一种细胞消化液及其制备方法与应用与流程

本申请属于细胞培养，尤其涉及一种细胞消化液及其制备方法与应用。

背景技术：

1、脐带间充质干细胞（mesenchymalstemcells，mscs）是一种来源于新生儿脐带组织的多功能干细胞，具有成纤维细胞样形态，可在体外分化为脂肪细胞、成骨细胞等多种组织细胞。同时，mscs具备独特的免疫调节作用，使其在细胞疗法中极具应用潜力。基于其自我更新能力、多向分化潜能及免疫调控特性，结合再生医学的快速发展，mscs已成为学术界和医疗界广泛关注的研究热点，并在临床转化研究中展现出重要价值。

2、在mscs的体外分离与扩增过程中，细胞通常呈单层贴壁生长，临床研究及应用时需将其解离为单细胞悬液，因此消化液的选择是扩增工艺的关键环节。胰蛋白酶是目前最常用的消化酶，其通过切割与精氨酸或赖氨酸相连的肽键，降解细胞间黏蛋白和糖蛋白，实现细胞分离。传统胰酶经多年实践验证，具有应用广泛、效果稳定、成本低廉等优势，但其消化过程不可避免地会对细胞造成机械损伤和应激损伤，若消化时间或浓度控制不当，还易引起过度消化，从而显著影响细胞的活力与干性。现有技术中，虽有改进方案如cn116333975a公开的含胰蛋白酶、表皮生长因子、维生素c和血清白蛋白的消化液，以及cn109439621a公开的含温和消化酶及多种无机盐组分的细胞消化液，但这些方案均未充分考虑在消化过程中同步提供关键营养保护因子以减轻细胞损伤。

3、谷氨酰胺是维持细胞生长和存活的关键分子，可通过代谢生成atp支持细胞增殖，并在应激状态下帮助细胞维持正常功能；人血白蛋白富含氨基酸，能提供营养支持，同时凭借抗氧化特性保护细胞免受氧化应激损伤，并减少机械力造成的细胞损害、提高存活率。然而，目前尚未见同时含有l-谷氨酰胺和人血白蛋白这两种营养物质、且能够有效维持干细胞活性的温和细胞消化液的报道。因此，如何开发一种消化效率高、同时对细胞损伤小、能有效维持mscs活性和干性的消化液，仍是本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本申请的目的在于提供一种细胞消化液及其制备方法与应用，旨在解决现有技术中存在细胞消化液在消化过程中易对干细胞造成应激损伤、影响细胞活力与干性的问题。

2、为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：

3、第一方面，本申请提供一种细胞消化液，细胞消化液的有效组分包括胰蛋白酶、乙二胺四乙酸四钠盐二水合物、氯化钠、l-谷氨酰胺、人血白蛋白和磷酸盐缓冲液。

4、在一些实施例中，细胞消化液中包括：

5、胰蛋白酶800-2500mg/l；

6、乙二胺四乙酸四钠盐二水合物1000-1200mg/l；

7、氯化钠4250-4300mg/l；

8、l-谷氨酰胺146-150mg/l；

9、人血白蛋白5000-20000mg/l；

10、磷酸盐缓冲液补齐至总体积为1l。

11、在一些实施例中，磷酸盐缓冲液的ph为7.2-7.4。

12、在一些实施例中，细胞消化液的ph值为6.8-7.2。

13、在一些实施例中，细胞消化液用于维持干细胞的细胞活性。

14、第二方面，本申请提供一种上述的细胞消化液的制备方法，包括以下步骤：

15、将胰蛋白酶粉末和磷酸盐缓冲液混匀，得到第一混合液；

16、将乙二胺四乙酸四钠盐二水合物、氯化钠、l-谷氨酰胺和人血白蛋白和第一混合液进行混合处理，调节ph值为6.8-7.2，得到第二混合液；

17、将第二混合液进行过滤，得到细胞消化液。

18、在一些实施例中，细胞消化液的储存条件为：2-8℃保存，长期保存则置于-20℃。

19、第三方面，本申请提供一种解离干细胞的方法，包括以下步骤：

20、将上述的细胞消化液加入贴壁生长的干细胞中，于恒温培养箱中消化处理；

21、消化结束后，加入完全培养基终止消化，收集细胞悬液；

22、将细胞悬液离心，收集沉淀，再进行混悬处理，得到干细胞单细胞悬液。

23、在一些实施例中，消化处理的时间为2-4分钟。

24、在一些实施例中，离心的条件为1500-1800rpm离心5-8分钟。

25、与现有技术相比，本申请的有益效果在于：

26、（1）提供的细胞消化液以l-谷氨酰胺和人血白蛋白复配作为营养添加物，l-谷氨酰胺通过代谢生成atp支持细胞生长、维持细胞正常功能，人血白蛋白提供丰富氨基酸并发挥抗氧化保护作用，二者协同可有效缓解胰蛋白酶消化过程对干细胞造成的应激反应，促使细胞状态趋于稳定，维持干细胞原有功能与干性，同时减少细胞吹打引致的机械损伤。

27、（2）提供的细胞消化液消化效率高，可使贴壁间充质干细胞在短时间内完全脱落，细胞活率可达97%，且在维持较高细胞活率的同时，消化细胞能力突出。

28、（3）提供的细胞消化液可显著提高干细胞连续传代的平均扩增倍数，细胞稳定传代、减少损耗。

29、（4）提供的细胞消化液配制方法简单，无需借助先进设备，常规设备、耗材即可满足制备条件，成本低廉，适用于工业化生产。

1.一种细胞消化液，其特征在于，所述细胞消化液的有效组分包括胰蛋白酶、乙二胺四乙酸四钠盐二水合物、氯化钠、l-谷氨酰胺、人血白蛋白和磷酸盐缓冲液。

2.根据权利要求1所述的细胞消化液，其特征在于，所述细胞消化液中包括：

3.根据权利要求1或2所述的细胞消化液，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的ph为7.2-7.4。

4.根据权利要求1或2所述的细胞消化液，其特征在于，所述细胞消化液的ph值为6.8-7.2。

5.根据权利要求1或2所述的细胞消化液，其特征在于，所述细胞消化液用于维持干细胞的细胞活性。

6.一种如权利要求1-5任一项所述的细胞消化液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述细胞消化液的储存条件为：2-8℃保存，长期保存则置于-20℃。

8.一种解离干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的解离干细胞的方法，其特征在于，所述消化处理的时间为2-4分钟。

10.根据权利要求8所述的解离干细胞的方法，其特征在于，所述离心的条件为1500-1800rpm离心5-8分钟。