核苷磷脂类化合物及其化学合成方法和在核酸递送中的应用与流程

1.本发明涉及一种阴离子型两亲性核苷磷酸甘油烷基醚脂(简称“核苷磷脂”)类化合物及其化学合成方法。其能够自组装形成球形纳米结构，并通过氢键及π
‑
π堆叠作用与核酸碱基相结合，可用于多种寡核苷酸转染及递送。经化学修饰优化，本发明所获得的产品具有理化性质相对稳定、细胞膜穿透性良好等优点，能够广泛用于抗肿瘤、抗病毒核酸药物研究。本发明属于生物医药技术领域。


背景技术：

2.基因治疗因其特殊的作用机制及治疗潜力而受到广泛关注，目前已有8种反义寡核苷酸(asos)获得fda批准上市[annu.rev.med.2019,27(70),307
‑
321.brain.2020,143(2),407
–
429]。然而寡核苷酸具有较高的分子量、亲水性和电负性，导致其普遍难以穿透细胞膜[cell mol.life sci.2014,71(8),1417
‑
1438.org.biomol.chem.2017,15(24),5161
‑
5170]。为克服核酸跨膜障碍，多种载体被开发用于基因药物传递，如脂质体、聚合物、树状大分子、多肽、外泌体等(crit.rev.oncol.hematol.2016,98,159
‑
169)。虽然阳离子载体转染核酸效率较高，但是过量的阳离子易导致高细胞毒性、血清蛋白非特异性结合、生理条件下吸附循环过程中负电基团等问题[gene ther.1999,6(4),643
‑
650]，在临床应用中阳离子递送系统的生物安全性一直受到广泛质疑。
[0003]
将核苷类药物与亲脂性基团偶联，从而改善药物的脂水分配系数，能够增强细胞膜的通透性[eur.j.pharm.biopharm.2011,79(3),612
‑
620.j.control.release2010,147(2),163
‑
170]。在无明显毒副作用前提下，抑制多种癌细胞的增殖能力[chem.biodivers.2013,10(12),2235
‑
2246.int.j.pharm.2009,381(1),40
‑
48.chem.biodivers.2014,11(3),469
‑
482]。此外有研究表明，核苷(酸)脂质衍生物可高效插入到人工脂膜之中，用于脂质体表面功能化修饰或疏水性药物递送[chem.biodivers.2013,10(12),2209
‑
2220.j.org.chem.2015,11,913
‑
929]。该类脂材可以自聚集和官能化，以不同的水/乙醇比例形成多种多样的超分子结构[eur.j.med.chem.2012,57,429
‑
440.eur.j.pharm.biopharm.2015,96,89
‑
95.chem.commun.(camb)2015,51(3),469
‑
472]。因此在目前研究中，基于核苷磷脂的转染试剂广泛用于6
‑
羧基荧光素、ru(iii)盐、量子点(qds)等研究[acs appl.mater.inter.2013,5(13),6232
‑
6236.dalton.trans.2013,42(48),16697
‑
16708.mutat.res.2013,750(1
‑
2),129
‑
138]。
[0004][0005]
由于分子间氢键作用是核苷磷脂自组装的重要驱动力[int.j.pharm.2008,350(1
‑
2),330
‑
337]，核苷磷脂类递送系统在基因递送方面有许多突出特点(new j.chem.2013,37(4),1122
‑
1127)。有研究表明，月桂酰尿苷(lu)的碱基头部可通过氢键作用与核酸特异性或非特异性结合[colloids surf.b.biointerfaces 2016,137,203
‑
213.soft.matter.2015,11(10),1973
‑
1990.langmuir 2010,26(23),18415
‑
18423.colloids surf.b.biointerfaces 2011,82(2),277
‑
282]。此外，taib及其合作者研究发现，与天然的二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)双膜相比，核苷磷脂因额外的碱基相互作用而更加紧凑和有序[langmuir 2012,28(19),7452
‑
7460]。ceballos等人进一步将非天然核苷(3
‑
硝基吡咯)用作递送系统，探讨了核苷磷脂载体在sirna细胞转染方面的应用。实验发现该两亲性化合物可以高效递送sirna进入肿瘤细胞并抑制靶蛋白的表达，而对正常细胞不产生细胞毒性[bioconjugate chem.2009,20(2),193
‑
196]。与阳离子脂质体相比，阴离子核苷磷脂(dp
‑
cyt)可以更有效的压缩多聚核酸纳米结构[j.colloid interface sci.2012,365(1),184
‑
190]。更重要的是，钙离子(ca
2
)通过钙桥介导核苷磷脂(pop
‑
ade/popc)与单链核酸磷酸之间的相互作用[j.colloid interface sci.2012,373(1),57
‑
68]。基于核苷磷脂的复合脂质体(pop
‑
ade/popc/pope)包载dna后，可与细胞膜融合形成茎状(stalk
‑
like)结构，并在细胞内高效释放负载分子[nat.struct.mol.biol.2008,15(7),707
‑
713.soft.matter.2014,10(1),39
‑
43]。然而，这些研究仅探讨了特定核苷与核酸之间的相互作用关系，未能进一步探讨核苷脂材的结构对核酸转染效率的影响。本发明合成了一系列不同化学结构的核苷磷脂用于寡核苷酸递送研究，对理解核苷脂材
‑
核酸相互作用变化，药物的结合、释放过程意义重大。迄今未见核苷磷脂不同化学结构对核酸转染效率影响的具体研究。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的之一是提供一类带有不同电荷及功能化基团的新型核苷磷脂类化
合物；
[0007]
本发明的目的之二是提供上述核苷磷脂类化合物的化学合成方法；
[0008]
本发明的目的之三是提供上述核苷磷脂类化合物作为载体在寡核苷酸递送及癌症治疗上的应用。
[0009]
本发明上述目的是通过以下技术手段实现的：
[0010]
本发明一种核苷磷酸甘油烷基醚脂(简称“核苷磷脂”)类化合物，所述的化合物为由亲水性核苷头部及疏水性尾链构成的两亲性分子，所述的化合物的结构如下通式i或3j、3i所示：
[0011][0012]
其中，通式i化合物中，b选自鸟嘌呤(g)、腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)；
[0013]
x选自s、o或se；
[0014]
r1选自h、oh、f或ome；
[0015]
r2选自8
‑
25碳长度的饱和、不饱和脂肪链。
[0016]
其中，优选的，通式i化合物中，b选自胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)或尿嘧啶(u)。
[0017]
其中，优选的，通式i化合物中，r2选自c
12
h
25
、c
14
h
29
、c
16
h
33
、c
18
h
37
或c
18
h
35
。
[0018]
进一步的，本发明还提出了一种所述的核苷磷酸甘油烷基醚脂类化合物的化学合成方法，其是以以式(i)所示的不同类型核苷亚磷酰胺单体，与式(ii)所示的不同长度的2,3
‑
甘油
‑
脂肪醇醚发生取代反应；随后再利用式(iii)所示不同的氧化剂分别得到磷氧代、硫代、硒代中间体；然后分别在碱性、酸性条件下脱除氰乙氧基和苯甲酰基等及dmtr，得到阴离子型核苷磷酸甘油烷基醚脂类化合物。
[0019]
(i)
[0020]
b＝c
bz
，t，u，a
bz
,g
ibu
；r＝otbs,ome
[0021]
(ii)
[0022]
(iii)
[0023]
更进一步的，本发明还提出了所述的核苷磷酸甘油烷基醚脂类化合物在制备具有超分子纳米结构的载体中的应用。以及所述的核苷磷酸甘油烷基醚脂类化合物在核酸转染、递送及抗肿瘤药物研究中的应用。
[0024]
实验证明，本发明的核苷磷脂类化合物作为载体细胞毒性较低。该核苷磷脂类化合物包括阴离子型核苷磷脂，该类两亲性分子碱基头部可以与目标核酸的碱基间发生氢键及π
‑
π堆叠作用；疏水尾链间具有范德华力相互作用。该类分子可以在水溶液中自组装形成超分子纳米结构，并结合寡核苷酸。形成的纳米复合物可有效穿透细胞膜，实现负载核酸胞内释放并发挥其正常生物学功能。该新型载体是一类高效的生物材料，在核酸转染尤其是基因治疗领域具有极为广阔的应用前景。
[0025]
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
[0026]
1.本发明的核苷磷脂类化合物可以在水溶液中自组装形成超分子纳米结构，并通过waston
‑
crick氢键作用及π
‑
π堆叠作用与目标核酸相结合，提高核酸跨膜能力，具有广阔应用前景。
[0027]
2.本发明的核苷磷脂类化合物的合成方法简单、原料便宜易得、生物兼容性好，利于临床及工业转化，市场前景较大。
附图说明
[0028]
图1为化合物3m的合成路线；
[0029]
图2为化合物3a,3b,3c,3l的合成路线；
[0030]
图3为化合物3d,3e的合成路线；
[0031]
图4为化合物3f,3g的合成路线；
[0032]
图5为化合物3h的合成路；
[0033]
图6为化合物3i的合成路线；
[0034]
图7为化合物3j的合成路线；
[0035]
图8为化合物3k的合成路线；
[0036]
图9核苷磷脂与寡核苷酸退火前后cd光谱；
[0037]
图10为核苷磷脂在水溶液中的溶解性；
[0038]
图11为核苷磷脂自组装性质耗散动力学模拟；
[0039]
图12为核苷磷脂包载互补核酸的透射电子显微镜(tem)扫描图谱；
[0040]
a
‑
i.分别为tps12，tps14，tpo16，tpse16，fups16，ups16m，cps16，tps18'，tps18其中寡核苷酸浓度为1μm；核苷磷脂浓度为0.1mm；
[0041]
图13为1h nmr检测tps16/反义核酸复合物退火前后相互作用变化；
[0042]
溶液1：h2o:etoh:d2o(v:v:v,8:1:1)；溶液2:d2o:cd3od(v:v,9:1)；
[0043]
图14为核苷磷脂/寡核苷酸复合物抑制肿瘤细胞(mcf
‑
7/adr)增殖能力；
[0044]
a.反义核酸n
‑
g3139；b.阴性对照序列nc；
[0045]
图15为核苷磷脂/nc复合物对a549/txl、hek293t细胞毒性；
[0046]
图16为核苷磷脂/g3139复合物对mcf
‑
7/adr细胞中bcl
‑
2 mrna表达抑制；
[0047]
图17为核苷磷脂/g3139复合物在mcf
‑
7/adr细胞中的摄取能力；
[0048]
图18为核苷磷脂/g3139复合物在mcf
‑
7/adr细胞中的分布情况。
具体实施方式
[0049]
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将随着描述而清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。
[0050]
(一)核苷磷脂分子的合成
[0051][0052]
所有化合物3a(tps12)，3b(tps14)，3c(tps16)，3d(tpo16)，3e(tpse16)，3f(fups16)，3g(ups16m)，3h(cps16)，3i(iups16),3j(ltps16),3k(ups16o)，3l(tps18')，3m(tps18)的合成路线如图1
‑
8所示。
[0053]
[实施例1]化合物3a的合成
[0054]
将5'
‑
o
‑
(4,4'
‑
二甲氧基三苯基)
‑
2'
‑
脱氧胸苷
‑
3'
‑
o
‑
(2
‑
氰乙基
‑
n,n
‑
二异丙基)亚磷酰胺(化合物1a,300mg,0.4mmol)加入到20ml含1h
‑
四氮唑(40mg,0.571mmol)的无水乙腈中。在氩气保护下，将2,3
‑
十二醇
‑1‑
甘油醚(250mg,0.583mmol)加入到溶液中，室温搅拌3h。之后，加入二苯乙酰二硫化物(250mg,0.912mmol)，室温搅拌6h。tlc检测反应结束后，旋转蒸发去除溶剂，残留物重新溶解在甲胺/乙醇(33％，20ml)中，在室温下搅拌4h。然后，旋转蒸发去除溶剂，将残渣重新溶解于tfa/dcm(v:v,10％，20ml)中，0℃搅拌30min。以二氯甲烷/甲醇(v:v,20:1)为洗脱溶剂，柱层析纯化产物。得到白色固体(化合物3a,158mg,
nmr(400mhz,cdcl3)δ6.05(s,1h),4.98(s,1h),4.00(d,j＝70.3hz,5h),3.48(d,j＝60.2hz,9h),2.30(s,6h),1.80(s,3h),1.52(s,5h),1.25(s,48h),0.88(t,j＝6.5hz,6h)；hrms(esi
‑
ms)for c
45
h
85
n2o
10
p[m
‑
h]
‑
found 843.5854,calcd 843.5869.
[0061]
[实施例5]化合物3e的合成
[0062]
将5'
‑
o
‑
(4,4'
‑
二甲氧基三苯基)
‑
2'
‑
脱氧胸苷
‑
3'
‑
(2
‑
氰乙基
‑
n,n
‑
二异丙基)亚磷酰胺(化合物1a,300mg,0.4mmol)加入20ml含1h
‑
四氮唑(40mg,0.571mmol)的无水乙腈中。在氩气保护下，将2,3
‑
十六醇
‑1‑
甘油醚(300mg,0.556mmol)加入溶液中，室温搅拌3h。随后将硒/苯溶液(m:v,0.1g/ml5ml)加入溶液中，室温搅拌过夜。在此之后，旋转蒸发去除溶剂，将残留物重新溶解于甲胺/乙醇(33％，20ml)中，室温搅拌4h。然后，旋转蒸发去除溶剂，将残渣重新溶解于tfa/dcm(v:v,10％，20ml)中，在0℃搅拌30min。以二氯甲烷/甲醇(v:v,20:1)为洗脱溶剂，柱层析纯化产物。产物为黄色固体(化合物3e,66.9mg,0.079mmol)，产率为16％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ6.12(d,j＝24.0hz,1h),4.25
‑
3.34(m,14h),3.14(d,j＝7.2hz,1h),2.87(s,1h),2.46(s,2h),1.87(d,j＝25.8hz,5h),1.54(s,5h),1.39
‑
1.17(m,48h),0.88(t,j＝6.7hz,6h)；hrms(esi
‑
ms)for c
45
h
85
n2o9pse[m
‑
h]
‑
found 907.5073,calcd 907.5085.
[0063]
[实施例6]化合物3f的合成
[0064]
将5'
‑
o
‑
(4,4'
‑
二甲氧基三苯甲基)
‑
2'
‑
氟尿苷
‑
3'
‑
o
‑
(2
‑
氰基乙基
‑
n,n
‑
二异丙基)亚磷酰胺(化合物1b,282mg,0.370mmol)加入到20ml含1h
‑
四氮唑(52mg,0.743mmol)的无水乙腈中。氩气保护下，加入2,3
‑
十六醇
‑1‑
甘油醚(200mg,0.370mmol)，室温搅拌3h。再加入二苯乙酰二硫化物(224mg,0.817mmol)，室温搅拌6h。之后，旋转蒸发去除溶剂，残留物重新溶解在甲胺/乙醇(33％，20ml)中，在室温下搅拌4h。然后，旋转蒸发去除溶剂，将残渣重新溶解于tfa/dcm(v:v,10％，20ml)中，在0℃搅拌30min。以二氯甲烷/甲醇(v:v,20:1)为洗脱溶剂，柱层析纯化产物。得到白色固体(化合物3f,185mg,0.215mmol)，产率为58％的。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ5.76(s,1h),4.98(s,1h),3.70(dt,j＝46.3,37.7hz,14h),3.18(s,1h),2.85(s,1h),2.66(s,1h),1.54(s,4h),1.25(s,52h),0.88(t,j＝6.7hz,6h)；hrms(esi
‑
ms)for c
44
h
82
fn2o9ps[m
‑
h]
‑
found 863.5377,calcd 863.5390.
[0065]
[实施例7]化合物3g的合成
[0066]
将5'
‑
o
‑
(4,4'
‑
二甲氧基三苯甲基)
‑
2'
‑
o
‑
甲基尿苷
‑
3'
‑
o
‑
(2
‑
氰基乙基
‑
n,n
‑
二异丙基)亚磷酰胺(化合物1c,287mg,0.370mmol)加入到20ml含1h
‑
四氮唑(52mg,0.743mmol)的无水乙腈中，氩气保护下，加入2,3
‑
十六醇
‑1‑
甘油醚(200mg,0.370mmol)，室温搅拌3h，再加入二苯乙酰二硫化物(224mg,0.817mmol)，室温搅拌6h。之后，旋转蒸发去除溶剂，残留物重新溶解在甲胺/乙醇(33％,20ml)中，在室温下搅拌4h。然后，旋转蒸发去除溶剂，将残渣重新溶解于tfa/dcm(v:v,10％，20ml)中，在0℃搅拌30min。以二氯甲烷/甲醇(v:v,20:1)为洗脱溶剂，柱层析纯化产物。得到白色固体(化合物3g,195mg,0.222mmol)，产率为60％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ5.79(s,1h),4.90(s,1h),4.37
‑
3.23(m,17h),2.77(s,3h),1.54(s,4h),1.25(s,52h),0.88(t,j＝6.7hz,6h)；hrms(esi
‑
ms)for c
45
h
85
n2o
10
ps[m
‑
h]
‑
found 875.5573,calcd 875.5590.
[0067]
[实施例8]化合物3h的合成
[0068]
将5'
‑
o
‑
(4,4'
‑
二甲氧基三苯基)
‑
n4
‑
苯甲酰基
‑
2'
‑
脱氧胞苷
‑
3'
‑
o
‑
(2
‑
氰乙基
‑
n,n
‑
二异丙基)亚磷酰胺(化合物1d,772mg,1.0mmol)加入40ml含1h
‑
四氮唑(140mg,2.0mmol)的无水乙腈中。在氩气保护下，加入2,3
‑
十六醇
‑1‑
甘油醚(864mg,1.6mmol)，室温搅拌3h，再加入二苯乙酰二硫化物(604mg,2.204mmol)，室温搅拌6h。之后，旋转蒸发去除溶剂，残留物重新溶解在甲胺/乙醇(33％，20ml)中，在室温下搅拌4h。然后，旋转蒸发去除溶剂，将残渣重新溶解于tfa/dcm(v:v,10％，20ml)中，在0℃搅拌30min。以二氯甲烷/甲醇(v:v,20:1)为洗脱溶剂，柱层析纯化产物。产物为白色固体(化合物3h,448mg,0.530mmol)，产率53％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.84(s,1h),6.07(s,2h),4.95(s,1h),4.38
‑
2.92(m,15h),2.64(s,1h),1.54(s,4h),1.25(s,52h),0.87(t,j＝6.8hz,6h)；hrms(esi
‑
ms)for c
44
h
85
n3o8ps[m
‑
h]
‑
found 844.5631,calcd 844.5644.
[0069]
[实施例9]化合物3i的合成
[0070]
在氩气保护下，将5'
‑
o
‑
(4,4
‑
二甲氧基三苯甲基)
‑
2'
‑
o,4'
‑
亚甲基
‑
胸苷
‑
3'
‑
o
‑
(2
‑
氰基乙基
‑
n,n
‑
二异丙基)亚磷酰胺(化合物1e,287mg,0.371mmol)加入20ml含1h
‑
四氮唑(52mg,0.743mmol)的无水乙腈中。加入2,3
‑
十六醇
‑1‑
甘油醚(200mg,0.370mmol)，室温搅拌3h，再加入二苯乙酰二硫化物(224mg,0.817mmol)，室温搅拌6h。之后，旋转蒸发去除溶剂，残留物重新溶解在甲胺/乙醇(33％，20ml)中，在室温下搅拌4h。然后，旋转蒸发去除溶剂，将残渣重新溶解于tfa/dcm(v:v,10％，20ml)中，在0℃搅拌30min。以二氯甲烷/甲醇(v:v,20:1)为洗脱溶剂，柱层析纯化产物。产物为白色固体(化合物3i,187mg,0.211mmol)，收率57％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.75(s,1h),5.59(s,1h),4.62(d,j＝29.6hz,2h),3.95(s,5h),3.45(dd,j＝60.3,31.8hz,10h),2.98(s,2h),2.78(s,3h),1.91(s,3h),1.54(s,4h),1.25(s,48h),0.88(t,j＝6.8hz,6h)；hrms(esi
‑
ms)for c
46
h
85
n2o
10
ps[m
‑
h]
‑
found 887.5587,calcd 887.5590.
[0071]
[实施例10]化合物3j的合成
[0072]
将5'
‑
o
‑
(4,4'
‑
二甲氧基三苯基)
‑
2'
‑
异尿苷
‑
3'
‑
o
‑
(2
‑
氰乙基
‑
n,n
‑
二异丙基)亚磷酰胺(化合物1f,260mg,0.353mmol)加入到20ml含1h
‑
四氮唑(30mg,0.429mmol)无水乙腈中。在氩气保护下，将2,3
‑
十六醇
‑1‑
甘油醚(243mg,0.450mmol)加入溶液中，室温搅拌3h，再加入二苯乙酰二硫化物(250mg,0.912mmol)，搅拌6h。之后，旋转蒸发去除溶剂，残留物重新溶解在甲胺/乙醇(33％，20ml)中，在室温下搅拌4h。然后，旋转蒸发去除溶剂，将残渣重新溶解于tfa/dcm(v:v,10％，20ml)中，在0℃搅拌30min。以二氯甲烷/甲醇(v:v,20:1)为洗脱溶剂，柱层析纯化产物。得到白色固体(化合物3j,138mg,0.187mmol)，产率为53％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ5.73(s,1h),5.07(s,2h),4.02(d,j＝119.0hz,7h),3.70
‑
3.30(m,11h),1.53(s,4h),1.25(s,52h),0.88(t,j＝6.8hz,6h)；hrms(esi
‑
ms)for c
44
h
83
n2o9ps[m
‑
h]
‑
found 845.5478,calcd 845.5484.
[0073]
[实施例11]化合物3k的合成
[0074]
将5'
‑
o
‑
(4,4
‑
二甲氧基三苯甲基)
‑
2'
‑
o
‑
[(叔丁基)二甲基硅基]尿苷
‑
3'
‑
o
‑
(2
‑
氰基乙基
‑
n,n
‑
二异丙基)亚磷酰胺(化合物1g,300mg,0.348mmol)加入到20ml含1h
‑
四氮唑(45mg,0.643mmol)的无水乙腈中。氩气保护下，将2,3
‑
十六醇
‑1‑
甘油醚(300mg,0.555mmol)加入溶液中，搅拌3h，再加入二苯乙酰二硫化物(250mg,0.912mmol)室温搅拌6h。之后，旋转蒸发去除溶剂，残留物重新溶解在甲胺/乙醇(33％,20ml)中，在室温下搅拌4h。然后，旋转蒸发去除溶剂，将残渣重新溶解于含氟四丁基铵(tbaf,280mg,1.071mmol)的
dcm(20ml)中，室温下搅拌，然后加入tfa(2.0ml)，在0℃搅拌30min。以二氯甲烷/甲醇(v:v,20:1)为洗脱溶剂，柱层析纯化产物。得到白色固体(化合物3k,60mg,0.070mmol)，产率为20％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ5.81(d,j＝46.4hz,1h),4.96(s,1h),4.12(dd,j＝14.3,7.1hz,1h),3.76
‑
3.31(m,14h),3.16(d,j＝3.9hz,1h),2.84(d,j＝20.6hz,1h),2.04(s,1h),1.55(s,3h),1.46
‑
1.35(m,1h),1.35
‑
1.07(m,52h),0.88(t,j＝6.8hz,6h)；hrms(esi
‑
ms)for c
44
h
83
n2o
10
ps[m
‑
h]
‑
found 861.5429,calcd 861.5433.
[0075]
[实施例12]化合物3l的合成
[0076]
在氩气保护下，将将5'
‑
o
‑
(4,4'
‑
二甲氧基三苯基)
‑
2'
‑
脱氧胸苷
‑
3'
‑
o
‑
(2
‑
氰乙基
‑
n,n
‑
二异丙基)亚磷酰胺(化合物1a,744mg,1mmol)加入到100ml圆底烧瓶中，加入40ml无水乙腈搅拌均匀后加入1h
‑
四氮唑(140mg,2mmol)以及2,3
‑
十八醇
‑1‑
甘油醚(500mg,0.84mmol),室温反应3h。加入二硫化二苯乙酰(604mg,2mmol)继续反应6h。随后旋转蒸发除去溶剂，加入甲胺醇溶液40ml室温反应4h。蒸干溶剂，并将残留物重新溶解于tfa/dcm(v:v,10％,40ml)溶液中。冰浴条件下反应0.5h，所得溶液旋干并将残留物用dcm/meoh(v:v,20:1)体系进行硅胶柱层析分离纯化。得白色固体(化合物3l,310mg,0.34mmol)，产率为40.5％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.68(dd,j＝12.0,8.9hz,1h),6.97(d,j＝8.6hz,1h),6.19(dt,j＝8.2,4.4hz,1h),5.30(s,1h),5.06(s,1h),4.08
‑
3.45(m,13h),2.65
‑
2.20(m,2h),2.04(s,3h),1.63
‑
1.49(m,4h),1.35
‑
1.13(m,60h),0.87(t,j＝6.7hz,6h).(esi
‑
ms)for c
49
h
93
n2o9ps[m
‑
h]
‑
found 915.6263,calcd 916.6339.
[0077]
[实施例13]化合物3m的合成
[0078]
在氩气保护下，将5'
‑
o
‑
(4,4'
‑
二甲氧基三苯基)
‑
2'
‑
脱氧胸苷
‑
3'
‑
o
‑
(2
‑
氰乙基
‑
n,n
‑
二异丙基)亚磷酰胺(化合物1a,633mg,0.84mmol)，1h
‑
四氮唑(120mg,1.7mmol)加入到50ml茄形瓶中，加入30ml无水乙腈搅拌均匀后加入2,3
‑
油醇
‑1‑
甘油醚(400mg,0.675mmol),室温反应6h。后加入二苯乙酰二硫化物(513.4mg,1.7mmol)继续反应6h。随后旋转蒸发除去溶剂，加入甲胺醇溶液20ml室温反应4h。蒸干溶剂，并将残留物重新溶解于30ml3％tca溶液中，室温反应0.5h，所得溶液旋干并将残留物用dcm/meoh(v:v,20:1)体系进行硅胶柱层析分离纯化。得透明油状物(化合物3m,420mg,0.46mmol)，产率为67.7％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.71
‑
7.52(m,1h),6.18(d,j＝6.2hz,1h),5.50
‑
5.25(m,4h),5.18
‑
4.91(m,1h),4.09
‑
3.84(m,4h),3.70
‑
3.40(m,7h),2.61
‑
2.53(m,1h),2.46
‑
2.37(m,1h),2.13
‑
1.86(m,11h),1.55(q,j＝6.9hz,4h),1.36
‑
1.23(m,48h),0.92
‑
0.87(m,6h).hrms(esi
‑
ms)for c
49
h
89
n2o9ps[m
‑
h]
‑
found 911.5958,calcd 912.6026.
[0079]
(二)核苷磷脂脂质体的制备及性质表征
[0080]
将tps16等核苷磷脂溶于无水乙醇中，制得10mm母液。随后将所需核苷磷脂与目标核酸混合，在pcr上执行退火程序(95℃,5分钟；
‑
5℃/5分钟；25℃，30分钟)，用于以下实验：
[0081]
[实施例14]圆二色谱检测
[0082]
首先用高纯氮气吹扫jascoj610光谱仪5min，再将核苷磷脂/寡核苷酸复合物溶解在溶于0.2mlpbs(138mm nacl,2.7mm kcl,10mm na2hpo4,1.76mm kh2po4,ph7.2
‑
7.4)当中。利用光谱仪检测溶液再不同波长下的椭圆度变化。波长范围200
‑
400nm，每0.5nm检测数值。数据用origin6.0进行平滑处理作图。
[0083]
图9显示cd光谱吸收峰变化与核苷磷脂结构相关。tps16、tps18等吸收峰变化较
大，说明该类载体与寡核苷酸退火处理后相互作用较强，引起核酸二级结构明显改变。
[0084]
[实施例15]粒径电位检测
[0085]
按照核苷磷脂、核酸物质的量分别为45nmol，0.5nmol制备纳米复合物。随后用liposo fast
‑
basic lf
‑
1挤出器(avestin,canada)均质化处理。之后采用malvern zetasizer nano
‑
zs型激光散射粒径测定仪对复合物的平均水合粒径、多分散系数和zeta表面电位进行统计学分析。采用10mw he
‑
ne激光(633nm)进行激发，散射角为90
°
，温度为25℃。数据利用els
‑
8000软件分析处理。
[0086]
表1显示复合物经由挤出器处理后可以形成50
‑
200nm尺寸的纳米结构。随着脂质体疏水尾链的延长(tps12，tps14，tps16，tps18)，纳米复合物粒径增加，表面负电性降低；此外，硫代磷脂(tps16)表面负电性显著低于氧代(tpo16)结构，说明磷硫骨架修饰有助于提高核苷磷脂的跨膜能力。
[0087]
表1核苷磷脂/多聚核酸复合纳米结构的电位、粒径
[0088][0089]
[实施例16]透射电子显微镜(tem)检测
[0090]
核苷磷脂(5nmol)及核酸(0.056nmol)复合物溶于0.1ml水中，利用负染色法进行样本处理。将样本滴加到para膜上，并覆盖一层铜网透明薄膜。1
‑
2min后移除薄膜，并用吸水纸移除边缘液体。随后，铜网用1％乙酸双氧铀染色1min，利用jem
‑
1400plus透射电子显微镜(jeol，japan)进行考察。
[0091]
图12显示核苷磷脂与寡核苷酸形成的纳米复合物均呈现均一球状纳米颗粒，但是颗粒大小存在一定差异，随着核苷磷脂尾链的增长，脂质复合物的颗粒度也呈现变大趋势，与dls实验结果一致。
[0092]
[实施例17]核磁溶液构象分析
[0093]
1.取60nmol反义核酸n
‑
g3139加入到1.5mlep管中，加入0.36ml氘水溶解；再取tps16(1.08μmol)溶解于0.04ml氘代甲醇溶液中，溶液合并转移到核磁管，利用600mhz核磁(bruker，germany)分析退火前1h
‑
nmr；将液体取出转移至pcr仪中，执行退火程序(快速升温至90℃，每5min降低5℃直至温度降低到4℃)，检测退火后1h
‑
nmr。
[0094]
2.取60nmol反义核酸n
‑
g3139加入到1.5ml ep管中，加入0.04ml氘水以及0.32ml ddh2o溶解；再取tps16(1.08μmol)溶解于0.04ml乙醇溶液中，溶液合并转移到核磁管，其余
操作同上，考察tps16与n
‑
g3139退火前后氢键变化。
[0095]
图13显示在水/乙醇溶液条件下(v/v，8/1，加入10％重水，溶液1)核苷磷脂与核酸复合物退火前后7.0
‑
7.6位移值发生了明显改变，说明二者存在特异性相互作用；将溶液替换为重水/氘代甲醇(v/v，9/1，溶液2)后差异性消失，可能因为氢交换作用使得核苷磷脂与核酸复合物氢键不能检测到，提示tps16与核酸可能以氢键作用方式相结合。
[0096]
[实施例18]核苷磷脂自组装性质计算模拟
[0097]
采用耗散动力学模拟(dpd)方法模拟核苷磷脂在水溶液(w:v，1:20)中的自组装性质。首先将分子划分为若干原子构成的基本单元，这些基本单元之间可以发生相互作用。分子片段模型利用materials studio 5.5(accelrys inc.，usa)软件中的“发现”“无定型晶格”模块进行构建，flory
–
huggins任意两个片段之间相互作用参数χ
ij
可以用如下公式表示
[i]
：
[0098][0099]
其中i和j分别代表不同片段的溶解度参数，v
ref
代表两个片段的平均分子体积，r代表气体常数，t代表温度。不同片段之间dpd相互作用参数(α
ij
)可以用如下公式表示：
[0100]
α
ij
＝25 3.27χ
ij
[0101]
模拟体系包含核苷磷脂以及水分子在一个大小的周期性排列的晶胞中。为了获得稳定状态，共模拟100000次dpd步骤，单次模拟用时0.05ps。
[0102]
图11显示各载体均可在95％水溶液中自组装形成球状纳米结构。核苷磷酸基团有一定比例暴露在纳米颗粒表面，进而影响该类化合物电负性。此外延长疏水尾链后，纳米颗粒表面疏水链比例明显提高(tps16vs tps12)。
[0103]
[实施例19]溶解度考察
[0104]
取0.5mg各核苷磷脂，加入适量乙醇使得各样品浓度为10mm。再取16μl dh2o加入到0.2ml ep管中，吸取核苷磷脂/乙醇溶液4μl，直接加入到液面之下。利用2
‑
20μl规格移液器吹打摇匀，静置1min后拍照检测。
[0105]
图10显示阴离子型核苷磷脂均可以易溶于乙醇/水溶液(v:v，1:4)以上结果表明增加可溶性基团，改善核苷类脂材脂水分配系数对其转染应用影响显著。
[0106]
(三)核苷磷脂脂质体递送寡核苷酸在肿瘤治疗领域的应用
[0107]
[实施例20]细胞增殖抑制活性
[0108]
利用cck
‑
8检测法检测：将hek293、mcf/adr、a549/txl细胞按3000/孔，铺至96孔板，37℃培养24h后进行转染。实验组将tps16等核苷磷脂溶于无水乙醇中，制得10mm母液。随后将所需核苷磷脂与目标核酸g3139混合，在pcr上执行退火程序(95℃,5分钟；
‑
5℃/5分钟；25℃，30分钟)用于转染，g3139组直接转染目标核酸g3139。48h后每孔加入cck
‑
8底物(10μl)，37℃避光孵育2h。利用microplate reader(molecular devices，california，usa)检测450nm处的吸光度，同时检测600nm处吸光度以及空白培养液吸光度用于校正。按照如下公式进行计算细胞生存率：
[0109]
cell viability＝(r
a
‑
r
e
)/(r
b
‑
r
e
)
×
100％
[0110]
注：r
a
、r
b
、r
e
分别代表实验组，无转染试剂组以及空白对照组的吸光度。
[0111]
图14
‑
15显示未包载g3139对应mcf
‑
7/adr细胞存活率高达96％；而tps16/g3139复
合物对应细胞存活率降至67％(p<0.01)，且转染效果优于tps12或tpo16。以上结果说明延长疏水尾链长度、降低载体负电性有利于提高反义核酸生物活性。此外，fups16/g3139复合物对应细胞存活率下降到60％(p<0.01)，说明糖环2
′‑
f修饰可以进一步提高反义核酸递送效率，可能是因为该修饰有效提高核苷磷脂与寡核苷酸之间的结合作用。与之相对，将胸腺嘧啶替换为胞嘧啶(cps16)之后，包载g3139复合物对应细胞存活率提高到84％(p>0.05)。以上结果说明核苷碱基类型可以影响寡核苷酸转染效率。进一步研究表明，各核苷磷脂包载nc复合物不影响mcf
‑
7/adr、a549/txl以及hek293t细胞存活率，说明以上脂材无明显的细胞毒性。
[0112]
[实施例21]rt
‑
pcr实验
[0113]
将mcf/adr细胞按100000/孔，铺至96孔板，37℃培养24h后进行转染。实验组将tps16等核苷磷脂溶于无水乙醇中，制得10mm母液。随后将所需核苷磷脂与目标核酸g3139混合，在pcr上执行退火程序(95℃,5分钟；
‑
5℃/5分钟；25℃，30分钟)用于转染，g3139组直接转染目标核酸g3139。
[0114]
细胞总rna的提取和纯化：转染后48h后用trizol法提取totalrna。6孔板按1ml/孔的量加入trizol混匀，室温静置5min后在4℃条件下12000rpm离心10min取上清。再加入0.2ml氯仿，摇匀后室温静置15min，溶液自然分为三层。在4℃条件下，12000rpm，离心10min，取上层水相。再加入0.5ml异丙醇，蜗旋后室温静置15min，在4℃条件下12000rpm离心10min弃上清，管底可见rna沉淀。之后加入1ml75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃条件下8000rpm离心8min弃上清，室温放置10min，晾沉淀至近干。加入depc水溶解，
‑
80℃保存。
[0115]
rna逆转录及检测：总rna的加入量为1μg，无酶水补足10μl后，放入pcr仪，70℃，10min；按照试剂盒说明书配置各组分。pcr执行程序42℃，15min，95℃，5min；4℃保存。随后将20μl上述cdna用80μl无酶水稀释5倍，按照标准程序进行实时定量pcr(40循环)。其中bcl
‑
2上下游引物分别为(5
’‑3’
):ccc tgt gga tga ctg agt acc tg,cca gcc tcc gtt atc ctgg。内参(gadph)上下游引物分别为(5
’‑3’
):cca agg tca tcc atg acaac,tta ctc ctt gga ggc catgt。
[0116]
图16显示tps12、tps16、tps18以及fups16转染g3139复合物对bcl
‑
2 mrna表达抑制能力逐渐增强，说明延长疏水尾链长度、降低电负性以及糖环2'
‑
f修饰可以提高核苷磷脂转染效率。
[0117]
[实施例22]细胞摄取能力考察
[0118]
将mcf/adr细胞按200000/孔，铺至96孔板，37℃培养24h后进行转染。实验组将tps16等核苷磷脂溶于无水乙醇中，制得10mm母液。随后将所需核苷磷脂与目标核酸g3139混合，在pcr上执行退火程序(95℃,5分钟；
‑
5℃/5分钟；25℃，30分钟)用于转染，g3139组直接转染目标核酸g3139。随后将待测细胞用pbs洗涤1次，在每孔中加入200μl 0.25％胰蛋白酶(12孔板)，消化2min后，每孔加800μl4％多聚甲醛，将细胞消化下来转移到离心管，室温固定15min，1000rpm3min离心去上清液。用pbs洗涤2次，每份样品加入100μl pbs使细胞重悬，过筛，采用facs calibur流式细胞分析仪(becton dickinson，sanjose，ca，usa)
[0119]
图17显示该类脂质体普遍提高g3139入胞能力。其中tps16、fups16转染效率较高，可能因为该载体电负性较低使得纳米颗粒更容易进入细胞。
[0120]
[实施例23]胞内分布情况考察
[0121]
mcf
‑
7/adr细胞(200000/孔)在共聚焦观察池中培养24h。实验组将tps16等核苷磷脂溶于无水乙醇中，制得10mm母液。随后将所需核苷磷脂与目标核酸g3139混合，在pcr上执行退火程序(95℃,5分钟；
‑
5℃/5分钟；25℃，30分钟)用于转染，g3139组直接转染目标核酸g3139。随后核苷磷脂/g3139纳米复合物(cy5
‑
g3139:200nm)加入到培养皿中转染4h。然后，移除培养基且细胞用4％甲醛固定15min，并用pbs洗涤两次。细胞分别用hoechst 33342(solarbio)以及lyso
‑
tracker red染色10min，并在a1rsi共聚焦显微镜(nikon instruments inc.)观察。图片用nis
‑
elements软件进行处理。
[0122]
图18显示该类脂质体普遍提高g3139入胞能力。其中tps16转染效率较高，可能因为该载体电负性较低、疏水性较强，使得纳米颗粒更容易进入细胞。
[0123]
本发明详细显示和描述的信息足以实现上述目的，因此首选实施例表示本发明的一个主题，该主题被本发明广泛地涵盖。本发明的范围完全包括在内本领域技术人员可见的其他实施方案，因此，本发明的范围不被除所附权利要求外的任何内容所限制。除明确指示外，所使用元素的单数形式并不是指“一个和唯一”，而是指“一个或更多”。对本领域一般技术人员，所有公知的上述优选的实施方案和附加实施方案部分的结构、组成和功能上的等价物因此引入本文作参考，而且试图被本发明的权利要求所涵盖。此外，不需要某种设备或方法来表达本发明所解决的每个问题，因为它们都已包括在本发明的权利要求之内。另外，无论本发明公开事实中的所有部分、成分，或者方法步骤是否在权利要求中被明确叙述，它们都没有贡献给公众。但是，对本领域普通技术人员来说，很明显在不背离如所附权利要求中所阐明的本发明的实质和范围的前提下，可以在形式、试剂和合成细节上做出各种改变和修饰。