植物转化的制作方法

本发明涉及转移dna，其可以用于产生仅具有来自该种植物的dna的经基因修饰的植物。本发明还涉及具有本发明的转移dna的经基因修饰的植物和制备此类植物的方法，所述转移dna已经在整合期间被加工。还提供了dna构建体和制备包含五个基因的多基因构建体的方法，所述五个基因赋予植物对多种真菌病原体的增强的抗性。

背景技术：

1、根癌农杆菌（

agrobacterium tumefacians）是一种土壤植物病原体，它通过将ti（肿瘤诱导）质粒上编码的特异性转移dna分子（t-dna）引入受体植物细胞来引起冠瘿病。在经转移的t-dna序列上编码的是致癌基因，当在植物中表达时，致癌基因导致对疾病表现至关重要的赘生性肿瘤样植物细胞生长。农杆菌属（

agrobacterium）菌株通常按其植物肿瘤产生的冠瘿碱化合物进行分组，所述冠瘿碱化合物通常是胭脂碱或章鱼碱。这些冠瘿碱为细菌提供碳源和氮源，并由转移到植物细胞中的相应t-dna上编码的细菌基因产生。在这两种情况下，细菌使用由t-pillus和膜相关转运蛋白复合物组成的iv型分泌系统来转移这些t-dna。生物技术已经利用这种天然基因转移过程，以通过去除t-dna区中存在的致癌基因（使ti质粒去武装）并在载体构建期间用所关注的基因替代致癌基因来将选择的基因引入植物细胞中。

2、t-dna转移过程成功的关键在于农杆菌属的侧接t-dna序列的两个25 bp重复序列，分别被称为右边界（rb）和左边界（lb）序列。这些序列描绘了转移到植物细胞中的t-dna区，并且它们存在于章鱼碱型和胭脂碱型ti质粒两者上，但在这些边界重复序列之间存在一些序列变异。通过酶vird1和vird2切割第三碱基与第四碱基之间的rb序列的一条dna链（在图1中用“/”指示）并随后转移t-dna序列的单链来启动t-dna转移。左边界序列被类似地切割，使得所得单链转移的t-dna编码lb重复序列的21个碱基和rb重复序列的3个碱基。

3、当t-dna序列整合到植物基因组中时，边界序列也被整合，导致细菌dna存在于靶植物细胞中。尽管这些基因组整合经常包括或者有时不包括这些边界序列重复序列的仅一部分（kim等人, 2003；zhu等人, 2013；kleinboelting等人, 2015；gong等人, 2021），但筛选植物以鉴定不含农杆菌属来源的序列的所得品系是困难且昂贵的。

4、顺式基因和/或基因内植物工程寻求开发用于在降低监管障碍负担的情况下的经改进的产品的植物。此外，这些工程方法对于开发和引入新性状是有吸引力的，因为它不受与常规育种相关的连接阻力问题的阻碍，并且可以更快地将期望性状引入优选的种质中。为了产生顺式基因植物，优选的是具有源自所关注的靶植物的经修饰的lb和rb序列，以去除细菌序列整合到靶植物中的机会。

5、需要可以用于通过农杆菌属转化产生经基因修饰的植物的多核苷酸和相关方法，所述经基因修饰的植物不具有不是来自植物的所述物种的任何dna。

技术实现思路

1、鉴于顺式基因转化事件的监管接受度不断变化，本发明人努力用植物基因组序列取代细菌边界序列，以开发不含非内源性植物dna序列的转基因植物。

2、一方面，本发明提供了一种用于农杆菌属介导的基因转移（amgt）的转移dna（t-dna），所述t-dna包含第一组分和第二组分，其中

3、i）所述第一组分是用于整合到植物的基因组中的植物转移dna（pt-dna），其中所述pt-dna包含所关注的多核苷酸并且仅具有来自植物的dna，其中所述pt-dna的5'端包含用于整合到所述基因组中的左边界的一部分或具有所述左边界，并且所述pt-dna的3'端包含用于整合到所述基因组中的右边界的一部分，并且

4、ii）所述第二组分在所述第一组分内，其中所述第二组分是包含编码可选择标志物的多核苷酸的可转座元件。

5、一方面，本发明提供了一种植物，所述植物具有整合到所述植物的基因组中的植物转移dna（pt-dna），其中整合的pt-dna仅具有来自植物的dna，并且其中所述pt-dna包含所关注的多核苷酸。

6、另一方面，本发明提供了一种小麦植物，所述小麦植物具有整合到所述植物的基因组中的小麦转移dna（wt-dna），其中整合的wt-dna仅具有小麦dna，并且其中所述wt-dna包含所关注的多核苷酸。

7、另一方面，本发明提供了一种大豆植物，所述大豆植物具有整合到所述植物的基因组中的大豆转移dna（st-dna），其中整合的st-dna仅具有大豆dna，并且其中所述st-dna包含所关注的多核苷酸。

8、还提供了一种具有本发明的t-dna的植物或其部分。

9、在另外的方面，本发明提供了一种植物或其部分，所述植物或其部分具有整合到所述植物或其部分的基因组中的植物转移dna（pt-dna），其中整合的pt-dna仅具有来自植物的dna，并且其中所述pt-dna包含所关注的多核苷酸，并且其中

10、i）所述植物是小麦，并且pt-dna具有经加工的左边界，所述经加工的左边界包含seq id no: 1310、seq id no: 797、seq id no: 798、seq id no: 799、seq id no: 800、seq id no: 801、seq id no: 802、seq id no: 803、seq id no: 804、seq id no: 805、seq id no: 806、seq id no: 807、seq id no: 808、seq id no: 809、seq id no: 810、seq id no: 811、seq id no: 1495、seq id no: 812、seq id no: 816、seq id no: 819、seq id no: 822、seq id no: 823、seq id no: 824、seq id no: 827、seq id no: 345、seq id no: 832、seq id no: 836、seq id no: 839、seq id no: 842、seq id no: 845、seq id no: 850、seq id no: 853或seq id no: 860，或

11、ii）所述植物是大豆，并且pt-dna具有经加工的左边界，所述经加工的左边界包含seq id no: 939、seq id no: 936、seq id no: 946、seq id no: 949、seq id no: 952、seq id no: 956、seq id no: 959、seq id no: 962、seq id no: 152、seq id no: 941、seq id no: 345、seq id no: 385、seq id no: 954、seq id no: 314或seq id no: 303，或

12、iii）所述植物是大麦，并且pt-dna具有经加工的左边界，所述经加工的左边界包含seq id no: 251、seq id no: 249、seq id no: 255、seq id no: 257、seq id no: 259、seq id no: 261、seq id no: 263、seq id no: 265、seq id no: 267、seq id no: 269、seq id no: 271、seq id no: 273、seq id no: 275、seq id no: 277、seq id no: 279、seq id no: 281、seq id no: 285、seq id no: 287、seq id no: 289或seq id no: 291，或

13、iv）所述植物是甘蔗，并且pt-dna具有经加工的左边界，所述经加工的左边界包含seq id no: 343、seq id no: 345、seq id no: 347、seq id no: 349、seq id no: 230、seq id no: 352、seq id no: 354、seq id no: 356、seq id no: 358、seq id no: 360、seq id no: 211、seq id no: 1007、seq id no: 1008、seq id no: 365、seq id no: 367、seq id no: 369、seq id no: 371或seq id no: 373。

14、在另外的方面，本发明提供了一种用于农杆菌属介导的基因转移（amgt）的肿瘤诱导（ti）质粒，其中所述ti质粒包含用于整合到植物的基因组中的植物转移dna（pt-dna），其中所述pt-dna包含所关注的多核苷酸并且仅具有来自植物的dna，其中所述pt-dna的5'端包含用于整合到植物基因组中的左边界的一部分，并且所述pt-dna的3'端包含用于整合到植物基因组中的右边界的一部分。

15、另一方面，本发明提供了一种用于农杆菌属介导的基因转移（amgt）的肿瘤诱导（ti）质粒，其中所述ti质粒包含用于整合到大豆植物的基因组中的大豆转移dna（st-dna），其中所述st-dna包含所关注的多核苷酸并且仅具有大豆dna，其中所述st-dna的5'端包含用于整合到所述基因组中的左边界的一部分，并且所述st-dna的3'端包含用于整合到所述基因组中的右边界的一部分。

16、在另外的方面，本发明提供了一种用于农杆菌属介导的基因转移（amgt）的肿瘤诱导（ti）质粒，所述ti质粒包含本发明的t-dna或本发明的pt-dna。

17、在另外的方面，本发明提供了一种用于整合到植物的基因组中的植物转移dna（pt-dna），其中所述pt-dna包含所关注的多核苷酸并且仅具有来自植物的dna，其中所述pt-dna的5'端包含用于整合到所述基因组中的左边界的一部分或具有所述左边界，并且所述pt-dna的3'端包含用于整合到所述基因组中的右边界的一部分。

18、在另外的方面，本发明提供了一种用于整合到小麦植物的基因组中的小麦转移dna（wt-dna），其中所述wt-dna包含所关注的多核苷酸并且仅具有小麦dna，其中所述wt-dna的5'端包含用于整合到所述基因组中的左边界的一部分或具有所述左边界，并且所述wt-dna的3'端包含用于整合到所述基因组中的右边界的一部分。

19、在另外的方面，本发明提供了一种用于整合到大豆植物的基因组中的大豆转移dna（st-dna），其中所述st-dna包含所关注的多核苷酸并且仅具有大豆dna，其中所述st-dna的5'端包含用于整合到所述基因组中的左边界的一部分或具有所述左边界，并且所述st-dna的3'端包含用于整合到所述基因组中的右边界的一部分。

20、另一方面，本发明提供了一种整合到植物的基因组中的用于农杆菌属介导的基因转移（amgt）的植物转移dna（pt-dna），其中所述pt-dna包含所关注的多核苷酸并且仅具有来自植物的dna，其中所述pt-dna的5'端包含用于整合到所述基因组中的左边界的一部分或具有所述左边界，并且所述pt-dna的3'端包含用于整合到所述基因组中的右边界的一部分，并且其中

21、i）所述pt-dna是小麦转移dna（wt-dna），并且其中所述左边界包含seq id no:1340、seq id no: 1450、seq id no: 877、seq id no: 1451、seq id no: 880、seq id no:1452、seq id no: 882、seq id no: 883、seq id no: 884、seq id no: 885、seq id no:887、seq id no: 1453、seq id no: 890、seq id no: 1454、seq id no: 893、seq id no:1455、seq id no: 896、seq id no: 1456、seq id no: 899、seq id no: 1457、seq id no:902、seq id no: 1458、seq id no: 905、seq id no: 1459、seq id no: 908、seq id no:1460、seq id no: 911、seq id no: 1461、seq id no: 914、seq id no: 1462、seq id no:917、seq id no: 1463、seq id no: 874、seq id no: 1464、seq id no: 922或seq id no:1465，或

22、ii）所述pt-dna是大豆转移dna（st-dna），并且其中所述左边界包含seq id no:977、seq id no: 1466、seq id no: 974、seq id no: 1467、seq id no: 982、seq id no:1468、seq id no: 985、seq id no: 1469、seq id no: 988、seq id no: 1470、seq id no:991、seq id no: 1471、seq id no: 994、seq id no: 1472、seq id no: 997或seq id no:1473，或

23、iii）所述植物是大麦，并且所述左边界包含seq id no: 1500、seq id no: 607、seq id no: 1474、seq id no: 612、seq id no: 1475、seq id no: 615、seq id no:1476、seq id no: 618、seq id no: 1477、seq id no: 621、seq id no: 1478、seq id no:624、seq id no: 1479、seq id no: 627、seq id no: 1480、seq id no: 630、seq id no:1481、seq id no: 624、seq id no: 1482、seq id no: 635、seq id no: 1483、seq id no:638或seq id no: 1484，或

24、iv）所述植物是甘蔗，并且所述左边界包含seq id no: 683、seq id no: 1485、seq id no: 686、seq id no: 1486、seq id no: 689、seq id no: 1487、seq id no: 692、seq id no: 1488、seq id no: 695、seq id no: 1489、seq id no: 698、seq id no:1490、seq id no: 1011、seq id no: 1491、seq id no: 703、seq id no: 1492、seq idno: 706、seq id no: 1493、seq id no: 709或seq id no: 1494。

25、在一实施例中，wt-dna左边界包含5'-tggcaggatatattgtggtgtaaactctatcaactggtactgtattatccaccttatacgcgtcatcatttgtgccaacattggtgtggtctagggtataaataagacagacatatgccctccatcagttaatttcagtcaaccaattcctgaatcaaccaggctctgcaagagaagagtcgcggctcggggtgacttttgtttctaagctgcatgtggttctgagattgagaattcctcatttggtttcacattcttaagcatgattactccattcttaattgggcctataactcatagcagagcatacacatttgaatttctttattatcttcttgaacaattactttttgtcaattcatattccatag-3'（seq id no: 1311），或其包含5'-tggcaggatatattgtggtgtaaact-3'（seq id no: 1340）的5'片段。

26、在一实施例中，wt-dna左边界包含5'-cggcaggatatattgtggtgtaaactctatcaactggtactgtattatccaccttatacgcgtcatcatttgtgccaacattggtgtggtctagggtataaataagacagacatatgccctccatcagttaatttcagtcaaccaattcctgaatcaaccaggctctgcaagagaagagtcgcggctcggggtgacttttgtttctaagctgcatgtggttctgagattgagaattcctcatttggtttcacattcttaagcatgattactccattcttaattgggcctataactcatagcagagcatacacatttgaatttctttattatcttcttgaacaattactttttgtcaattcatattccatag-3'（seq id no: 1496），或其包含5'-cggcaggatatattgtggtgtaaac-3'（seq id no: 1450）的5'片段。

27、在一实施例中，wt-dna左边界包含5'-tggtaggatatattgtggtgtgatttgtgggccagctctcatattttacaaaactcatttggtgcccaaacaattagccaaaacagaaaagaaaagaaataaaagaaagtataaataaaaagaaaggcctggcctttactgtgccaccgggcctaagtgctacagtgcacaaaggcccagcccacgtcggccttccact-3'（seq id no: 1497），或其包含5'-tggtaggatatattgtggtgtgatt-3'（seqid no: 874）的5'片段。

28、在一实施例中，wt-dna左边界包含5'-cggtaggatatattgtggtgtgatttgtgggccagctctcatattttacaaaactcatttggtgcccaaacaattagccaaaacagaaaagaaaagaaataaaagaaagtataaataaaaagaaaggcctggcctttactgtgccaccgggcctaagtgctacagtgcacaaaggcccagcccacgtcggccttccact-3'（seq id no: 1498），或其包含5'-cggtaggatatattgtggtgtgatt-3'（seqid no: 1464）的5'片段。

29、另一方面，本发明提供了一种多核苷酸，其包含本发明的左边界和/或右边界。

30、另一方面，本发明提供了一种产生经基因修饰的植物的方法，所述方法包含使植物细胞与农杆菌（

agrobacteriumsp.）接触，所述农杆菌包含本发明的ti质粒。

31、在一实施例中，所述细胞是受伤的植物组织外植体的细胞。

32、在一实施例中，在与所述农杆菌接触之后，培养所述外植体以产生愈伤组织。

33、在一实施例中，所述方法进一步包含由所述愈伤组织产生植物。

34、在一实施例中，所述方法进一步包含筛选所述植物的本发明的所述wt-dna、本发明的所述st-dna或本发明的所述pt-dna。

35、在一实施例中，所述方法进一步包含在所述植物的种系细胞中筛选所述植物的所述wt-dna、所述st-dna或所述pt-dna。

36、在一实施例中，所述方法进一步包含在所述植物的种系细胞中由具有所述wt-dna、所述st-dna、所述pt-dna的植物产生子代植物。

37、在另外的方面，本发明一种通过本发明的方法产生的植物，或一种具有本发明的wt-dna、本发明的st-dna或本发明的pt-dna的植物。

38、另一方面，本发明提供了一种产生经基因修饰的植物的方法，所述方法包含以下步骤：

39、i）将两种亲本植物杂交，其中至少一种植物是本发明的植物，

40、ii）筛选来自i）中的所述杂交的一个或多个子代植物存在或不存在本发明的所述wt-dna、本发明的所述st-dna或本发明的所述pt-dna，以及

41、iii）选择包含本发明的所述wt-dna、本发明的所述st-dna或本发明的所述pt-dna的子代植物，

42、由此产生所述植物。

43、在另外的方面，本发明提供了一种产生经基因修饰的植物的方法，所述方法包含以下步骤：

44、i）将两种亲本植物杂交，其中至少一种植物是本发明的植物，

45、ii）筛选来自i）中的所述杂交的一个或多个子代植物存在或不存在整合的pt-dna，以及

46、iii）选择包含所述整合的pt-dna的子代植物，

47、由此产生所述植物。

48、在一实施例中，一种亲本植物是具有本发明的t-dna的植物，并且另一种亲本植物是表达转座酶的转基因植物，并且步骤ii）包含筛选来自所述杂交的所述一个或多个子代植物存在或不存在所述第二组分，并且步骤iii）包含选择缺乏所述第二组分的子代。

49、在一实施例中，步骤ii）包含分析包含来自所述植物的dna的样品的所述wt-dna、所述st-dna或所述pt-dna。

50、在一实施例中，步骤iii）包含选择对于所述wt-dna、所述st-dna或所述pt-dna是纯合的子代植物。

51、在一实施例中，所述方法进一步包含：

52、iv）使步骤i）的所述杂交的子代与缺乏所述wt-dna或所述st-dna的与第一亲本植物具有相同基因型的植物回交足够次数，以产生具有第一亲本的大部分基因型但包含所述wt-dna或所述st-dna的植物，以及

53、v）选择具有所述wt-dna或所述st-dna的子代植物。

54、还提供了一种使用本发明的方法产生的植物。

55、另一方面，本发明提供了一种鉴定本发明的植物的方法，所述方法包含：

56、i）从包含基因组dna的植物获得样品，

57、ii）筛选所述样品存在或不存在本发明的所述wt-dna、本发明的所述st-dna或本发明的所述pt-dna。

58、另一方面，本发明提供了一种鉴定本发明的植物的方法，所述方法包含：

59、i）从包含基因组dna的植物获得样品，

60、ii）筛选所述样品存在或不存在整合的pt-dna。

61、在一实施例中，所述植物是具有本发明的t-dna的植物，并且所述方法进一步包含筛选所述样品不存在所述第二组分。

62、在一实施例中，所述植物是小麦植物，并且步骤ii）包含分析所述dna存在所述wt-dna。

63、在一实施例中，所述植物是大麦植物，并且步骤ii）包含分析所述dna存在大麦pt-dna。

64、在一实施例中，所述植物是甘蔗植物，并且步骤ii）包含分析所述dna存在甘蔗pt-dna。

65、在一实施例中，所述植物是大豆植物，并且步骤ii）包含分析所述dna存在所述st-dna。

66、在一实施例中，步骤ii）包含使用聚合酶链式反应来扩增包含所述wt-dna或所述st-dna的基因组区。

67、在一实施例中，使用寡核苷酸引物实现扩增，所述寡核苷酸引物包含如seq idno: 1至12中的任一者提供的核苷酸的序列，或可以用于扩增基因组的相同区的其变体。

68、在一实施例中，使用寡核苷酸引物实现扩增，所述寡核苷酸引物包含如seq idno: 1031至1044中的任一者提供的核苷酸的序列，或可以用于扩增基因组的相同区的其变体。

69、在一实施例中，步骤ii）包含对由基因组dna产生的扩增子进行测序。

70、在另外的方面，本发明提供了一种产生用于农杆菌属介导的基因转移（amgt）的t-dna的左边界的方法，所述方法包含：

71、i）在所关注的植物物种的基因组中搜索长度为22个至25个碱基并且与农杆菌ti质粒左边界共享至少16个核苷酸的多核苷酸，其中

72、a）如果所述多核苷酸的长度为22个碱基，则在所述基因组中搜索与所述农杆菌ti质粒左边界的22个3'核苷酸共享至少16个核苷酸的多核苷酸，

73、b）如果所述多核苷酸的长度为23个碱基，则在所述基因组中搜索与所述农杆菌ti质粒左边界的23个3'核苷酸共享至少16个核苷酸的多核苷酸，

74、c）如果所述多核苷酸的长度为24个碱基，则在所述基因组中搜索与所述农杆菌ti质粒左边界的24个3'核苷酸共享至少16个核苷酸的多核苷酸，

75、ii）产生具有左边界序列的t-dna，其中

76、a）所述t-dna的左边界包含所述多核苷酸，其中所述多核苷酸的长度为25个碱基，或

77、b）如果所述多核苷酸不具有5'-tgg或5'-cgg和/或长度不为25个碱基，则所述多核苷酸被修饰，使得其长度为25个碱基并且具有5'-tgg或5'-cgg以产生所述左边界序列，以及

78、iii）使用amgt来确定所述t-dna是否可用于转化所述所关注的植物物种。

79、在一实施例中，如果植物被转化，则确定整合到植物的基因组中的左边界的所述部分是否缺乏5'-tgg或5'-cgg。

80、在另外的方面，本发明提供了一种产生用于农杆菌属介导的基因转移（amgt）的t-dna的左边界的方法，所述方法包含：

81、i）在所关注的植物物种的基因组中搜索长度为22个至25个碱基并且与农杆菌ti质粒左边界共享至少16个核苷酸的多核苷酸，其中

82、a）如果所述多核苷酸的长度为22个碱基，则在所述基因组中搜索与所述农杆菌ti质粒左边界的22个3'核苷酸共享至少16个核苷酸的多核苷酸，

83、b）如果所述多核苷酸的长度为23个碱基，则在所述基因组中搜索与所述农杆菌ti质粒左边界的23个3'核苷酸共享至少16个核苷酸的多核苷酸，

84、c）如果所述多核苷酸的长度为24个碱基，则在所述基因组中搜索与所述农杆菌ti质粒左边界的24个3'核苷酸共享至少16个核苷酸的多核苷酸，

85、ii）产生具有左边界序列的t-dna，其中如果所述多核苷酸不具有5'-tggcagga或5'-cggcagga和/或长度不为25个碱基，则所述多核苷酸被修饰，使得其长度为25个碱基并且具有5'-tggcagga或5'-cggcagga以产生所述左边界，以及

86、iii）使用amgt来确定所述t-dna是否可用于转化所述所关注的植物物种。

87、在一实施例中，如果植物被转化，则确定整合到植物的基因组中的左边界的所述部分是否缺乏5'-tggcagga或5'-cggcagga。

88、在一实施例中，步骤i）包含在所关注的植物物种的基因组中搜索长度为22个至25个碱基并且与农杆菌ti质粒左边界共享16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个或24个核苷酸的多核苷酸。

89、在一实施例中，步骤i）包含在所关注的植物物种的基因组中搜索长度为22个碱基并且与农杆菌ti质粒左边界的22个3'核苷酸共享至少16个核苷酸的多核苷酸。

90、在一实施例中，农杆菌ti质粒左边界的22个3'核苷酸是5'-caggatatattgtggtgtaaac-3' seq id no: 769。

91、在一实施例中，农杆菌ti质粒左边界的22个3'核苷酸是5'-caggatatattgaattgtaaat-3' seq id no: 765。

92、在一实施例中，农杆菌ti质粒左边界的22个3'核苷酸是5'-caggatatattcaattgtaaac-3' seq id no: 766。

93、在一实施例中，农杆菌ti质粒左边界的22个3'核苷酸是5'-caggatatatttagttgtaaaa-3' seq id no: 767。

94、在一实施例中，农杆菌ti质粒左边界的22个3'核苷酸是5'-caggatatattgtgatgtaaac-3' seq id no: 768。

95、在一实施例中，农杆菌ti质粒左边界的22个3'核苷酸是5'-caggatatatcaaagtgtaagt-3' seq id no: 770。

96、在一实施例中，农杆菌ti质粒左边界的22个3'核苷酸是5'-caggatatatcgaggtgtaaaa-3' seq id no: 771。

97、在一实施例中，农杆菌ti质粒左边界的22个3'核苷酸是5'-caggatgtattgtcatgtaaaa-3' seq id no: 772。

98、在一实施例中，农杆菌ti质粒左边界的22个3'核苷酸是5'-caggatatatcgttatgtaatc-3' seq id no: 773。

99、在一实施例中，农杆菌ti质粒左边界的22个3'核苷酸是5'-caggatatattggtgtgtaaac-3' seq id no: 774。

100、在一实施例中，步骤iii）中使用的ti质粒是本发明的ti质粒。

101、在一实施例中，步骤iv）包含确定整合到植物的基因组中的t-dna是否仅具有所述植物属的dna。在一实施例中，属是小麦属。

102、在一实施例中，步骤iv）包含确定整合到植物的基因组中的t-dna是否仅具有所述植物物种的dna。

103、在一实施例中，植物是谷类植物。

104、在一实施例中，植物是小麦、大豆、水稻、番茄、甘蔗、马铃薯、香蕉、高粱、葡萄或燕麦。在一实施例中，植物是小麦、大豆、水稻、番茄、甘蔗、马铃薯、香蕉或高粱。

105、还提供了一种通过本发明的方法产生的植物。

106、还需要dna构建体，其可以用于增强针对一种或多种真菌病原体的植物内抗性，并且也不太容易使病原体逃避抗性。虽然已经鉴定了许多对一种或多种真菌病原体赋予增强的抗性的蛋白质，但是当作为单个基因部署时，许多蛋白质的抗性被克服了。本发明人已经鉴定了真菌抗性基因的新组合，其提供了稳定的构建体，可以用于赋予广泛的真菌抗性并减少由于植物抗性的多基因性质而导致病原体产生抗性的机会。

107、因此，在另外的方面，本发明提供了一种dna构建体，其包含编码以下的基因：

108、i）第一多肽，所述第一多肽包含如seq id no: 13提供的氨基酸序列或与seq idno: 13至少85%相同的氨基酸序列，

109、ii）第二多肽，所述第二多肽包含如seq id no: 14提供的氨基酸序列或与seq idno: 14至少85%相同的氨基酸序列，

110、iii）第三多肽，所述第三多肽包含如seq id no: 15提供的氨基酸序列或与seqid no: 15至少85%相同的氨基酸序列，

111、iv）第四多肽，所述第四多肽包含如seq id no: 16提供的氨基酸序列或与seq idno: 16至少85%相同的氨基酸序列，

112、v）第五多肽，所述第五多肽包含如seq id no: 17提供的氨基酸序列或与seq idno: 17至少85%相同的氨基酸序列，

113、其中每个基因包含能够指导基因在植物细胞中表达的启动子，并且其中每个多肽赋予对一种或多种真菌病原体的增强的抗性。

114、在一实施例中，细胞是茎细胞和/或叶细胞。

115、在一实施例中，第一多肽包含如seq id no: 13提供的氨基酸序列，或与seq idno: 13至少90%相同的氨基酸序列。

116、在一实施例中，第二多肽包含如seq id no: 14提供的氨基酸序列，或与seq idno: 14至少90%相同的氨基酸序列。

117、在一实施例中，第三多肽包含如seq id no: 15提供的氨基酸序列或与seq idno: 15至少90%相同的氨基酸序列。

118、在一实施例中，第四多肽包含如seq id no: 16提供的氨基酸序列或与seq idno: 16至少90%相同的氨基酸序列。

119、在一实施例中，第五多肽包含如seq id no: 17提供的氨基酸序列或与seq idno: 17至少90%相同的氨基酸序列。

120、在一实施例中，第一多肽包含如seq id no: 13提供的氨基酸序列，或与seq idno: 13至少95%相同的氨基酸序列。

121、在一实施例中，第二多肽包含如seq id no: 14提供的氨基酸序列，或与seq idno: 14至少95%相同的氨基酸序列。

122、在一实施例中，第三多肽包含如seq id no: 15提供的氨基酸序列或与seq idno: 15至少95%相同的氨基酸序列。

123、在一实施例中，第四多肽包含如seq id no: 16提供的氨基酸序列或与seq idno: 16至少95%相同的氨基酸序列。

124、在一实施例中，第五多肽包含如seq id no: 17提供的氨基酸序列或与seq idno: 17至少95%相同的氨基酸序列。

125、在一实施例中，第一多肽包含如seq id no: 13所提供的氨基酸序列。

126、在一实施例中，第二多肽包含如seq id no: 14所提供的氨基酸序列。

127、在一实施例中，第三多肽包含如seq id no: 15所提供的氨基酸序列。

128、在一实施例中，第四多肽包含如seq id no: 16所提供的氨基酸序列。

129、在一实施例中，第五多肽包含如seq id no: 17所提供的氨基酸序列。

130、在一实施例中，编码第一多肽的多核苷酸编码如seq id no: 19提供的核苷酸序列，或与seq id no: 19至少80%相同的核苷酸序列。

131、在一实施例中，编码第二多肽的多核苷酸编码如seq id no: 21提供的核苷酸序列，或与seq id no: 21至少80%相同的核苷酸序列。

132、在一实施例中，编码第三多肽的多核苷酸编码如seq id no: 23提供的核苷酸序列，或与seq id no: 23至少80%相同的核苷酸序列。

133、在一实施例中，编码第四多肽的多核苷酸编码如seq id no: 25提供的核苷酸序列或与seq id no: 25至少80%相同的核苷酸序列。

134、在一实施例中，编码第五多肽的多核苷酸编码如seq id no: 27提供的核苷酸序列，或与seq id no: 27至少80%相同的核苷酸序列。

135、在一实施例中，编码第一多肽的多核苷酸编码如seq id no: 19提供的核苷酸序列，或与seq id no: 19至少90%相同的核苷酸序列。

136、在一实施例中，编码第二多肽的多核苷酸编码如seq id no: 21提供的核苷酸序列，或与seq id no: 21至少90%相同的核苷酸序列。

137、在一实施例中，编码第三多肽的多核苷酸编码如seq id no: 23提供的核苷酸序列，或与seq id no: 23至少90%相同的核苷酸序列。

138、在一实施例中，编码第四多肽的多核苷酸编码如seq id no: 25提供的核苷酸序列或与seq id no: 25至少90%相同的核苷酸序列。

139、在一实施例中，编码第五多肽的多核苷酸编码如seq id no: 27提供的核苷酸序列，或与seq id no: 27至少90%相同的核苷酸序列。

140、在一实施例中，编码第一多肽的多核苷酸编码如seq id no: 19提供的核苷酸序列，或与seq id no: 19至少95%相同的核苷酸序列。

141、在一实施例中，编码第二多肽的多核苷酸编码如seq id no: 21提供的核苷酸序列，或与seq id no: 21至少95%相同的核苷酸序列。

142、在一实施例中，编码第三多肽的多核苷酸编码如seq id no: 23提供的核苷酸序列，或与seq id no: 23至少95%相同的核苷酸序列。

143、在一实施例中，编码第四多肽的多核苷酸编码如seq id no: 25提供的核苷酸序列或与seq id no: 25至少95%相同的核苷酸序列。

144、在一实施例中，编码第五多肽的多核苷酸编码如seq id no: 27提供的核苷酸序列，或与seq id no: 27至少95%相同的核苷酸序列。

145、在一实施例中，编码第一多肽的基因包含如seq id no: 18或seq id no: 19提供的核苷酸序列。

146、在一实施例中，编码第二多肽的基因包含如seq id no: 20或seq id no: 21提供的核苷酸序列。

147、在一实施例中，编码第三多肽的基因包含如seq id no: 22或seq id no: 23提供的核苷酸序列。

148、在一实施例中，编码第四多肽的基因包含如seq id no: 24或seq id no: 25提供的核苷酸序列。

149、在一实施例中，编码第五多肽的基因包含如seq id no: 26或seq id no: 27提供的核苷酸序列。

150、在一实施例中，dna构建体包含如seq id no: 28提供的核苷酸序列，或与seq idno: 28至少80%相同、至少90%相同或至少95%相同的核苷酸序列。

151、在一实施例中，每种多肽对柄锈菌（

pucciniasp.）赋予抗性，如禾柄锈菌（

puccinia graminis，茎锈病）、条锈菌（puccinia striiformis，条锈病）、叶锈菌（puccinia triticina，叶锈病）中的一种或多种或全部。

152、在另外的方面，本发明提供了一种dna构建体，其包含编码以下的基因：

153、i）第一多肽，所述第一多肽包含如seq id no: 1271提供的氨基酸序列或与seqid no: 1271至少85%相同的氨基酸序列，

154、ii）第二多肽，所述第二多肽包含如seq id no: 1272提供的氨基酸序列，或与seqid no: 1272至少85%相同的氨基酸序列，

155、iii）第三多肽，所述第三多肽包含如seq id no: 1273提供的氨基酸序列或与seqid no: 1273至少85%相同的氨基酸序列，

156、iv）第四多肽，所述第四多肽包含如seq id no: 1274提供的氨基酸序列或与seqid no: 1274至少85%相同的氨基酸序列，

157、v）第五多肽，所述第五多肽包含如seq id no: 1275提供的氨基酸序列或与seqid no: 1275至少85%相同的氨基酸序列，

158、其中每个基因包含能够指导基因在植物细胞中表达的启动子，并且其中每个多肽赋予对一种或多种真菌病原体的增强的抗性。

159、在一实施例中，细胞是茎细胞和/或叶细胞。

160、在一实施例中，第一多肽包含如seq id no: 1271提供的氨基酸序列，或与seq idno: 1271至少90%相同的氨基酸序列。

161、在一实施例中，第二多肽包含如seq id no: 1272提供的氨基酸序列，或与seq idno: 1272至少90%相同的氨基酸序列。

162、在一实施例中，第三多肽包含如seq id no: 1273提供的氨基酸序列或与seq idno: 1273至少90%相同的氨基酸序列。

163、在一实施例中，第四多肽包含如seq id no: 1274提供的氨基酸序列或与seq idno: 1274至少90%相同的氨基酸序列。

164、在一实施例中，第五多肽包含如seq id no: 1275提供的氨基酸序列或与seq idno: 1275至少90%相同的氨基酸序列。

165、在一实施例中，第一多肽包含如seq id no: 1271提供的氨基酸序列，或与seq idno: 1271至少95%相同的氨基酸序列。

166、在一实施例中，第二多肽包含如seq id no: 1272提供的氨基酸序列，或与seq idno: 1272至少95%相同的氨基酸序列。

167、在一实施例中，第三多肽包含如seq id no: 1273提供的氨基酸序列或与seq idno: 1273至少95%相同的氨基酸序列。

168、在一实施例中，第四多肽包含如seq id no: 1274提供的氨基酸序列或与seq idno: 1274至少95%相同的氨基酸序列。

169、在一实施例中，第五多肽包含如seq id no: 1275提供的氨基酸序列或与seq idno: 1275至少95%相同的氨基酸序列。

170、在一实施例中，第一多肽包含如seq id no: 1271提供的氨基酸序列。

171、在一实施例中，第二多肽包含如seq id no: 1272提供的氨基酸序列。

172、在一实施例中，第三多肽包含如seq id no: 1273提供的氨基酸序列。

173、在一实施例中，第四多肽包含如seq id no: 1274所提供的氨基酸序列。

174、在一实施例中，第五多肽包含如seq id no: 1275提供的氨基酸序列。

175、在一实施例中，编码第一多肽的多核苷酸编码如seq id no: 1276提供的核苷酸序列，或与seq id no: 1276至少80%相同的核苷酸序列。

176、在一实施例中，编码第二多肽的多核苷酸编码如seq id no: 1277提供的核苷酸序列，或与seq id no: 1277至少80%相同的核苷酸序列。

177、在一实施例中，编码第三多肽的多核苷酸编码如seq id no: 1278提供的核苷酸序列，或与seq id no: 1278至少80%相同的核苷酸序列。

178、在一实施例中，编码第四多肽的多核苷酸编码如seq id no: 1279提供的核苷酸序列或与seq id no: 1279至少80%相同的核苷酸序列。

179、在一实施例中，编码第五多肽的多核苷酸编码如seq id no: 1280提供的核苷酸序列，或与seq id no: 1280至少80%相同的核苷酸序列。

180、在一实施例中，编码第一多肽的多核苷酸编码如seq id no: 1276提供的核苷酸序列，或与seq id no: 1276至少90%相同的核苷酸序列。

181、在一实施例中，编码第二多肽的多核苷酸编码如seq id no: 1277提供的核苷酸序列，或与seq id no: 1277至少90%相同的核苷酸序列。

182、在一实施例中，编码第三多肽的多核苷酸编码如seq id no: 1278提供的核苷酸序列，或与seq id no: 1278至少90%相同的核苷酸序列。

183、在一实施例中，编码第四多肽的多核苷酸编码如seq id no: 1279提供的核苷酸序列或与seq id no: 1279至少90%相同的核苷酸序列。

184、在一实施例中，编码第五多肽的多核苷酸编码如seq id no: 1280提供的核苷酸序列，或与seq id no: 1280至少90%相同的核苷酸序列。

185、在一实施例中，编码第一多肽的多核苷酸编码如seq id no: 1276提供的核苷酸序列，或与seq id no: 1276至少95%相同的核苷酸序列。

186、在一实施例中，编码第二多肽的多核苷酸编码如seq id no: 1277提供的核苷酸序列，或与seq id no: 1277至少95%相同的核苷酸序列。

187、在一实施例中，编码第三多肽的多核苷酸编码如seq id no: 1278提供的核苷酸序列，或与seq id no: 1278至少95%相同的核苷酸序列。

188、在一实施例中，编码第四多肽的多核苷酸编码如seq id no: 1279提供的核苷酸序列或与seq id no: 1279至少95%相同的核苷酸序列。

189、在一实施例中，编码第五多肽的多核苷酸编码如seq id no: 1280提供的核苷酸序列，或与seq id no: 1280至少95%相同的核苷酸序列。

190、在一实施例中，编码第一多肽的基因包含如seq id no: 1502或seq id no: 1276提供的核苷酸序列。

191、在一实施例中，编码第二多肽的基因包含如seq id no: 1503或seq id no: 1277提供的核苷酸序列。

192、在一实施例中，编码第三多肽的基因包含如seq id no: 1504或seq id no: 1278提供的核苷酸序列。

193、在一实施例中，编码第四多肽的基因包含如seq id no: 1505或seq id no: 1279提供的核苷酸序列。

194、在一实施例中，编码第五多肽的基因包含如seq id no: 1506或seq id no: 1280提供的核苷酸序列。

195、在一实施例中，dna构建体包含如seq id no: 1448提供的核苷酸序列，或与seqid no: 1448至少80%相同、至少90%相同或至少95%相同的核苷酸序列。

196、在一实施例中，一种或多种或所有多肽赋予对柄锈菌的抗性。在一实施例中，所述多肽中的一种或多种或全部赋予对小麦条锈菌（小麦条锈病）的抗性。

197、在另外的方面，本发明提供了一种t-dna，其包含本发明的dna构建体。

198、在一实施例中，t-dna是本发明的wt-dna、本发明的st-dna或本发明的pt-dna。

199、在另外的方面，本发明提供了一种嵌合载体，其包含本发明的dna构建体。在另外的方面，本发明提供了一种t-dna，其包含本发明的dna构建体。

200、在一实施例中，载体是本发明的ti质粒。

201、在另外的方面，本发明提供了一种重组细胞，其包含本发明的dna构建体、本发明的t-dna或本发明的载体。在一实施例中，重组细胞是细菌细胞。

202、在一实施例中，重组细胞是包含本发明的ti质粒的农杆菌属。

203、在另外的方面，本发明提供了一种产生本发明的细胞的方法，所述方法包含将本发明的dna构建体、本发明的t-dna或本发明的载体引入细胞中的步骤。

204、另一方面，本发明提供了一种用于将dna插入植物细胞中的农杆菌属介导的转化方法，所述方法包含：

205、i）在允许包含本发明的ti质粒的农杆菌属细菌感染植物细胞的条件下，使所述植物细胞与所述农杆菌属细菌接触，由此转化所述植物细胞，

206、ii）选择和筛选经转化的植物细胞；以及

207、iii）由所选择和筛选的植物细胞再生全转基因植物。

208、在另外的方面，本发明提供了一种产生如本文所定义的第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽的方法，所述方法包含在细胞或无细胞表达系统中表达本发明的dna构建体、本发明的t-dna或本发明的载体中的基因。

209、在另外的方面，本发明提供了一种经基因修饰的植物，其包含本发明的dna构建体。

210、在一实施例中，当与缺乏dna构建体的对应野生型植物相比时，植物对一种或多种真菌病原体具有增强的抗性。

211、在一实施例中，所述一种或多种真菌病原体包括以下中的一种或多种或全部：柄锈菌、布氏白粉菌（

blumeriasp.）、镰刀菌（

fusariumsp.）、稻瘟菌（

magnoporthesp.）、平脐蠕孢菌（

bipolarissp.）、粉孢菌（

oidiumsp.）、赤霉菌（

gibberellasp.）、旋孢腔菌（

cochliobolussp.）、突脐蠕孢菌（

exserohilumsp.）、夏孢子菌（

uredosp.）、微座孢菌（

microdochiumsp.）、长蠕孢菌（

helminthosporiumsp.）、明梭孢菌（

monographellasp.）、炭疽菌（

colletotrichumsp.）、单胞锈菌（

uromycessp.）或白粉菌（

erysiphesp.）。

212、在一实施例中，当与缺乏dna构建体的对应野生型植物相比时，植物对茎锈病、叶锈病或条锈病中的一种或多种或全部具有增强的抗性。

213、在一实施例中，当与缺乏dna构建体的对应野生型植物相比时，植物对茎锈病具有增强的抗性。

214、在一实施例中，植物是谷类植物。本发明的谷类植物实例包括但不限于小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、玉米（corn）、高粱或玉米（maize）。在一实施例中，植物是小麦植物。

215、在一实施例中，植物是大豆或香蕉植物。

216、在一实施例中，植物对于dna构建体是纯合的。

217、在一实施例中，植物仅包含在相同物种的植物（如小麦）中发现的dna。

218、在一实施例中，植物仅包含在相同物种的植物中发现的dna。

219、在另外的方面，本发明提供了一种产生具有本发明的dna构建体的植物的方法，所述方法包含以下步骤：

220、i）将本发明的dna构建体引入植物细胞，

221、ii）用来自所述细胞的所述dna构建体再生植物，以及

222、iii）任选地从所述植物采集种子，和/或

223、iv）任选地产生一个或多个子代植物，

224、由此产生所述植物。

225、在一实施例中，dna构建体在肿瘤诱导（ti）质粒的t-dna中，并使用农杆菌属介导的基因转移（amgt）引入。

226、在另外的方面，本发明提供了一种产生具有本发明的dna构建体的植物的方法，所述方法包含以下步骤：

227、i）使两种亲本植物杂交，其中至少一种植物包含本发明的dna构建体，

228、ii）筛选来自i）中的所述杂交的一个或多个子代植物存在或不存在所述dna构建体，以及

229、iii）选择包含所述dna构建体的子代植物，

230、由此产生所述植物。

231、在一实施例中，步骤ii）包含分析包含来自植物的dna的样品的所述dna构建体。

232、在一实施例中，步骤iii）包含：

233、i）选择对于所述dna构建体是纯合的子代植物，和/或

234、ii）分析所述植物或其一个或多个子代植物对一种或多种真菌病原体的增强的抗性。

235、在一实施例中，所述方法进一步包含：

236、iv）使步骤i）的所述杂交的子代与缺乏所述dna构建体的与第一亲本植物具有相同基因型的植物回交足够次数，以产生具有第一亲本的大部分基因型但包含所述dna构建体的植物，以及

237、v）选择对一种或多种真菌病原体具有增强的抗性的子代植物。

238、还提供了使用本发明的方法产生的植物。

239、在另外的方面，本发明提供了一种用于鉴定对一种或多种真菌病原体具有增强的抗性的植物的方法，所述方法包含以下步骤：

240、i）从植物获得样品，以及

241、ii）筛选所述样品存在或不存在本发明的dna构建体。

242、在一实施例中，所述筛选包含扩增所述植物的基因组区。

243、还提供了本发明的ti质粒、本发明的wt-dna、本发明的st-dna、本发明的pt-dna、本发明的多核苷酸或本发明的dna构建体的用途，其用于产生重组细胞和/或经基因修饰的植物。

244、在一实施例中，本发明的植物在田间生长。

245、在另外的方面，本发明提供了在田间生长的至少100株本发明植物的群体。

246、在另外的方面，本发明提供了本发明的植物的植物部分。

247、在一实施例中，植物部分是包含本发明的wt-dna、本发明的st-dna、本发明的pt-dna、如本文所描述的t-dna或本发明的dna构建体的种子。

248、在另外的方面，本发明提供了一种产生植物部分的方法，所述方法包含：

249、a）使本发明的植物生长，以及

250、b）采集所述植物部分。

251、在一实施例中，植物部分是种子。

252、在另外的方面，本发明提供了一种产生从种子获得的面粉、全麦面粉、淀粉、籽粉、油或其它产物的方法，所述方法包含：

253、a）获得本发明的种子，以及

254、b）提取所述面粉、所述全麦面粉、所述淀粉、所述籽粉、所述油或所述其它产物。

255、在一实施例中，所述其它产物是糠。

256、在另外的方面，本发明提供了一种由本发明的植物和/或本发明的植物部分产生的产物，其中所述产物包含dna构建体、整合的t-dna或整合的pt-dna，如整合的wt-dna。

257、在一实施例中，其中所述部分是种子。

258、在一实施例中，所述产物是食品或饮料产品。

259、在一实施例中，所述食品选自由以下组成的组：面粉、淀粉、发酵或未发酵的面包、意大利面、面条、动物性饲料、动物饲料、早餐谷类、小吃食物、蛋糕、麦芽、糕点和含有基于面粉的酱汁的食物。

260、在一实施例中，所述饮料产品是啤酒、植物奶或麦芽。

261、在一实施例中，所述产物是非食品。

262、在另外的方面，本发明提供了一种制备本发明的食品的方法，所述方法包含将种子或从所述种子获得的面粉、全麦面粉、淀粉、籽粉或油与另一种食物成分混合。

263、在另外的方面，本发明提供了一种制备麦芽的方法，所述方法包含使本发明的种子发芽的步骤。

264、在另外的方面，本发明提供了本发明的植物或其部分的用途，其用作动物饲料或用于产生供动物食用的饲料或供人类食用的食物。

265、在另外的方面，本发明提供了本发明的植物的用途，其用于控制或限制作物生产中的一种或多种真菌病原体。

266、在另外的方面，本发明提供了一种组合物，其包含本发明的ti质粒、本发明的wt-dna、本发明的st-dna、本发明的pt-dna、本发明的多核苷酸或本发明的dna构建体以及一种或多种可接受的载剂。

267、在另外的方面，本发明提供了一种交易种子的方法，所述方法包含获得本发明的种子，以及将所获得的种子交易以获得金钱收益。

268、在一实施例中，获得种子包含培养本发明的植物和/或从植物采集种子。

269、在一实施例中，获得所述种子进一步包含将所述种子置于容器中和/或储存所述种子。

270、在一实施例中，获得所述种子进一步包含将所述种子运输到不同的位置。

271、在一实施例中，使用如计算机等电子装置进行所述交易。

272、在另外的方面，本发明提供了一种产生种子箱的方法，所述方法包含：

273、a）对包含本发明的种子的植物的地上部分进行打捆、堆料和/或收割，

274、b）脱粒和/或风选所述植物的所述部分以将所述种子与所述植物部分的其余部分分离，以及

275、c）筛分和/或分选在步骤b）中分离的所述种子，并将所筛分和/或分选的种子装载到箱中，由此产生种子箱。

276、除非另有特别说明，否则本文中的任何实施例在进行必要的修改后应被视为适用于任何其它实施例。

277、本发明的范围不受本文所描述的具体实施例的限制，所述具体实施例旨在仅用于例示的目的。如本文所描述的，功能等效的产物、组合物和方法显然在本发明的范围内。

278、贯穿本说明书，除非另外明确陈述或上下文另外要求，否则对单个步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组的提及应当被视为涵盖这些步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组中的一个和多个（即，一个或多个）。

279、在下文中通过以下非限制性实例并参考附图来描述本发明。