物、第二cfps反应混合物、第三反应混合物和第四反应混合物中的两种或更多种。24.权利要求14的经修饰的细菌细胞，其中所述细胞缺乏nana(唾液酸醛缩酶)。25.一种用于制备糖基化肽或多肽序列的系统，所述肽或多肽序列包含天冬酰胺残基，并且所述系统包含以下组分：(i)经修饰的细菌细胞，任选地，其中所述细菌细胞被修饰以表达外源糖基转移酶，所述外源糖基转移酶是催化将单糖转移至天冬酰胺残基的氨基以提供n
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连接的聚糖的n
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糖基转移酶(ngt)，或在无细胞蛋白质合成(cfps)反应混合物中表达ngt的表达载体；(ii)包含非天然糖供体的糖基化混合物，其任选地被添加到培养基中以用于生长经修饰的细菌细胞；其中所述肽或多肽序列在经修饰的细菌细胞中被糖基化以提供包含非天然糖的肽或多肽序列。26.一种用于制备糖基化肽或多肽序列的制备方法，所述方法包括在权利要求25的系统的经修饰的细菌细胞中表达肽或多肽序列，并对表达的肽或多肽序列进行糖基化。

技术总结
公开了用于体外和体内糖蛋白蛋白质合成的组分、系统和方法。特别地，所公开的组分、系统和方法涉及用于产生糖蛋白的模块化平台。本文公开的组分、系统和方法可用于在无细胞蛋白质合成(CFPS)和经修饰的细胞中合成糖蛋白和重组糖蛋白。重组糖蛋白。重组糖蛋白。


技术研发人员：M
受保护的技术使用者：西北大学
技术研发日：2020.01.27
技术公布日：2021/11/4