一种基于芯片式的高通量快速生产类器官微球的方法

本发明涉及生物医学工程，也属于微流控技术与组织工程技术的交叉领域，具体涉及一种基于手持微液滴芯片的无泵类器官微球生成方法。

背景技术：

1、类器官作为体外三维培养的微型组织模型，在再生医学、药物筛选和精准医疗领域展现出巨大应用潜力。类器官技术通过在体外模拟体内器官的微环境，使干细胞或器官特异性细胞能够自我组织并形成具有部分器官功能的微型结构，为疾病建模、个性化治疗和药物毒性评估提供了强有力的工具。

2、从技术发展历程来看，类器官培养技术经历了从二维培养到三维培养、从基质胶滴加法到微流控技术的演进过程。传统的类器官培养方法主要依赖手动滴加matrigel基质胶法，该方法由clevers团队于2009年首次建立并应用于肠道类器官培养。具体操作过程包括：将类器官细胞与matrigel基质胶混合后，用移液器手动滴加至培养板孔中，每滴体积约30-50μl，形成圆顶状结构，随后置于37°c培养箱中固化30-60分钟，最后添加培养基进行培养。这种方法虽然操作相对简单，但存在显著的局限性，包括微滴尺寸均一性差、细胞分布不均匀、通量低等问题。

3、现有类器官培养技术存在以下显著缺陷：

4、(1）传统手动滴加法均一性差：手动滴加法生成的基质胶微滴尺寸变异系数(cv值)通常大于10%，导致类器官发育异质性大，严重影响药物筛选结果的准确性和可重复性。

5、（2）现有微流控装置成本高昂、体积庞大：依赖外部泵阀系统，系统成本通常在5-10万美元，难以在临床床边或资源有限的实验室中推广应用。

6、（3）对微流控环境下基质胶流变学特性认识不足：传统宏观实验中，基质胶在4°c时表现为牛顿流体，粘度约为20-30 mpa·s，但在微米级流道中，基质胶的流变学行为会发生显著变化，现有技术往往忽视这种尺度效应。

7、（4）水凝胶固化时间长，细胞易沉降：传统方法中水凝胶固化时间为30-60分钟，细胞容易沉降到微球底部，导致细胞分布不均匀，影响类器官的形态发生和功能成熟。

8、（5）单细胞包裹效率低：由于缺乏有效的装置使用方法和精确的流体控制机制，类器官形成率通常低于50%。

9、（6）流体剪切力对细胞损伤大：传统微流控芯片中，细胞在通过狭窄流道时往往承受较高的剪切应力（50-100 pa），容易导致细胞膜损伤、细胞凋亡等问题。

技术实现思路

1、为了解决背景技术中存在的问题，本发明提出了一种基于芯片式的高通量快速生产类器官微球的方法。

2、本发明主要解决现有类器官培养技术中存在的成本高昂、操作复杂、设备体积庞大、微球均一性差、细胞易沉降以及单细胞包裹效率低等技术问题，实现了低成本、便携式、高通量的类器官微球制备。

3、本发明是利用手持微液滴生成装置生成微液滴进行类器官培养。

4、一、一种基于芯片式的高通量快速生产类器官微球的方法：

5、所述方法采用手持式无泵微流控芯片装置，包括以下步骤：

6、s1、各自组装无泵微流控芯片、注射器与注射器转换头，无泵微流控芯片与注射器转换头预处理：

7、在无泵微流控芯片上设置疏水薄膜和进行预冷处理，且确保装置之间连接紧密且温度适宜；

8、s2、基质胶前液制备：

9、将细胞重悬后和基质胶低温混合获得基质胶前液，且控制细胞密度和混合比例；

10、s3、无泵液滴生成微球：

11、利用无泵微流控芯片以无泵方式通过优化的推注速度将基质胶前液注入无泵微流控芯片中实现高均一性液滴生成；

12、s4、温度梯度固化：

13、通过三阶段温度梯度控制，使形成微球的基质胶原位凝胶化，实现微球内外均匀固化；

14、s5、凝胶化后的微球特殊的分离、洗涤和收集处理：

15、通过破乳对凝胶化后的微球进行特殊的分离处理，然后依次进行洗涤和收集处理，确保微球完整性和细胞活性。

16、所述无泵微流控芯片为手持式无泵微流控芯片。所述基质胶为水凝胶。

17、所述步骤s1具体为：

18、s11、将无泵微流控芯片与注射器转换头进行去污冲洗后干燥；

19、s11、在真空干燥环境下，在无泵微流控芯片表面上沉积疏水试剂，使得疏水试剂与芯片表面的硅羟基发生缩合反应，形成致密的疏水薄膜；

20、s12、处理后的无泵微流控芯片取出后高温烘烤，使得疏水薄膜与芯片表面形成牢固的si-o-si化学键合，从而提高疏水层的稳定性；

21、s12、将步骤s12获得的具有疏水薄膜的无泵微流控芯片与注射器转换头等操作工具置于0-4℃环境下预冷。

22、本发明的关键特征将装置预冷处理：4°c冰箱预冷30分钟，确保装置在后续操作中能够保持低温状态，避免基质胶在通过芯片时提前凝胶化。

23、所述疏水试剂为1h,1h,2h,2h-全氟辛基三氯硅烷（fots），利用真空气相沉积制备疏水试剂，所述步骤s12中的高温烘烤为置于120°c烘箱中烘烤30分钟。

24、所述基质胶采用matrigel基质胶。

25、所述步骤s2具体为：

26、s21、将matrigel基质胶置于4°c环境下使完全转化为液态；

27、s22、后在4°c环境下，在5分钟内吸取matrigel基质胶加入已事先4°c预冷的细胞悬液并混合均匀，获得基质胶前液；matrigel基质胶和细胞悬液中细胞之间的体积比为1：1-3：1。

28、上述细胞与基质胶比例设置范围为1:1至1:3，这一比例范围的确定基于细胞-基质胶相互作用的微观机制，能够实现稳定多细胞共包裹。

29、所述细胞悬液具体为小鼠的间充质骨髓干细胞；所述步骤s22中可以或者不加入细胞悬液，不进行包裹细胞处理。

30、所述步骤s3具体为：

31、s31、将注射器和芯片组合插件插入注射器主腔确保连接紧密后，将无泵微流控芯片的芯片端插入装有油相的容器中；

32、s32、在4℃下手持注射器以恒定速度推注，将基质胶前液注入到无泵微流控芯片中，使得从微流控芯片中输出液滴作为微球。

33、所述的油相组成为含span-80质量分数为2%的hfe-7500氟化油，所述推注速度为0.3-0.8 ml/min，优选的推注速度为0.5ml/min。

34、本发明的关键特征注射器推注速度控制为：在0.3-0.8 ml/min范围内，优选约0.5ml/min的匀速推注，能够实现高微球均一性。在该速度范围内，流道内的剪切速率约为100-500 s-1，基质胶处于最佳剪切稀化状态，粘度约为12-18 mpa·s。

35、所述步骤s4具体为：

36、s41、微球收集与预处理

37、在将基质胶前液推注入到无泵微流控芯片完成后，立即将连接着芯片的注射器从ep管中取出，静置一段施加30s使得液态微球浮出油相，待观察到液态微球在油相中呈球形且透明度高，并将ep管迅速转移到37℃±1℃环境中；

38、s42、然后按照以下采用梯度固化进行温敏固化处理：

39、- 阶段1： 35°c±1℃预固化5分钟，形成表面凝胶层，防止微球融合；

40、- 阶段2： 37°c±1℃完全固化15分钟，使内部完全凝胶化；

41、- 阶段3： 39°c±1℃后固化5分钟，使得最终凝胶内外整体凝胶化，提高凝胶强度。

42、所述步骤s5具体为：

43、s51、在温敏固化完成后，使用移液器小心移除下层油相；

44、s52、然后加入破乳剂，反复清洗多次以去除油相；

45、s53、最后再离心处理去除残留油相，加入培养基或所需水溶剂，溶解在其中的絮状沉淀即为类器官微球。

46、所述破乳剂为7500氟化液。

47、本发明的关键特征进行梯度固化三阶段温度控制：阶段1：35°c预固化5分钟，形成表面凝胶层，防止微球融合；阶段2：37°c完全固化15-20分钟，使内部完全凝胶化；阶段3：39°c后固化5分钟，实现快速且均匀固化，提高凝胶强度。

48、本发明方法中的关键步骤顺序和参数范围，特别是装置组装预冷步骤中的预冷温度和时间，液滴生成步骤中的推注速度和芯片浸入深度，梯度固化步骤中的三阶段温度控制和时间参数。

49、本发明采用了微流控液滴生成、无泵驱动、类器官三维培养、水凝胶微球制备和细胞微囊化等处理。

50、本发明提供了一种利用手持式无泵微流控装置，结合温敏水凝胶基质材料，通过优化的装置使用方法实现类器官微球高通量、均一化制备的技术方案。该技术方案无需外部泵阀系统驱动，通过手动推注即可实现细胞-水凝胶混合液的微球化生成，为类器官的低成本、便携式制备提供了新的技术途径。

51、与现有技术的区别在于：现有微流控类器官生成技术主要依赖外部泵阀系统实现精确流体控制，属于主动式微流控技术；而本发明采用手持无泵设计，通过优化的装置使用方法实现被动式液滴生成，属于无泵微流控技术在类器官培养领域的创新应用。

52、本发明发现了基质胶在微流控环境中的特殊流变学特性，包括微尺度下的剪切稀化效应、温度依赖性的相变动力学以及细胞-基质胶相互作用的微观机制。本发明通过计算流体力学模拟和细胞活性检测，揭示了多层凸起组结构的细胞保护机制，包括逐级减压效应。本发明创新性地开发了梯度固化技术，通过三阶段温度控制策略，解决了快速固化导致的微球内外固化不均匀问题。

53、本发明的核心技术创新点主要体现在以下四个方面：

54、第一，首次发现并揭示了matrigel在乳化液滴环境中的特殊流变学特性，包括微尺度下的剪切稀化效应（当剪切速率从10 s-1增加到1000 s-1时，matrigel的粘度从25mpa·s降至8 mpa·s，降低了约68%）、温度依赖性的相变动力学（对于直径200 μm的微球，凝胶化时间可以缩短至10-15分钟）以及细胞-基质胶相互作用的微观机制（细胞-基质胶复合物的形成使混合液粘度增加约15-20%）。这些科学发现为技术方案提供了重要的理论基础，填补了微流控生物材料领域的研究空白。

55、第二，创新性地开发了针对手持微液滴芯片多层凸起组结构的特定使用方法，包括优化的注射器推注速度控制（0.3-0.8 ml/min的匀速推注，优选0.5 ml/min）、流体加载顺序（先加载细胞-matrigel混合液至注射器转换头，再插入注射器，最后将芯片端插入油相）等关键操作参数。这些使用方法充分利用了芯片结构的被动式分割特性和细胞保护机制，使液滴尺寸主要由流道几何参数决定，而非依赖于精确的流量控制，从而实现了高均一性的微球生成。

56、第三，通过计算流体力学（cfd）模拟和细胞活性检测，揭示了多层凸起组结构的细胞保护机制，包括逐级减压效应（流体对细胞的剪切应力从第一层的15 pa逐渐增加到第三层的25 pa，远低于传统微流控芯片中常见的50-100 pa剪切应力）。这些机制的发现解释了为什么本发明的芯片结构能够实现高细胞存活率。

57、第四，创新性地开发了梯度固化技术，通过三阶段温度控制策略（阶段1：35°c预固化5分钟；阶段2：37°c完全固化15-20分钟；阶段3：39°c后固化5分钟），解决了快速固化可能导致微球内外固化不均匀的技术难题，避免了影响细胞分布和类器官形态的问题。这种梯度固化策略基于本发明人发现的matrigel相变动力学在微球尺度下的特殊特性，为不同尺寸微球的固化参数优化提供了理论依据。

58、本发明的有益效果包括：

59、(1）科学发现价值：首次揭示了基质胶在微流控环境中的特殊流变学特性，包括微尺度下的剪切稀化效应、温度依赖性的相变动力学以及细胞-基质胶相互作用的微观机制，填补了微流控生物材料领域的研究空白。

60、（2）装置结构优化：通过开发针对手持微液滴芯片多层凸起组结构的特定使用方法，充分利用了芯片结构的被动式分割特性和细胞保护机制。生成的液滴尺寸变异系数(cv值)<5%，远优于传统手动滴加法的10%以上，细胞存活率可达90%以上。

61、（3）成本效益显著：采用手持无泵设计，彻底摒弃了传统微流控系统所需的精密泵阀设备，使装置成本降低约90%，单次实验成本降低80%以上。

62、（4）操作简便高效：将传统类器官培养方法的12个步骤简化为5个核心步骤，总操作时间从传统的2-3小时缩短至20分钟以内。

63、（5）微球均一性优异：通过优化推注速度控制方法及基质胶与细胞的比例，实现了微球尺寸的高度均一，变异系数(cv值)小于5%。

64、（6）类器官形成效率高：通过优化的装置使用方法和流体控制策略，实现了细胞微球球形度>0.95，类器官形成率提高至80%以上。

65、（7）便携性强：整套装置可集成于便携式手提箱中，总重量小于500克，适合在床边诊断、野外生物监测、分布式实验室等多种场景下使用。

66、（8）通量高：单次操作可生成大于5000个类器官微球，通量显著高于传统方法，特别适合大规模药物筛选应用。