一种高通量PCR-免疫荧光量子点试纸条快速鉴定方法

本发明涉及肉类食品的分子鉴定及质量控制领域，使用分子生物学技术、免疫技术及生物化学技术建立的一种同时检测20种动物源性成分的高通量pcr-免疫荧光量子点试纸条快速鉴定方法。

背景技术：

1、

2、目前使用最为广泛的种属检测方法当属以 dna为检测对象的 pcr 及其衍生的实时荧光定量pcr、多重 pcr 技术、dna条形码技术及dna宏条形码技术。国内外监管部门已颁布了利用 pcr 技术、实时荧光定量 pcr技术鉴定动物源性成分的国家标准和行业标准，然而，这些标准大多针对单种动物源成分进行鉴定,是否掺杂有多种动物源性成分,则需要分别鉴定；并且，实时荧光定量 pcr除了引物外还需要荧光标记的探针，结果检测需要电脑相配合，检测成本高。多重 pcr 技术是在单一反应体系中同时完成多个物种鉴别，可以高通量检测，但是，在单一反应体系中各引物之间存在互相干扰问题，检测结果不稳定，目前文献报道最多为同时检测13种动物源性成分；dna条形码技术及dna宏条形码技术可实现高通量检测，但是检测结果需要测序、剪切、拼接及序列比对，测成本高、操作繁琐且耗时。在食品安全的现场监督管理工作中，亟需开发不依赖贵重仪器、特异灵敏、简便快速、成本低廉且具备高通量特性的鉴定技术，以实现多物种的同步检测，提升监管效率。

3、本研究对经典的基因组dna提取方法进行优化，最多需要20min即可提取出高质量的核酸，完全满足后继pcr实验的要求；采用高通量pcr技术，在各自的反应体系中、在同一个pcr仪器中、在同一的反应条件下，同时进行20种物种的pcr扩增；结果利用免疫荧光量子点试纸条进行可视化检测；总时间只需1h36min即可同时完成20种动物源性成分的真伪鉴定。本发明不需要贵重仪器配合、不需要专业技术人员、不需要专业实验室即可实现20种动物源性成分的同步检测。特异性强、灵敏度高、简单快速、准确、高效、低成本，可用于基层单位实地现场食品安全的快速筛查时使用。本发明具有一定的新颖性、创造性与实用性。

4、本发明可同时对20种动物源性成分进行高通量鉴定，对肉类食品的真实性进行把关，为食品监督管理部门和肉类食品生产、经营企业裁决肉类食品质量提供可靠依据，为我国肉类食品质量控制的方法学研究提供崭新的平台，为肉类食品走向世界提供可信的质量监控技术。

技术实现思路

1、本发明采用自主研发的基因组dna提取试剂，通过简化操作步骤、缩短提取时间，只需20min，即可完成动物源性成分基因组dna的提取，其浓度、纯度、完整性均满足后继pcr实验的要求。采用生物信息学技术以20种动物物种黄牛、水牛、牦牛、马、驴、山羊、绵羊、猪、狗、鹿、兔、鸡、鸭、鹅、貂、狐狸、貉、大鼠、小鼠、小鼠、猫的mtdna cytb基因和mtdna nd2基因作为靶基因，应用dna man软件比对分析基因序列中snp位点的差异，应用primer 5.0设计软件，设计20种物种的基因特异性引物。利用高通量pcr技术，在各自的pcr反应体系中、在同一个pcr仪器中、在同一个pcr反应条件下，同时进行20种动物源性成分的扩增，结果均利用免疫荧光量子点试纸条同时进行可视化检测，含有对应物种的试纸条检测图谱检测线（t线）和质控线（c线）均出现红色条带，不含对应物种的试纸条检测图谱均只有质控线（c线）出现红色条带，从而可以准确、快速、高效地同时鉴定20种动物源性成分。具有特异性强、灵敏度高、准确、简便、快速、低成本、高效率的特点，不需要贵重仪器的配合、在普通实验室、普通的检测人员按照操作流程都可进行标准化、规范化操作，适合基层单位实地现场食品安全的快速筛查时使用。

2、本发明的目的是在于研发一种同时检测20种动物源性成分的高通量快速鉴定方法。建立一种特异、灵敏、简便、快速、准确、低成本、高效的鉴定技术，提供一种适用于实地检测，标准化、规范化的检验技术。

3、本发明的目的是由以下技术方案来实现的：

4、一种高通量pcr-免疫荧光量子点试纸条快速鉴定方法。其特征是，它包含以下步骤：

5、1.20种动物源性成分：黄牛肉、水牛肉、牦牛肉、马肉、驴肉、山羊肉、绵羊肉、猪肉、狗肉、鹿肉、兔肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、貂肉、狐狸肉、貉肉、大鼠肉、小鼠肉、猫肉。

6、2.20种物种的特异性引物：

7、

8、

9、3.基因组dna的提取：

10、取待测样品0.1 g置 1.5 ml离心管中剪碎，加入细胞裂解液500 µl，充分混匀，在56℃水浴保温10 min；10000 rpm/min离心1 min；上清液加到 dna 纯化柱中，10000 rpm/min离心1 min；弃去过滤液，加入漂洗液600 µl，10000 rpm/min离心1 min；弃去过滤液，重复1次；弃去过滤液，再离心2 min，将dna 纯化柱转移入另一1.5 ml离心管中，加入洗脱液100 µl，室温放置2 min后，10000 rpm/min离心2 min；离心管中即为模板dna溶液，作为供试品-20℃冰箱中备用。

11、4.pcr反应体系：

12、模板dna溶液2 µl加入23 μl pcr反应预混液[与模板对应的特异性上游及下游引物（10 μm）各1 µl、2×taq pcr master mix 12.5 µl、灭菌ddh2o 8.5 µl]，总体积为25 µl。

13、建立20种物种各自的pcr反应体系。

14、5.pcr反应条件：

15、将20种物种的pcr反应管置于同一pcr反应仪中，在同一pcr反应条件：94℃预变性5 min，（94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s），27个循环，72℃充分延伸10 min，同时进行20种物种的pcr扩增。

16、6.免疫荧光量子点试纸条检测结果：

17、取20种物种各自的pcr产物取5 µl，分别滴加到各自的免疫荧光量子点试纸条的样品区，然后再分别加入95 µl展开缓冲液，2～3 min后在紫外透射仪下检测结果，并拍照。

18、7.结果判定：

19、含有对应物种的试纸条检测图谱均出现2条红色条带，不含对应物种的试纸条检测图谱均出现1条红色条带。参照附图1。

20、本发明同时检测20种动物源性成分的高通量pcr-免疫荧光量子点试纸条快速鉴定方法，具有高通量pcr技术的特异性强、灵敏度高的特点，具有试纸条简便、快速、成本低特征，具有高通量、高效的优势。不需要特殊贵重仪器的配合、不依赖于专业技术人员、不依赖高级的实验室，因此本发明适合更适合于实地现场检测使用。

1.一种高通量pcr-免疫荧光量子点试纸条快速鉴定方法。

2.一种如权利要求1一种高通量pcr-免疫荧光量子点试纸条快速鉴定方法，其特征在于，它包含以下步骤：