一种细交链孢菌酮酸TEA人工抗原、多克隆抗体及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物工程，具体涉及一种细交链孢菌酮酸tea人工抗原、多克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、细交链格孢菌酮酸(tenuazonic acid，tea)是链格孢霉、稻瘟病霉等霉菌在特定条件下产生的有毒代谢产物之一，在美国、加拿大、巴西、中国等国家均有发现。tea可广泛污染食品及饲料，导致水果、谷物以及蔬菜的采后腐烂，并可寄生、腐生植物体内导致茎点霉病以及水稻稻瘟病等。在目前已知的70多种具有明显毒性的链格孢霉毒素中，tea毒性最强目污染水平居各种链格孢霉毒索之首。tea具有多种生物特性，如通过抑制核糖体的释放抑制蛋白质的合成，抗病毒、抗肿瘤、抑菌性、细胞毒性和植物毒性，并且对哺乳动物(小鼠、大鼠等)也具有急性毒性。目前 tea 常规检测手段为高效液相色谱、液质联用等大型仪器分析法，仪器昂贵、前处理复杂、检测周期长，难以实现大批量现场快速筛查。

2、免疫检测技术（elisa 等）具备快速、低成本、高通量检测优势，该技术的核心前提是获得可特异性识别 tea 的抗体。tea 属于小分子有机毒素，分子量小，无免疫原性，无法直接刺激动物机体产生特异性抗体，必须与大分子载体蛋白偶联构建人工抗原后才能诱导免疫应答。现有tea人工抗原合成工艺存在偶联位点选择不合理、偶联效率低、抗体特异性差、合成步骤繁琐等缺陷，这限制免疫检测方法灵敏度。因此，开发一种能够完整保留tea特征抗原表位、工艺简便、可高效制备高特异性多克隆抗体的人工抗原合成方法具有重要应用价值。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的一些不足，本发明提供了一种细交链孢菌酮酸tea人工抗原、多克隆抗体及其制备方法和应用；本发明通过肟化反应在 tea 分子非特征位点引入羧基，完整保留 tea 分子3-吡咯啉、4-羟基抗原特征结构，再经活泼酯法将tea与载体蛋白中氨基酸的氨基偶联，得到细交链孢菌酮酸tea人工抗原tea-klh和tea-bsa；所述细交链孢菌酮酸tea人工抗原能够用于动物免疫产生多克隆抗体，抗体产生量较大且对tea具有高特异性识别能力；本发明所述细交链孢菌酮酸tea人工抗原合成方法简单、快速，具有很好的实用性。

2、为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术手段：

3、本发明首先提供了一种细交链孢菌酮酸tea人工抗原的制备方法，所述制备方法包括：

4、（1）将细交链孢菌酮酸tea、羧甲基羟胺半盐酸盐cmo和无水吡啶混合，搅拌混合反应，反应结束后氮气吹干，得到半抗原，即肟化物tea-cmo；

5、（2）将肟化物tea-cmo溶于dmf中，得到tea-cmo溶液，向tea-cmo溶液中加入n- 羟基琥珀酰亚胺（nhs）、n, n- 二环己基碳二亚胺盐酸盐（dcc），避光搅拌反应，反应结束后离心取上清，得到活化的半抗原溶液；

6、（3）将载体蛋白溶于pbs缓冲液中，得到载体蛋白溶液；

7、将载体蛋白溶液和半抗原溶液冰浴预冷，在避光冰浴搅拌条件下，将半抗原溶液缓慢滴加至载体蛋白溶液中，搅拌反应，反应结束后离心取上清，然后透析收集上清液，得到所述细交链孢菌酮酸tea人工抗原。

8、优选地，步骤（1）中，所述细交链孢菌酮酸tea、羧甲基羟胺半盐酸盐cmo、无水吡啶的用量比为3mg：6mg：2ml；

9、所述搅拌混合反应为室温下避光磁力搅拌反应24 h。

10、优选地，步骤（2）中，肟化物tea-cmo、dmf用量比为1.5mg:1ml, 肟化物tea-cmo、n-羟基琥珀酰亚胺和n, n- 二环己基碳二亚胺盐酸盐的摩尔用量比为1∶2.5∶5；

11、所述避光搅拌反应的条件为：室温避免搅拌反应12h。

12、优选地，步骤（3）中，所述载体蛋白包括：钥孔血蓝蛋白klh和牛血清白蛋白bsa；

13、所述pbs溶液的浓度为0.1 m，ph值为7.4。

14、优选地，步骤（3）中，所述预冷的条件为冰浴预冷10min；

15、所述避光冰浴搅拌条件为冰浴条件下磁力搅拌；

16、当载体蛋白为钥孔血蓝蛋白klh时，载体蛋白和半抗原溶液中的半抗原tea-cmo的摩尔比为1：555；

17、当载体蛋白为牛血清白蛋白bsa时，载体蛋白和半抗原溶液中的半抗原tea-cmo的摩尔比为1：51；

18、所述搅拌反应的搅拌时间为12h。

19、本发明还提供了上述制备方法制备的细交链孢菌酮酸tea人工抗原，所述细交链孢菌酮酸tea人工抗原由tea和载体蛋白偶联得到；

20、所述载体蛋白包括klh和bsa。

21、本发明还提供了一种抗细交链孢菌酮酸tea的抗体，所述抗体由所述细交链孢菌酮酸tea人工抗原通过免疫技术获得。

22、优选地，所述抗体包括多克隆抗体、单克隆单体或基因工程抗体。

23、本发明还提供了所述抗细交链孢菌酮酸tea的抗体在细交链孢菌酮酸tea检测中的应用。

24、优选地，所述应用包括：制备农产品检测试剂盒、体外诊断试剂盒或微流体芯片；

25、所述农产品检测试剂盒和/或所述体外诊断试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光免疫试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。

26、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

27、本发明通过肟化反应在 tea 分子非特征位点引入羧基，完整保留 tea 分子3-吡咯啉、4-羟基抗原特征结构，再经活泼酯法将tea与载体蛋白中氨基酸的氨基偶联，得到细交链孢菌酮酸tea人工抗原tea-klh和tea-bsa；所述细交链孢菌酮酸tea人工抗原能够用于动物免疫产生多克隆抗体，抗体产生量较大且对tea具有高特异性识别能力；本发明所述细交链孢菌酮酸tea人工抗原合成方法简单、快速，具有很好的实用性。

28、本发明 tea 人工抗原与多克隆抗体可构建间接竞争 elisa 检测试剂盒，实现农产品、食品中 tea 毒素大批量快速筛查，降低检测成本，替代大型仪器检测。

1.一种细交链孢菌酮酸tea人工抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述细交链孢菌酮酸tea、羧甲基羟胺半盐酸盐cmo、无水吡啶的用量比为3mg：6mg：2ml；

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，肟化物tea-cmo、dmf用量比为1.5mg:1ml，肟化物tea-cmo、n-羟基琥珀酰亚胺和n, n- 二环己基碳二亚胺盐酸盐的摩尔用量比为1∶2.5∶5；

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述载体蛋白包括：钥孔血蓝蛋白klh和牛血清白蛋白bsa；

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述预冷的条件为冰浴预冷10min；

6.权利要求1-5任一项所述制备方法制备的细交链孢菌酮酸tea人工抗原，其特征在于，所述细交链孢菌酮酸tea人工抗原由tea和载体蛋白偶联得到；

7.一种抗细交链孢菌酮酸tea的抗体，其特征在于，所述抗体由所述细交链孢菌酮酸tea人工抗原通过免疫技术获得。

8.根据权利要求7所述的tea的抗体，其特征在于，所述抗体包括多克隆抗体、单克隆单体或基因工程抗体。

9.权利要求7所述的抗细交链孢菌酮酸tea的抗体在细交链孢菌酮酸tea检测中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括：制备农产品检测试剂盒、体外诊断试剂盒或微流体芯片；