一种与青花菜根肿病抗性相关的高通量筛选G/T和T/T分子标记及其应用

本技术属于作物分子标记辅助育种，涉及一种与青花菜根肿病抗性相关的高通量筛选g/t和t/t分子标记及其应用。

背景技术：

1、根肿病（clubroot）是由根肿菌（

plasmodiophora brassicae）引起的一种严重土传病害，根部异常膨大、养分和水分吸收受阻，从而造成植株早衰和减产，其广泛危害甘蓝型油菜、青花菜、白菜等芸薹属作物。该病害在土壤中传播迅速，且病原物休眠孢子在土壤中可存活超过10年，防治难度极大。传统的根肿病防治措施主要包括物理防治（如轮作、调节土壤酸碱度）、化学防治（施用化学药剂）以及生物防治（利用拮抗微生物或生物制剂抑制病原菌生长）等，但整体防效有限，且物理和化学措施成本较高、生物防治在田间推广稳定性不足。

2、分子标记辅助选择（marker-assisted selection, mas）是当前根肿病抗性育种的重要技术途径，通过开发与抗性位点紧密连锁的分子标记，可以在育种早期快速鉴定抗性基因型，缩短育种周期并提高筛选效率。其中，pbba8.1是最初在欧洲芜菁材料ecd04中鉴定的根肿病抗性位点，定位于白菜a08染色体的crr1区域，并已被导入甘蓝型油菜材料，已有研究表明，该位点对中国普遍流行的4号根肿生理小种表现出显著抗性效应。因此，将携带该位点的抗性导入青花菜并开发适用于青花菜遗传背景的检测标记，可为青花菜抗根肿病育种提供技术支持。

3、目前用于鉴定根肿病抗性位点的分子标记类型包括简单重复序列（simplesequence repeat，ssr）、酶切扩增多态性序列（cleaved amplified polymorphicsequence，caps）、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，snp）等。如cn110734999a公开大白菜抗根肿病新基因crw紧密连锁的snp分子标记，提供了双侧分子标记（bvrc-a03033590标记和bvrc-a03035160标记），两个标记可以联合或者单独使用，用于大白菜抗根肿病分子标记辅助育种。而对于青花菜根肿病抗性相关的分子标记却鲜有报道，已公开的连锁标记sau_um353a 和 cnu_m090a虽然基于pbba8.1位点开发，但因引物设计源自油菜基因组，在青花菜背景下受基因组差异影响，容易对结果判读产生干扰。

4、综上所述，开发适用于青花菜遗传背景的根肿病抗性相关的分子标记及相应检测方法，对于青花菜抗根肿病分子标记辅助育种具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本技术提供一种与青花菜根肿病抗性相关的高通量筛选g/t和t/t分子标记及其应用，以期为青花菜抗根肿病育种的分子标记筛选和聚合育种奠定基础。

2、为达上述目的，本技术采用以下技术方案：

3、第一方面，本技术提供了一种与青花菜根肿病抗性相关的分子标记，所述分子标记包括青花菜基因组中snp位点，所述snp位点为seq id no.1所示核酸序列中第101位核苷酸。

4、本技术基于对与pbba8.1连锁的分子标记sau_um353a附近区域的抗性材料与感病材料的基因组序列比对，筛选出与青花菜根肿病抗性相关的snp标记。所述标记在本技术供试材料中能够稳定区分g/t型和t/t型，可用于检测与pbba8.1抗性相关的g等位变异，并用于青花菜群体分型和分子标记辅助选择，具有较高的检测准确性，适用于种质资源调查、杂交种纯度鉴定和群体分型。

5、seq id no.1：

6、ctcatgtctctcagcttctctctcttcttcttctctctctactggtttctccaccgccaccgccgtcgcgaatcctcagatgggttgttgtctcccagattcgtgaagagccttccccagttcaagttctacgagccgacggtgtacggaagcgagtgcgtggtctgcatcgaagggttcagacaaggacagtggtgtcgg。

7、第二方面，本技术提供第一方面所述的与青花菜根肿病抗性相关的分子标记和/或其检测物质在鉴定青花菜中与pbba8.1抗性相关的等位变异和/或辅助选育抗根肿病青花菜中的应用。

8、可选地，所述检测物质包括检测所述与青花菜根肿病抗性相关的分子标记的基因型的试剂和/或设备。

9、可以理解，基于本技术筛选的分子标记，本领域能够检测所述分子标记基因型的试剂和/或设备均适用于本技术，如pcr相关试剂和/或设备，测序相关试剂和/或设备等。

10、第三方面，本技术提供一种鉴定青花菜中与pbba8.1抗性相关的等位变异和/或辅助选育抗根肿病青花菜的产品，所述产品包括第一方面所述与青花菜根肿病抗性相关的分子标记的基因型的检测物质。

11、可选地，所述检测物质包括pcr扩增试剂。

12、可选地，所述pcr扩增试剂包括kasp-pcr扩增试剂。

13、可选地，所述kasp-pcr扩增试剂包括引物和反应试剂。

14、可选地，所述引物包括两条等位基因特异性正向引物和一条公共反向引物，核酸序列分别如seq id no.2~seq id no.4所示。

15、可选地，所述反应试剂包括kasp反应预混液。

16、可选地，所述kasp反应预混液包括缓冲液、dna聚合酶、dntp、mg2+以及与所述正向引物5’端尾序列相匹配的荧光报告体系。

17、本技术进一步设计分析标记的kasp-pcr引物，能够实现快速、准确地检测目标基因型，从而显著提高根肿病抗性材料的筛选效率，与测序等方法相比，在实验耗材和人工成本上具有明显优势，适合在大规模育种项目中推广。

18、第四方面，本技术提供一种鉴定青花菜中与pbba8.1抗性相关的等位变异和/或辅助选育抗根肿病青花菜的方法，所述方法包括：

19、检测青花菜中第一方面所述与青花菜根肿病抗性相关的分子标记的基因型，并根据基因型结果判断所述青花菜是否携带与pbba8.1抗性相关的g等位变异。

20、可选地，当所述snp位点的基因型为g/t型，判定为携带所述g等位变异；当所述snp位点的基因型为t/t型时，判定为未携带所述g等位变异。

21、可选地，所述检测包括使用第三方面所述的用于鉴定青花菜中与pbba8.1抗性相关的等位变异和/或辅助选育抗根肿病青花菜的产品进行检测。

22、与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果：

23、本技术基于对与pbba8.1紧密连锁的分子标记sau_um353a附近区域的抗性材料与感病材料的基因组序列比对，筛选出与青花菜根肿病抗性相关的分子标记，并在青花菜中进行了大批量验证。结果表明，该标记可区分本技术供试样本中的g/t型和t/t型，且与参照标记cnu_m090a的检测结果基本一致。并保证分子标记在青花菜不同遗传背景下的准确性和可重复性，并进一步设计kasp-pcr方法，可进行高效、低成本检测，为青花菜根肿病抗性品种的分子标记辅助育种提供技术手段。