一种高通量的纳米凝胶及其制备方法和应用

本发明属于纳米材料制备领域，涉及一种高通量的纳米凝胶及其制备方法和应用，具体涉及一种通过低温固化破碎法制备纳米凝胶的方法及其在药物递送、诊断成像等领域中的应用。

背景技术：

1、纳米凝胶作为一种多功能平台，基于其独特性质如对环境刺激的响应性及包裹多种分子的能力，其已被广泛应用于先进药物递送、诊断成像、催化以及燃料运输系统等多个领域。然而，纳米凝胶的生产面临诸多挑战(包括规模化、集成兼容性以及合成过程中的材料稳定性问题)。

2、典型的纳米凝胶合成方法主要是自下而上的化学交联或自组装，例如利用乳液聚合、纳米沉淀、模板法或微流控等技术制备具有特定尺寸、形状和组成的纳米凝胶。然而，纳米尺度下受限的反应环境使聚合过程对反应和扩散动力学更为敏感，而严格的合成条件在放大生产时存在巨大挑战，并会影响最终产品效能。因此，大规模生产中，现有自下而上的合成方法往往在控制纳米凝胶特性(如尺寸、网络结构等)方面存在困难。此外，目前广泛使用的表面活性剂、稳定剂等还会引入安全风险，并可能损害纳米凝胶的内在力学性能或网络结构。

3、自上而下的将大块凝胶分割成纳米凝胶同时保持其内部结构的新方法是实现大规模制备纳米凝胶的理想途径。然而，传统机械方法破碎凝胶过程中存在网络结构破坏、微米级尺寸极限和加工生热破坏材料或负载物等问题。因此，迫切需要开发一种制造具有可调尺寸和可控内部结构的高性能纳米凝胶的方法。

技术实现思路

1、为改善上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

2、一种纳米凝胶的制备方法，所述方法包括如下步骤：将块状凝胶置于低温环境冷冻固化；在助剂存在下，进行低温破碎，得到所述纳米凝胶。

3、根据本发明的实施方案，所述纳米凝胶的制备方法，具体包括如下步骤：

4、(1)制备块状凝胶；

5、(2)冷冻固化：将块状凝胶置于低温环境，随温度降低固化成冷冻凝胶；

6、(3)低温破碎：向冷冻凝胶中加入助剂，保持低温研磨至冷冻凝胶破碎为纳米凝胶。

7、根据本发明的实施方案，所述助剂为研磨助剂；示例性地，所述助剂选自可溶性颗粒和/或不可溶颗粒。

8、在一些实施方案中，所述可溶性颗粒可为氯化钠颗粒、葡萄糖颗粒、pbs颗粒、冰颗粒和含盐冰颗粒等中的一种。

9、在一些实施方案中，所述不可溶颗粒可为聚苯乙烯、聚乙二醇、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯和氧化锆颗粒等中的一种。

10、根据本发明的实施方案，步骤(3)中，所述研磨在冷冻研磨容器中进行。

11、根据本发明的实施方案，所述助剂和冷冻凝胶的体积比(单位毫升或升，即毫升:毫升或升:升)为100:1～1:10，例如为100:1、50:1、20:1、10:1、1:1、1:2、1:5或1:10。

12、本发明的制备方法是一种自上而下的冷冻固化破碎法，能够实现大规模生产，且不需要使用表面活性剂等，具有广泛适用性。

13、根据本发明的实施方案，所述凝胶为聚合物凝胶或生物功能凝胶(如噬菌体凝胶)。

14、在一些实施方案中，所述聚合物凝胶的制备原料包括聚合物和液体。

15、在一些实施方案中，所述生物功能凝胶的制备原料包括生物功能分子(如噬菌体)和液体。

16、在一些实施方案中，所述聚合物可为天然聚合物和/或化学合成聚合物。

17、示例性地，所述聚合物包括透明质酸、普鲁兰、壳聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酰胺和聚丙烯酸等中的至少一种。

18、在一些实施方案中，所述液体为水和有机溶剂中的至少一种。

19、在一些实施方案中，所述液体为混合溶剂。例如，可为多种有机溶剂混合或水和有机溶剂混合。

20、示例性地，所述有机溶剂可为乙醇、甲醇、丙酮、二甲基亚砜和石蜡等的至少一种。

21、根据本发明的实施方案，所述块状凝胶是由聚合物或生物功能分子(如噬菌体)与液体混合，在引发剂或交联剂作用下，交联后得到。

22、在一些实施方案中，所述液体与聚合物(如噬菌体)的体积质量比为1ml:(10-200)mg，示例性为1ml:50mg。

23、在一些实施方案中，所述引发剂例如为过氧化氢、氧气、过硫酸铵和氯酸等中的至少一种。优选地，所述引发剂的用量为聚合物用量的1/10～1/3，示例性为1/10、1/8、1/5、1/4或1/3。

24、在一些实施方案中，所述交联剂例如为戊二醛。优选地，所述交联剂的用量为聚合物用量的1/100～1/2，示例性为1/100、1/10、1/8、1/5、1/4或1/2。

25、在一些实施方案中，所述交联的温度为室温；所述交联的时间至少为1min，优选为1min～7d，例如1～60min或1h～24h，示例性为1min、2min、5min、10min、15min、20min、30min、40min、50min、60min、1h、2h、5h、8h、10h、12h、24h或7d。

26、根据本发明的实施方案，所述低温环境为-20～-270℃，例如为-20℃、-50℃、-80℃、-110℃、-140℃、-170℃、-196℃、-200℃、-210℃、-230℃、-250℃或-270℃。

27、根据本发明的实施方案，所述置于低温环境冷冻的时间至少为10s，优选为10s～7d，示例性为10s、30s、1min、10min、30min、1h、2h、5h或10h。

28、根据本发明的实施方案，所述固化是指凝胶从常温下柔软粘弹的状态，转变到完全冷冻之后脆硬的状态。

29、根据本发明示例性的方案，所述冷冻固化具体包括，将气体或液体环境降至一定温度之后，把块状凝胶放入其中，充分接触传热，使凝胶尽快降到指定温度，实现固化状态。

30、根据本发明的实施方案，所述低温破碎的温度为-20～-270℃，例如为-20℃、-50℃、-80℃、-110℃、-140℃、-170℃、-196℃、-200℃、-210℃、-230℃、-250℃或-270℃。

31、根据本发明的实施方案，所述破碎的方式可以为研磨。例如，所述破碎(例如研磨)的时间为30min～90min，例如为30min、42min、54min、66min、78min、84min或90min。

32、在一些实施方案中，所述研磨频率为10～20hz，例如为14hz。

33、根据本发明的实施方案，所述破碎采用的研磨容器为耐受低温容器，在一些实施方案中，为塑料或铁质研磨罐，容量为5ml～2000ml。

34、本发明还提供由上述制备方法制备得到的纳米凝胶。

35、根据本发明的实施方案，所述纳米凝胶的形状近似球形。

36、在一些实施方案中，所述纳米凝胶的粒径均在100nm以下。

37、本发明还提供上述纳米凝胶作为载体在药物递送、杀菌抑菌、荧光成像、催化以及燃料运输系统等中的应用。

38、根据本发明的实施方案，可以负载在所述纳米凝胶上的物质包括药物、成像分子(如荧光分子)、纳米颗粒(如贵金属纳米颗粒)、杀菌抑菌剂、催化剂和燃料等中的至少一种。

39、在一些实施方案中，所述药物例如为核酸药物(如sirna)和小分子药物(如紫杉醇)等中的至少一种。

40、在一些实施方案中，所述荧光分子为染料分子，例如cy5染料分子。

41、本发明中，所述药物递送应用包括载药纳米凝胶的制备与载药纳米凝胶抑制肿瘤细胞。

42、本发明还提供一种复合物，其包括作为载体的上述纳米凝胶以及负载在所述纳米凝胶上的物质。优选地，所述物质被限制在纳米凝胶内。

43、根据本发明的实施方案，负载在所述纳米凝胶上的物质包括药物、成像分子(如荧光分子)、纳米颗粒(如贵金属纳米颗粒)、杀菌抑菌剂、催化剂和燃料等中的至少一种。

44、在一些实施方案中，所述药物例如为核酸药物(如sirna)和小分子药物(如紫杉醇)等中的至少一种。

45、在一些实施方案中，所述荧光分子为染料分子，例如cy5染料分子。

46、具体的，所述复合物为载药纳米凝胶，其包括上述纳米凝胶及药物。优选地，所述药物被限制在纳米凝胶内。

47、根据本发明的实施方案，所述载药纳米凝胶的粒径为30nm～1000nm，例如为30nm、50nm、100nm、200nm、500nm或1000nm。

48、根据本发明的实施方案，所述药物为核酸药物(如sirna)和小分子药物(如紫杉醇)等中的至少一种。

49、根据本发明的实施方案，所述载药纳米凝胶中，药物的含量为0wt％～60wt％，例如为0.1wt％、1wt％、2wt％、5wt％、8wt％、10wt％、20wt％、30wt％、40wt％、50wt％或60wt％。

50、在一些实施方案中，所述荧光分子为染料分子，例如cy5染料分子。

51、本发明还提供上述复合物的制备方法，所述制备方法包括：

52、(a)将预负载在纳米凝胶上的物质接枝到聚合物或生物功能分子(如噬菌体)上、然后与液体混合，或者，聚合物或生物功能分子(如噬菌体)与液体混合得到溶液，将负载在纳米凝胶上的物质共溶于该溶液中；在引发剂或交联剂作用下，交联后得到负载后的块状凝胶；

53、(b)将负载后的块状凝胶置于低温环境冷冻固化后，与助剂共同冷冻破碎后得到所述复合物。

54、具体的，本发明提供上述载药纳米凝胶的制备方法，所述制备方法包括：

55、(a)将药物接枝到聚合物或生物功能分子(如噬菌体)上、然后与液体混合，或者，聚合物或生物功能分子(如噬菌体)上与液体混合得到聚合物或生物功能分子(如噬菌体)溶液，将药物共溶于聚合物或生物功能分子(如噬菌体)溶液中；在引发剂或交联剂作用下，交联后得到载药块状凝胶；

56、(b)将载药块状凝胶置于低温环境冷冻固化后，与助剂共同冷冻破碎后得到所述载药纳米凝胶。

57、还具体的，所述步骤(b)具体包括：

58、(b’)冷冻固化：将负载后的块状凝胶或载药块状凝胶置于低温环境，随温度降低固化成冷冻凝胶；

59、(b”)冷冻破碎：把冷冻凝胶放入冷冻研磨容器，加入助剂，保持低温研磨至冷冻凝胶破碎为载药纳米凝胶。

60、具体的，所述负载后的块状凝胶或载药纳米凝胶呈粉末状。

61、根据本发明的实施方案，所述制备方法还包括：将粉末状的载药纳米凝胶室温融化之后得到载药纳米凝胶溶液。

62、根据本发明的实施方案，所述预负载在纳米凝胶上的物质的用量为凝胶用量的0wt％～60wt％，例如为0.1wt％、1wt％、2wt％、5wt％、8wt％、10wt％、20wt％、30wt％、40wt％、50wt％或60wt％。

63、根据本发明的实施方案，步骤(a)中，所述交联的温度为室温；所述交联的时间至少为1min，优选为1min～7d，例如1～60min或1h～24h，示例性为1min、2min、5min、10min、15min、20min、30min、40min、50min、60min、1h、2h、5h、8h、10h、12h、24h或7d。

64、根据本发明的实施方案，步骤(b)中，所述低温环境为-20～-270℃，例如为-20℃、-50℃、-80℃、-110℃、-140℃、-170℃、-196℃、-200℃、-210℃、-230℃、-250℃或-270℃；所述置于低温环境冷冻的时间至少为10s，优选为10s～7d，示例性为10s、30s、1min、10min、30min、1h、2h、5h、24h或7d。

65、根据本发明的实施方案，所述冷冻破碎的温度为-20～-270℃，例如为-20℃、-50℃、-80℃、-110℃、-140℃、-170℃、-196℃、-200℃、-210℃、-230℃、-250℃或-270℃；所述破碎的时间为30min～90min，例如为30min、42min、54min、66min、78min或90min。

66、根据本发明的实施方案，所述聚合物、助剂具有与上文所述的定义和选择。

67、根据本发明的实施方案，所述聚合物溶液中采用的溶剂具有与上文所述的液体相同的定义和选择。

68、根据本发明的实施方案，所述破碎的方式可以为研磨。

69、本发明还提供一种提高物质负载量的方法，其包括采用上述复合物的制备方法制备复合物的步骤。

70、本发明还提供一种物质递送的方法，包括将上述复合物与目标物接触。

71、根据本发明的实施方案，所述目标物可以为细胞。例如hela细胞。

72、在一些实施方案中，所述药物递送的方法包括：将细胞(例如hela细胞)孵育后，加入含有上述载药纳米凝胶的培养基培养。

73、根据本发明的实施方案，所述培养基中，所述载药纳米凝胶的浓度为0.1mg/ml～10mg/ml。

74、根据本发明的实施方案，所述培养的时间为24h～72h。

75、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

76、(1)大规模生产：本发明通过低温冷冻固化破碎法使大块凝胶从柔软状态转变为硬脆态，同时保持其内部结构，实现了自上而下不同尺寸纳米凝胶材料的定向制备，以满足不同需求纳米凝胶的可控制备。从而极大地改善了纳米凝胶的分类、稳定性和大规模生产，为各科学和工业领域的研究和应用开辟了新途径。本发明的制备方法简单易行，适合从实验室规模扩展到工业生产，并确保纳米凝胶产品的一致性和可靠性。

77、(2)无需表面活性剂：本发明的制备方法消除了传统方法中使用的表面活性剂带来的安全风险。

78、(3)广泛适用性：本发明的制备方法可制备多种类型的纳米凝胶，并可实现多种物质负载，以满足不同应用场景的需求。具体的，本发明的纳米凝胶可以作为载体在药物递送、杀菌抑菌、荧光成像、催化以及燃料运输系统等诸多领域中应用。

79、(4)高载药量：本发明的制备方法显著提高了疏水性药物的负载能力，并优于现有临床载药配方。