一种肿瘤细胞外囊泡检测体系及检测方法

本发明涉及生化分析与生物传感，特别涉及一种肿瘤细胞外囊泡检测体系及检测方法。

背景技术：

1、肿瘤细胞外囊泡（tumor derived-extracellular vesicles，tevs）是由肿瘤细胞经膜脱落或主动分泌至细胞外空间的纳米级囊泡，广泛分布于血液、尿液、泪液等多种生物体液中。tevs携带大量源于肿瘤细胞的核酸、蛋白质及脂质等特征性生物分子，可参与细胞间通讯、肿瘤微环境重塑及疾病进展等关键生命活动，已被公认为肿瘤早期诊断、治疗监测及预后评估中极具潜力的无创生物标志物。

2、然而，tevs在血液等体液中的含量极低、尺寸微小，且与多种理化性质相似的杂质颗粒共存，导致其高灵敏、高特异性检测面临巨大技术挑战。因此，建立简便高效的tevs检测方法对于推动肿瘤早期诊断具有重要的临床意义。

3、近年来，研究者已报道多种tevs检测技术。基于颗粒计数的纳米颗粒跟踪分析仪、纳米流式分析仪及动态光散射法可实现evs数量的准确定量，但此类方法依赖繁琐耗时的evs分离纯化步骤及昂贵的大型仪器设备，且无法区分evs的亚型来源。作为经典的蛋白分析方法，质谱法、western blot及elisa可通过检测evs表面蛋白来识别特定tevs亚群，但仍需依赖分离富集过程，且灵敏度较低。近年来，基于抗体或适配体的evs表面蛋白分析技术在特异性evs识别方面取得了显著进展，然而此类方法大多仅针对单一evs膜蛋白进行检测。由于tevs表面蛋白存在高度异质性，单一识别模式易导致假阳性或假阴性结果，难以满足临床精准检测需求。

4、综上，当前tevs检测方法普遍存在操作繁琐、依赖昂贵设备、灵敏度不足及特异性有限等问题，亟需建立一种操作简便、灵敏度高、特异性强且无需复杂分离步骤的tevs检测方法。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种肿瘤细胞外囊泡检测体系及检测方法。本发明通过磁珠介导的双识别分离与dna四面体空间构型介导的三重同步hcr信号放大，实现了对肿瘤细胞外囊泡的高灵敏度、高特异性检测，且操作简便。

2、为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

3、本发明一方面提供一种肿瘤细胞外囊泡检测体系，包括磁分离单元和信号放大单元，所述磁分离单元为表面修饰有捕获分子的磁珠，用于特异性捕获样本中的目标肿瘤细胞外囊泡；

4、所述信号放大单元为功能化的dna四面体探针；

5、dna四面体的一个顶点连接有识别分子，用于识别被捕获的肿瘤细胞外囊泡表面的靶标分子，形成磁珠、肿瘤细胞外囊泡和dna四面体复合物；

6、dna四面体的另外三个顶点各自独立地连接有hcr触发链，用于在所述识别分子识别靶标分子后，由三个顶点的hcr触发链同时触发三重杂交链式反应，以实现对检测信号的级联放大。

7、进一步地，所述捕获分子为肿瘤相关膜蛋白抗体，所述识别分子为外泌体通用标志物适配体；肿瘤相关膜蛋白选自epcam、her2、egfr、pd-l1、gpc-1中的至少一种，外泌体通用标志物选自cd63、cd9、cd81中的至少一种。

8、进一步地，所述检测体系还包括发夹探针h1和发夹探针h2；所述杂交链式反应用于在所述hcr触发链存在下，发夹探针h1和发夹探针h2交替杂交形成长链dna聚合物并产生增强的荧光信号。

9、进一步地，所述dna四面体由四条dna单链通过碱基互补配对自组装形成；所述hcr触发链为所述dna四面体三个顶点延伸出的单链dna序列。

10、本发明另一方面提供一种基于所述检测体系的肿瘤细胞外囊泡检测方法，包括以下步骤：

11、s1：将表面修饰有捕获分子的磁珠与样本混合孵育，捕获样本中的目标肿瘤细胞外囊泡，并在外加磁场作用下进行磁分离和洗涤，获得磁珠和肿瘤细胞外囊泡复合物；

12、s2：将功能化的dna四面体探针与所述磁珠和肿瘤细胞外囊泡复合物混合孵育，通过所述识别分子识别肿瘤细胞外囊泡表面的靶标分子，形成磁珠、肿瘤细胞外囊泡和dna四面体探针复合物，并进行磁分离洗涤；

13、s3：在所述dna四面体三个顶点的hcr触发链同步作用下启动三重杂交链式反应；

14、s4：激发并检测所述反应体系的荧光信号强度，根据荧光信号强度确定样本中肿瘤细胞外囊泡的浓度。

15、进一步地，步骤s1中所述混合孵育的温度为室温，时间为30～60分钟；步骤s2中所述混合孵育的温度为室温，时间为30～60分钟；步骤s3中所述启动三重杂交链式反应的温度为37℃，反应时间为1～3小时。

16、进一步地，步骤s4中所述荧光信号强度与肿瘤细胞外囊泡浓度在5×104particles/μl至4×106particles/μl范围内呈正相关，检测限低至1.3×104particles/μl。

17、进一步地，步骤s1中所述待测样本为细胞培养上清液、血清或血浆。

18、基于上述检测体系，本发明还提供一种用于肿瘤细胞外囊泡检测的试剂盒，其包含如上所述的检测体系。

19、此外，所述检测体系在制备用于肿瘤早期诊断、治疗监测或预后评估的产品中具有广泛的应用前景。

20、本发明的有益效果为：

21、（1）本发明的检测体系和方法检测特异性更高。本发明采用捕获分子和识别分子构成的双识别体系，捕获分子特异性富集目标肿瘤细胞外囊泡，识别分子确认其为目标肿瘤细胞外囊泡，双重识别协同作用可有效排除样本中其他杂质的干扰，克服了传统单一识别模式误差大、易产生假阳性或假阴性结果的缺陷，显著提高了检测结果的准确性和可靠性。

22、（2）本发明的检测体系和方法检测灵敏度更高。本发明将识别分子与三条hcr触发链集成于单个dna四面体框架结构的不同顶点，靶标识别后三个顶点的触发链同步触发三重杂交链式反应，实现了信号的多重级联放大，显著提升了低丰度肿瘤细胞外囊泡的检出能力。

23、（3）本发明检测体系和方法操作更简便。本发明采用磁珠可直接从样本中捕获分离目标肿瘤细胞外囊泡，无需超速离心等繁琐耗时的分离富集步骤，显著简化了操作流程，提高了检测效率。

24、（4）本发明检测体系和方法反应条件更温和。本发明的反应体系可在等温条件下进行，且无需酶参与，避免了酶活性受环境因素干扰导致的不稳定性，显著提升了方法的易用性和批间重复性。

1.一种肿瘤细胞外囊泡检测体系，包括磁分离单元和信号放大单元，其特征在于，

2.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述捕获分子为肿瘤相关膜蛋白抗体，所述识别分子为外泌体通用标志物适配体；肿瘤相关膜蛋白选自epcam、her2、egfr、pd-l1、gpc-1中的至少一种，外泌体通用标志物选自cd63、cd9、cd81中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系还包括发夹探针h1和发夹探针h2；所述杂交链式反应用于在所述hcr触发链存在下，发夹探针h1和发夹探针h2交替杂交形成长链dna聚合物并产生增强的荧光信号。

4.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述dna四面体由四条dna单链通过碱基互补配对自组装形成；所述hcr触发链为所述dna四面体三个顶点延伸出的单链dna序列。

5.一种基于如权利要求1至4任一项所述检测体系的肿瘤细胞外囊泡检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤s1中所述混合孵育的温度为室温，时间为30～60分钟；步骤s2中所述混合孵育的温度为室温，时间为30～60分钟；步骤s3中所述启动三重杂交链式反应的温度为37℃，反应时间为1～3小时。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤s4中所述荧光信号强度与肿瘤细胞外囊泡浓度在5×104particles/μl至4×106particles/μl范围内呈正相关，检测限低至1.3×104particles/μl。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤s1中所述待测样本为细胞培养上清液、血清或血浆。

9.一种用于肿瘤细胞外囊泡检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至4任一项所述的检测体系。

10.权利要求1至4任一项所述的检测体系在制备用于肿瘤早期诊断、治疗监测或预后评估的产品中的应用。