经修饰的IgG1Fc结构域与抗-CD40域抗体的融合的制作方法

发明领域提供了与fcγ受体结合减少的经修饰的igg1 fc结构域。提供了包含抗-cd40单可变结构域和经修饰的fc结构域的抗体多肽。抗体多肽结合cd40，不显示cd40激动活性，不活化未成熟的树突状细胞，并具有适于作为治疗剂研发的改善的生物物理性质。提供了包含其的组合物，用于治疗涉及cd40活性的疾病的方法和在制备用于治疗涉及cd40活性的药物中用途。

背景技术：

1、cd40共刺激分子属于肿瘤坏死因子（tnf）受体超家族，其存在于包括树突状细胞、b细胞和巨噬细胞在内的抗原提呈细胞（apc）上。当cd40与th细胞上的其配体cd154（cd40l）结合时，apc被活化。cd40-介导的apc活化参与多种免疫应答，包括细胞因子产生、共刺激分子（如cd86）上调以及增强抗原提呈和b细胞增殖。cd40也可以由内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和上皮细胞表达。

2、cd40激活也参与多种例如与自身免疫、移植排斥或变态反应相关的不需要的t细胞应答。控制不需要的t细胞应答的一种策略是使用拮抗性抗体靶向cd40。例如，单克隆抗体hcd122（鲁卡木单抗），以前称为chiron 1212，目前正在用于治疗某些cd40介导的炎性疾病的临床试验中。参见在因特网超文本传输协议clinicaltrialsfeeds.org/clinical-trials/show/nct01275209上的临床试验摘要“hcd122（鲁卡木单抗）与苯达莫司汀联合疗法在cd40+利妥昔单-抗难治性滤泡性淋巴瘤中的研究”（最后更新于2011年01月11日）

。但是，单克隆抗体可以显示出激动活性。例如，抗-cd40抗体chi220的实用性受其较弱刺激潜能的限制。参见adams等，“development of a chimeric 抗-cd40 monoclonal antibodythat synergizes with lea29y to prolong islet allograft survival,”

j. immunol. 174: 542-50 (2005)。

3、对在治疗和/或预防免疫疾病中调节cd40活化的治疗剂具有持续的需求。

技术实现思路

1、提供了一种人igg1 fc结构域多肽，其包含在kabat位置238的突变，所述突变减少与fcγ受体的结合，其中脯氨酸238（p238）突变为选自下述的残基之一：赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、精氨酸和色氨酸。igg1 fc可以包含seq id no: 65所示的氨基酸序列。

2、提供了一种人igg1 fc结构域多肽，其在kabat位置238包含赖氨酸取代。人igg1fc结构域多肽的示例性氨基酸序列是：

3、epkscdkthtcppcpapellggksvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg（igg1a-p238k（-c-末端lys）；seq id no: 134），

4、epkscdkthtcppcpapellggksvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk（igg1a-p238k；seq id no: 66），

5、epkscdkthtcppcpapellggksvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg（igg1f-p238k（-c-末端lys）；seq id no: 135），

6、和

7、epkscdkthtcppcpapellggksvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk（igg1f-p238k；seq id no: 67）。

8、提供了一种融合多肽，包含：（a）异源多肽；和（b）fc结构域，如上文所述。

9、还提供了一种抗体多肽，包含：（1）单可变结构域，所述单可变结构域包含：（a）cdr1区，其包含：seq id no: 1所示的氨基酸序列或与seq id no: 1所示的cdr1区最多相差2个氨基酸的氨基酸序列，（b）cdr2区，其包含seq id no: 2所示的氨基酸序列或与seqid no: 2所示的cdr2区最多相差3个氨基酸的氨基酸序列，和（c）cdr3区，其包含seq idno: 3所示的氨基酸序列或与seq id no: 3所示的cdr3区最多相差6个氨基酸的氨基酸序列，和其中所述单可变结构域结合cd40；和（2）fc结构域，其是人igg1 fc结构域多肽，在kabat位置238包含减少与fcγ受体结合的突变，其中脯氨酸238（p238）突变为选自下述的残基之一：赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、精氨酸和色氨酸。本技术所述抗体多肽的单可变结构域拮抗cd40的至少一种活性。相对于参照多肽，本技术所述的抗体多肽具有增加的稳定性，所述参照多肽具有相同的单可变结构域序列且与野生型igg1 fc结构域融合。提供了一种抗体多肽，所述抗体多肽包含：（1）如上文所述的单可变结构域，其中人igg1 fc结构域在kabat位置238具有赖氨酸取代。人igg1 fc结构域多肽的示例性氨基酸序列是：

10、epkscdkthtcppcpapellggksvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg（igg1a-p238k（-c-末端lys）；seq id no: 134），

11、epkscdkthtcppcpapellggksvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk（igg1a-p238k；seq id no: 66），

12、epkscdkthtcppcpapellggksvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg（igg1f-p238k（-c-末端lys）；seq id no: 135），

13、和

14、epkscdkthtcppcpapellggksvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk（igg1f-p238k；seq id no: 67）。

15、还提供了一种如上文所述的抗体多肽，其中（a）cdr1区由x1-tyr-glu-y1-trp所示的序列（seq id no: 4）组成，其中x1是asp或gly，和y1是met或leu；（b）cdr2区由ala-ile-asn-pro-x2-gly-y2-z2-thr-tyr-tyr-ala-asp-ser-val-a2-gly所示的序列（seq id no:5）组成，其中x2是gln、tyr、his、trp或ala，y2是thr、asn、gly、ser或gln，z2是arg、leu、tyr、his或phe，和a2是lys或met；和（c） cdr3区由x3-pro-y3-z3-a3-b3-c3所示的序列（seq idno: 6）组成，其中x3是leu、pro或glu，y3是phe、gln、thr、met或tyr，z3是arg、tyr、pro、leu、thr、ile、phe、met或ser，a3是phe或tyr，b3是ser、gln、his、asp、lys、glu或gly，和c3是asp、tyr、glu或ser。

16、还提供了一种如上文所述的抗体多肽，其中：（a）cdr1区由seq id no: 1所示的氨基酸序列组成（3h-56-269的cdr1），（b）cdr2区由seq id no: 2所示的氨基酸序列组成（3h-56-269的cdr2），和（c）cdr3区由seq id no: 3所示的氨基酸序列组成（3h-56-269的cdr3）。还提供了一种如上文所述的抗体多肽，其中单可变结构域的氨基酸序列如seq id no: 41所示（=3h-56-269序列）。

17、提供了一种抗体多肽，其包含或由下述氨基酸序列组成：

18、

19、提供了一种抗体多肽，其包含或由下述氨基酸序列组成：

20、

21、还提供了一种编码本公开内容的任意人igg1 fc结构域多肽、融合多肽或抗体多肽的核酸。还提供了包含所述核酸的表达载体。提供了使用所述表达载体转化的细胞。

22、提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上文所述的抗体多肽和药学上可接受的运载体。

23、一种在对象中治疗或预防免疫疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用上文所述的抗体多肽。免疫疾病可以选自下组：艾迪生氏病、变态反应、过敏反应、强制性脊柱炎、哮喘、动脉粥样硬化、特应性变态反应、耳部自身免疫性疾病、眼部自身免疫性疾病、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、支气管哮喘、冠心病、克罗恩病、糖尿病、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏病、溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、炎性肠病、对重组药品（例如，血友病中的因子vii）的免疫应答、系统性红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、天疱疮、银屑病、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征，脊柱关节炎、甲状腺炎、移植排斥、血管炎和溃疡性结肠炎。