基于电弧等离子体的不饱和脂肪酸碳碳双键环氧化及定位方法与流程

1.本发明涉及质谱分析及医学分析领域，尤其涉及一种基于电弧等离子体的不饱和脂肪酸碳碳双键环氧化及定位方法。


背景技术：

2.脂质是构建生物膜的重要基础和有机体的重要能量来源，其中，不饱和脂肪酸含有一个或多个碳碳双键，是结构更复杂的不饱和脂质的组成部分。不饱和脂肪酸的水平和代谢通常与心血管疾病和神经系统疾病(例如阿尔茨海默病)相关。最近，相当多的研究发现分布在某些种类的癌细胞或组织中的不饱和脂肪酸的含量在发生变化，与健康人群存在显著性差异，其可能作为癌症诊断的潜在生物标志物。不同的不饱和脂肪酸双键异构体的存在，拥有和标志着不同的生物学意义。因此，更系统地鉴别和定量不饱和脂肪酸对于更深入地理解癌症病理学和脂质生物标志物的发现是非常必要的。
3.质谱作为高通量、可定性定量的分析测试方法，在脂质分子结构解析和脂质组学研究方面有着巨大优势，尤其是串联质谱技术，是脂质结构分析中最重要的手段之一。例如，公开号为cn112748199a的中国专利文献公开了一种基于液相色谱串联质谱的细胞脂质组学分析方法，在对细胞的溶液进行破碎后，添加同位素内标的标准品，得到第一混合液；再在第一混合液内加入两种提取液，涡旋混合后静置；静置后离心取上层有机相，干燥后用复溶溶液混合复溶，得到样品；再用超高效液相色谱
‑
质谱仪器对样品进行脂质组学数据采集；利用软件进行数据分析，得到分析结果。
4.但脂质中的碳碳双键难以在质谱cid模式下裂解，不利于不饱和脂肪酸碳碳双键的定位。
5.近年来，研究者尝试开发其他高能方法切断c＝c，例如，电子碰撞激发(eid)、高能碰撞激发分解(cad)、自由基诱导解离(rdd)和电荷远程解离(crf)等。这些方法确实在一定程度上实现了c＝c位置异构体的鉴定，但太高的能量往往使得脂质分子发生深度碎裂，谱图复杂，难以解析。因此，研究者又提出了甲氧汞化和烷基硫醇化等化学衍生反应方法，但这些方法大多需借助色谱技术分离，存在耗时较长、试剂消耗量大等缺点，无法实现对含脂肪酸样品的快速简便分析。
6.环氧化是碳碳双键的常见反应，形成的三元环结构张力较大，容易在质谱的cid模式下碎裂。因此，可尝试将脂质中的双键环氧化后碎裂，根据碎片离子对其结构进行分析，从而实现不饱和脂肪酸碳碳双键位置异构体的检测。
7.现有技术中也有一些研究致力于通过碳碳双键环氧化来定位并检测脂质分子，但需要辅助额外装置产生等离子体使其环氧化，无法做到使用同一装置使环氧化与离子化同步进行，所需成本高，检测效率低。


技术实现要素：

8.本发明提供了一种基于电弧等离子体的不饱和脂肪酸碳碳双键环氧化及定位方法，可使用同一装置使环氧化与离子化同步进行，所需成本低，检测效率高。
9.本发明的技术方案如下：
10.一种基于电弧等离子体的不饱和脂肪酸碳碳双键环氧化及定位方法，所基于的装置包括依次连通的敞开式电弧电离源、质量分析器和离子检测器；所述敞开式电弧电离源包括电弧发生器和样品探针，所述电弧发生器的两极连线的中点与质谱入口位于同一水平线上；
11.包括以下步骤：
12.(1)接通电弧发生器电源，使电弧发生器两极产生稳定的电弧等离子体；
13.(2)采用样品探针蘸取待测不饱和脂肪酸样品，将样品探针前端置于电弧发生器的两极之间与质谱入口之间，不饱和脂肪酸中的碳碳双键被等离子体诱导生成环氧化产物，热解吸电离后进入质量分析器和离子检测器，实现不饱和脂肪酸的碳碳双键定位和检测分析。
14.在本发明中，通过常压电弧电离(ambient electric arc ionization，aeai)离子源产生电弧等离子体，使待测不饱和脂肪酸样品的碳碳双键被环氧化，再通过热解吸电离，得到单氧化或多氧化脂肪酸离子；对其单氧化离子进行cid碎裂，由得到的碎片离子信息可推断不饱和脂肪酸的结构及双键位置。本发明中环氧化不饱和脂肪酸碳碳双键与其离子化同步进行，具有操作简便、环氧化及离子化效率高、检测快速高效、无需引入额外辅助气体或装置、受样品基质干扰小等特点。
15.优选的，电弧发生器的两极之间与质谱入口之间的距离为4～12mm。
16.优选的，样品探针前端与电弧发生器的距离为0.5～5mm；样品探针前端与质谱入口的距离为1～10mm。
17.优选的，样品探针与质谱仪锥孔中心线之间的角度为90～180
°
。
18.所述的样品探针为中空结构的玻璃毛细管或微量注射器等。
19.优选的，蘸有待测不饱和脂肪酸样品的样品探针前端在电弧发生器的两级之间与质谱入口之间停留的时间为0～10s。
20.所述的待测不饱和脂肪酸样品为含有不饱和脂肪酸的有机溶液、水溶液、血清、血液、基质样品中的至少一种。
21.优选的，所述的待测不饱和脂肪酸样品为含有不饱和脂肪酸的有机溶液、水溶液或简单基质样品时，所述的样品探针为玻璃毛细管；玻璃毛细管的前端与电弧发生器的距离为0.5～3mm；玻璃毛细管的前端与质谱入口的距离为1～10mm；玻璃毛细管与质谱仪锥孔中心线之间的角度为90～180
°
。
22.优选的，所述的待测不饱和脂肪酸样品为含有不饱和脂肪酸的血清、血液或复杂基质样品时，所述的样品探针为微量注射器；微量注射器的前端与电弧发生器的距离为1～5mm；微量注射器的前端与质谱入口的距离为1～10mm；微量注射器与质谱仪锥孔中心线之间的角度为90～180
°
。
23.优选的，所述的不饱和脂肪酸为油酸、亚油酸、棕榈油酸、γ
‑
亚麻酸、顺
‑
11
‑
十八碳烯酸、花生四烯酸中的至少一种。
24.与现有技术相比，本发明具有如下显著性优势：
25.(1)无需样品前处理或只需很简单的样品前处理，可广泛应用于各动物血清中或含复杂基质样品中的不饱和脂肪酸含量测定；
26.(2)操作简便、检测快速，能在10s内完成，大大提高检测效率；
27.(3)电弧产生的等离子体可促进不饱和脂肪酸中双键的环氧化，集环氧化不饱和脂肪酸双键与离子化环氧化后所得的饱和脂肪酸为一体，氧化及离子化效率高、无需引入额外辅助气体或装置、受样品基质干扰小。
附图说明
28.图1.(a)为使用点样毛细管作为探针时的装置示意图；(b)为使用微量注射器作为探针时的装置示意图；图中：1为电弧发生器；2为质谱入口；3为点样毛细管；4为微量注射器；α1为探针与质谱仪锥孔中心线之间的角度；d1为探针尖端与电弧发生器之间的距离；d2为探针尖端与质谱入口之间的距离；
29.图2.(a)为使用该方法检测油酸的一级质谱图；(b)为cid模式下对m/z 297碎裂得到的二级质谱图(碰撞能量：25v)；
30.图3.油酸环氧化物在cid下产生诊断离子机理图；
31.图4.(a)使用该方法检测棕榈油酸的一级质谱图；(b)为cid模式下对m/z 269碎裂得到的二级质谱图(碰撞能量：30v)；
32.图5.棕榈油酸环氧化物在cid下产生诊断离子机理图；
33.图6.(a)使用该方法检测顺
‑
11
‑
十八碳烯酸的一级质谱图；(b)cid模式下对m/z 297碎裂得到的二级质谱图(碰撞能量：26v)；
34.图7.顺
‑
11
‑
十八碳烯酸环氧化物在cid下产生诊断离子机理图；
35.图8.(a)使用该方法检测亚油酸的一级质谱图；(b)cid模式下对m/z 295碎裂得到的二级质谱图(碰撞能量：25v)；
36.图9.亚油酸环氧化物在cid下产生诊断离子机理图；
37.图10.(a)使用该方法检测γ
‑
亚麻酸的一级质谱图；(b)cid模式下对m/z 293碎裂得到的二级质谱图(碰撞能量：22v)；
38.图11.γ
‑
亚麻酸环氧化物在cid下产生诊断离子机理图；
39.图12.(a)使用该方法检测花生四烯酸的一级质谱图；(b)cid模式下对m/z 319碎裂得到的二级质谱图(碰撞能量：25v)；
40.图13.花生四烯酸环氧化物在cid下产生诊断离子机理图。
具体实施方式
41.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
42.1.实验操作
43.如图1所示，一种基于电弧等离子体的不饱和脂肪酸碳碳双键环氧化及定位方法包括如下步骤：
44.(1)接通电弧发生器1的电源，调节变压器，使电弧发生器1两极产生稳定的电弧等
离子体；
45.(2)样品探针蘸取待测不饱和脂肪酸样品；
46.(3)蘸有待测样品的探针在离电弧较远的位置停留一会儿或不停留，待不饱和脂肪酸中的碳碳双键被等离子体诱导的环氧化产物形成，靠近电弧，样品热解吸电离后从质谱入口2进入质量分析器和离子检测器实现不饱和脂肪酸碳碳双键环氧化离子的检测分析。
47.上述方法所基于的装置可采用申请号为cn202011289117.8中公开的装置。
48.上述步骤(2)中样品探针为不同形态的玻璃点样毛细管3或微量注射器4。
49.上述步骤(2)中的样品包括但不限于不饱和脂肪酸的有机或水溶液、人或动物血清、血液及各种含有不饱和脂肪酸的简单或复杂基质样品。
50.上述步骤(2)中样品为不饱和脂肪酸的有机或水溶液、各种含有不饱和脂肪酸的简单基质样品时，样品探针为玻璃毛细管，尖端与电弧发生器距离为0.5～5mm，与质谱入口距离为1～10mm，毛细管尖端与质量分析器中心线之间的角度为90～180度，测量过程中靠近但不接触电弧或直接接触电弧等离子体区域，通过等离子体诱导的氧使毛细管中不饱和脂肪酸氧化、离子化同步进行，并形成带电喷雾进入质量分析器。
51.上述步骤(2)的样品为血清、血液或其他含有不饱和脂肪酸的复杂基质样品时，样品探针为微量注射器，尖端与电弧发生器距离为1～5mm，与质谱入口距离为1～10mm，针尖与质谱仪锥孔中心线之间的角度为90～180度，测量过程中使注射器针管距针尖1～3mm的位置搭在电弧上，通过等离子体使针尖样品碳碳双键环氧化，针尖传输热能和电荷使样品进一步热解吸并离子化，进而进入质量分析器。
52.上述步骤(3)中蘸有待测样品的探针在离电弧较远的位置停留的时间为0～10s。
53.2.实例分析
54.实例1
55.图2中(a)为使用该方法检测油酸的一级质谱图，可得到强烈的油酸[m
‑
h]
‑
(m/z 281.2472)峰和较强的[m o
‑
h]
‑
(m/z 297.2421)峰，对[m o
‑
h]
‑
(m/z 297)离子进行cid碎裂，可得到碎片离子峰：m/z 279.2314,m/z 171.1017,m/z 155.1060，其中m/z 279.2314为母离子丢失一分子水，其它离子为氧杂三元环结构的碎裂产生，如图2中(b)所示。氧杂三元环可以在左右两侧开环，分别生成一对结构互补的碎片。只有包含羧基的碎片带负电荷，能被质谱检测，另一个碎片呈电中性，无法被质谱捕捉。因此，m/z 171/155这一对诊断离子(图3)精确对应于油酸的δ9c＝c，对应油酸。
[0056]
实例2
[0057]
图4中(a)为使用该方法检测棕榈油酸的一级质谱图，可得到强烈的棕榈油酸[m
‑
h]
‑
(m/z 253.2175)峰和较强的[m o
‑
h]
‑
(m/z 269.2123)峰。对[m o
‑
h]
‑
(m/z 269)离子进行cid碎裂，可得到碎片离子峰：m/z 251.2016,m/z 225.2145,m/z 155.1077,m/z 171.1025，其中m/z 251.2016为母离子丢失一分子水，m/z 225.2145为母离子丢失一分子二氧化碳。其它离子为氧杂三元环结构的碎裂产生，如图4中(b)所示。氧杂三元环可以在左右两侧开环，分别生成一对结构互补的碎片。只有包含羧基的碎片带负电荷，能被质谱检测，另一个碎片呈电中性，无法被质谱捕捉。因此，m/z 171/155这一对诊断离子(图5)精确对应于棕榈油酸的δ9c＝c，对应棕榈油酸。
[0058]
实例3
[0059]
图6中(a)为使用该方法检测顺
‑
11
‑
十八碳烯酸的一级质谱图，可得到强烈的顺
‑
11
‑
十八碳烯酸[m
‑
h]
‑
(m/z 281.2486)峰和较强的[m o
‑
h]
‑
(m/z 297.2436)峰。对[m o
‑
h]
‑
(m/z 297)离子进行cid碎裂，可得到碎片离子峰：m/z 279.2331,m/z 199.1343,m/z 183.1389，其中m/z 279.2331为母离子丢失一分子水。其它离子为氧杂三元环结构的碎裂产生，如图6中(b)所示。氧杂三元环可以在左右两侧开环，分别生成一对结构互补的碎片。只有包含羧基的碎片带负电荷，能被质谱检测，另一个碎片呈电中性，无法被质谱捕捉。因此，m/z 199/183这一对诊断离子(图7)精确对应于顺
‑
11
‑
十八碳烯酸的δ11c＝c，对应顺
‑
11
‑
十八碳烯酸。
[0060]
根据实例1～3，显然，任何一对诊断离子的质量数均相差16da，此特征极大方便了诊断离子的定位。
[0061]
实例4
[0062]
图8中(a)为使用该方法检测亚油酸的一级质谱图，可得到强烈的亚油酸[m
‑
h]
‑
(m/z 279.2331)峰，较强的[m o
‑
h]
‑
(m/z 295.2281)峰及[m 2o
‑
h]
‑
(m/z 311.2231)峰。对[m o
‑
h]
‑
(m/z 295)离子进行cid碎裂，可得到碎片离子峰：m/z 277.2174,m/z 251.2383,m/z 195.1394,m/z 171.1027，其中m/z 277.2174为母离子丢失一分子水，m/z 251.2383为母离子丢失一分子二氧化碳。其它离子为氧杂三元环结构的碎裂产生，如图8中(b)所示。氧杂三元环可以在左右两侧开环，分别生成一对结构互补的碎片。只有包含羧基的碎片带负电荷，能被质谱检测，另一个碎片呈电中性，无法被质谱捕捉。另外，由于m/z 195的碎片离子，和m/z 171碎片离子对应的掉落片段，均为有两个碳碳双键相邻的共轭体系，使其结构更加稳定，则环氧化后的[m o
‑
h]
‑
离子在cid模式下更易形成m/z 195和m/z 171的碎片离子。因此，m/z 195和m/z 171这两个诊断离子(图9)分别对应于亚油酸的δ9和δ12c＝c，对应亚油酸。
[0063]
实例5
[0064]
图10中(a)为使用该方法检测γ
‑
亚麻酸的一级质谱图，可得到强烈的γ
‑
亚麻酸[m
‑
h]
‑
(m/z 277.2172)峰，较强的[m o
‑
h]
‑
(m/z 293.2130)峰、[m 2o
‑
h]
‑
(m/z 309.2069)峰及[m 3o
‑
h]
‑
(m/z 325.2021)峰。对[m o
‑
h]
‑
(m/z 293)离子进行cid碎裂，可得到碎片离子峰：m/z 275.2017,m/z 249.2224,m/z 193.1235,m/z 169.0869,m/z 153.0918，其中m/z 275.2017为母离子丢失一分子水，m/z 249.2224为母离子丢失一分子二氧化碳。其它离子为氧杂三元环结构的碎裂产生，如图10中(b)所示。氧杂三元环可以在左右两侧开环，分别生成一对结构互补的碎片。只有包含羧基的碎片带负电荷，能被质谱检测，另一个碎片呈电中性，无法被质谱捕捉；由于m/z 193的碎片离子为有两个碳碳双键相邻的共轭体系，使其结构更加稳定，则环氧化后的[m o
‑
h]
‑
离子在cid模式下更易形成m/z 193的碎片离子；与另外两个碳碳双键相比，δ9c＝c由于离羰基距离近，受空间位阻影响，不易被环氧化，导致m/z 113和m/z 129碎片离子未被检测到。另外，随着脂肪酸不饱和度的增加，环氧化产物在cid作用下中丢失co2的碎裂通路逐步占据主导地位，也抑制了诊断离子的生成。因此，m/z 193和m/z 169/153这三个诊断离子(图11)分别对应于γ
‑
亚麻酸的δ9和δ12c＝c，再综合一级质谱图分析结果，对应γ
‑
亚麻酸。
[0065]
实例6
[0066]
图12中(a)为使用该方法检测花生四烯酸的一级质谱图，可得到强烈的花生四烯酸[m
‑
h]
‑
(m/z 303.2330)峰，较强的[m o
‑
h]
‑
(m/z 319.2280)峰、[m 2o
‑
h]
‑
(m/z 335.2231)峰、[m 3o
‑
h]
‑
(m/z 351.2179)及[m 4o
‑
h]
‑
(m/z 367.2129)峰。对[m o
‑
h]
‑
(m/z 319)离子进行cid碎裂，可得到碎片离子峰：m/z 301.2173,m/z 275.2380,m/z 219.1401,m/z 179.1080，其中m/z 301.2173为母离子丢失一分子水，m/z 275.2380为母离子丢失一分子二氧化碳。其它离子为氧杂三元环结构的碎裂产生，如图12b所示。氧杂三元环可以在左右两侧开环，分别生成一对结构互补的碎片。只有包含羧基的碎片带负电荷，能被质谱检测，另一个碎片呈电中性，无法被质谱捕捉；由于m/z 219和m/z 179的碎片离子为有两个碳碳双键相邻的共轭体系，使其结构更加稳定，则环氧化后的[m o
‑
h]
‑
离子在cid模式下更易形成m/z219和m/z 179的碎片离子；与另外两个碳碳双键相比，δ5和δ8c＝c由于离羰基距离近，受空间位阻影响，不易被环氧化，导致m/z 139和155、m/z 99和115这两对碎片诊断离子未被检测到。另外，随着脂肪酸不饱和度的增加，环氧化产物在cid作用下中丢失co2的碎裂通路逐步占据主导地位，也抑制了诊断离子的生成。因此，m/z 219和m/z 179这两个诊断离子(图13)分别对应于花生四烯酸的δ11和δ14c＝c，再综合一级质谱图分析结果，对应花生四烯酸。
[0067]
综上，利用此方法可有效对不饱和脂肪酸中的碳碳双键进行定位，无论是单双键不饱和脂肪酸还是结构复杂的多双键不饱和脂肪酸，甚至是不饱和脂质，均可通过此方法准确检测。
[0068]
以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。