结合乙型肝炎病毒表面抗原的抗体及其应用的制作方法

本发明属于抗体，涉及一种结合乙型肝炎病毒表面抗原的抗体，以及该抗体在治疗与乙型肝炎病毒感染相关的疾病中的用途。

背景技术：

1、乙型肝炎病毒（hbv）感染呈世界性流行，但不同地区hbv 感染的流行强度差异很大。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染hbv，其中2.4亿人为慢性hbv感染者，每年约有65万人死于hbv感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌(hcc)。全球肝硬化和hcc 患者中，由hbv感染引起的比例分别为30%和45%。我国肝硬化和hcc患者中，由hbv感染引起的比例分别为60%和80%。我国是慢性乙型肝炎的人口大国，流调显示目前尚有超过7%的人为乙型肝炎病毒感染者，总人数接近1亿人。截至2015年底，只有9%的乙型肝炎病毒感染者得到了检测和诊断；在诊断为乙型肝炎病毒感染的患者中，仅有8%接受了治疗（中国肝炎防治基金会数据）。他们不仅需要长期甚至终身治疗，为家庭、社会带来巨大负担，而且还有发展成肝硬化、肝癌的危险。据测算，我国有2800万慢性乙型肝炎患者，每年新增近百万肝硬化病人和约30万肝癌病人。按照慢性肝炎患者5%的就诊率和肝硬化、肝癌患者95%的就诊率推算，我国每年用于治疗乙型肝炎相关的直接医疗费用达到800亿元-1200亿元。

2、乙型肝炎患者经抗病毒治疗后，虽可降低体内病毒载量，延缓严重疾病进程，但很多人不能完全清除乙型肝炎病毒。乙型肝炎患者需要长期服药，患者经济负担严重。根据中国疾控动态公布的数据显示，慢性肝炎患者的年平均诊疗费用占家庭年均总收入的56.24%，代偿性肝硬化占81.53%，失代偿性肝硬化占157.21%，肝癌占96.76%。沉重的经济负担造成很多患者或者放弃治疗或者导致家庭因病返贫。此外，从近十余年肝病的诊疗费用演变过程看，肝病的诊疗费用呈现逐年递增势态，每年增幅10%～20%左右，个人承担部分也随之增加。

3、研究显示乙型肝炎患者血液中大量存在的由hbsag组成的亚病毒颗粒是抑制免疫系统使感染肝细胞无法清除的主要原因。依靠某种技术降低血液中hbsag水平10-100倍，可激活人体自身的t细胞免疫，使得机体自身免疫系统可开始有效杀伤被感染肝细胞。因此有效降低血液中的hbsag水平不但是乙型肝炎重要的治愈标准之一，更是治疗乙型肝炎清除被感染细胞的前提。

4、最新的临床研究结果显示,经过核苷酸类似物治疗清除病毒dna的患者，如果hbsag低于某个水平（如hbsag <1500 iu/ml），其干扰素清除hbsag的几率可超过50%，远大于我们通常认为的干扰素治愈率只有5-10%的比例。

5、但由于目前缺少有效降低hbsag的药物，绝大部分患者（超过90%）hbsag水平均超过这个指标，导致干扰素无法治愈这些病人（这就是干扰素治愈率只有5-10%的原因）。这些新的临床证据对降低hbsag的治疗方法有了更现实更迫切的需要。

6、目前研究发现降低乙型肝炎病毒表面抗原主要有3种途径：抑制hbsag的表达（sirna）、阻止hbsag从细胞释放（naps）、hbsag抗体。

7、确定了用抗体技术降低hbsag水平的研究方向，经过筛选我们已经获得了多株抗体，体外研究表明本发明抗体可特异性结合hbsag，动物模型研究结果显示可有效降低hbsag水平。

技术实现思路

0、发明概述

1、本技术的目的之一在于提供与乙型肝炎病毒表面抗原（hbsag）特异性结合的抗体或其抗原结合片段。体外抗原亲和力体外试验证明了本技术的抗体具有特异性结合hbsag的能力。而体内试验进一步证明了本技术的抗体可以作为乙型肝炎病毒（hbv）的中和抗体，有效降低hbsag水平，抑制hbv增殖。

2、具体地，本技术涉及：

3、1、一种特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原（hbsag）的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区（vh）序列和轻链可变区（vl）序列，其中：

4、所述重链可变区包含如下所示的互补决定区(cdr)氨基酸序列：

5、hcdr1: x1yx3fx5x6x7y（seq id no：33），

6、hcdr2： x11nx13x14x15x16x17x18（seq id no：34），

7、hcdr3：ardx21wx23x24x25x26dx28ygmdx33（seq id no：35）；

8、所述轻链可变区包含如下所示的cdr氨基酸序列：

9、lcdr1: x34x35x36sx38x39（seq id no：36），

10、lcdr2：x40x41x42（seq id no：37），

11、lcdr3：qqsystplx51（seq id no：38）；

12、其中，x1、x3、x5、x6、x7、x11、x13、x14、x15、x16、x17、x18、x21、x23、x24、x25、x26、x28、x33、x34、x35、x36、x38、x39、x40、x41、x42、x51各选自任一种氨基酸。

13、2、项1的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，其中：

14、x1选自g或a，x3选自t、a或s，x5选自t、a或i，x6选自g、a、y或d，x7选自y或a，x11选自i或a，x13选自p或a，x14选自n、a或y，x15选自s、a或n，x16选自g或a，x17选自g或a，x18选自t或a，x21选自l、v或a，x23选自n、q或a，x24选自d、q或a，x25选自d、g或a，x26选自v、g或a，x28选自y或a，x33选自v或a，x34选自q或a，x35选自s或a，x36选自i、a或v，x38选自t、a或s，x39选自y或a，x40选自a、g、d、t或s，x41选自a或s，x42选自a或s，x51选自t或a。

15、3、项2的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，其中：

16、hcdr1中x1、x3、x5、x6和x7依次选自下述的任一种组合：

17、g、t、t、g、y；a、t、t、g、y；g、a、t、g、y；g、t、a、g、y；g、t、t、a、y；g、t、t、g、a；g、s、i、g、y；g、t、t、d、y；g、t、t、y、y；

18、hcdr2中x11、x13、x14、x15、x16、x17、x18依次选自下述的任一种组合：i、p、n、s、g、g、t；a、p、n、s、g、g、t；i、a、n、s、g、g、t；i、p、a、s、g、g、t；i、p、n、a、g、g、t；i、p、n、s、a、g、t；i、p、n、s、g、a、t；i、p、n、s、g、g、a；i、p、y、n、g、g、t；

19、hcdr3中x21、x23、x24、x25、x26、x28、x33依次选自下述的任一种组合：l、n、d、d、v、y、v；a、n、d、d、v、y、v；l、a、d、d、v、y、v；l、n、a、d、v、y、v；l、n、d、a、v、y、v；l、n、d、d、a、y、v；l、n、d、d、v、a、v；l、n、d、d、v、y、a；v、q、q、g、g、y、v；

20、lcdr1中x34、x35、x36、x38、x39依次选自下述的任一种组合：

21、q、s、i、t、y；a、s、i、t、y；q、a、i、t、y；q、s、a、t、y；q、s、i、a、y；q、s、i、t、a；q、s、i、s、y；q、s、v、s、y；

22、lcdr2中x40、x41、x42依次选自下述的任一种组合：

23、a、a、s；s、a、s；a、s、s；a、a、a；g、a、s；d、a、s；t、a、s；且，

24、lcdr3中的x51选自：t或a。

25、4、项3的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，其中x1、x3、x5、x6、x7、x11、x13、x14、x15、x16、x17、x18、x21、x23、x24、x25、x26、x28、x33依次选自下表1中的任一种组合。

26、表1：

27、

28、5、项3或4的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，其中x34、x35、x36、x38、x39、x40、x41、x42、x51依次选自下表2中的任一种组合：

29、表2：

30、

31、6、项3的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，其中x1、x3、x5、x6、x7、x11、x13、x14、x15、x16、x17、x18、x21、x23、x24、x25、x26、x28、x33、x34、x35、x36、x38、x39、x40、x41、x42、x51依次选自下表3中的任一种组合：

32、表3：

33、

34、

35、

36、

37、在一些实施方案中，在所述特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段中，所述vh包含如下所示的互补决定区(cdr)氨基酸序列：如seq id no：17所示的hcdr1，如seq idno：21所示的hcdr2，如seq id no：23所示的hcdr3，且所述vl包含如seq id no：25所示的lcdr1；如seq id no：28所示的lcdr2，如seq id no：32所示的lcdr3；或

38、所述vh包含如下所示的互补决定区(cdr)氨基酸序列：如seq id no：17所示的hcdr1，如seq id no：21所示的hcdr2，如seq id no：23所示的hcdr3，且所述vl包含如seqid no：26所示的lcdr1；如seq id no：28所示的lcdr2，如seq id no：32所示的lcdr3；或

39、所述vh包含如下所示的互补决定区(cdr)氨基酸序列：如seq id no：20所示的hcdr1，如seq id no：21所示的hcdr2，如seq id no：24所示的hcdr3，且所述vl包含如seqid no：25所示的lcdr1；如seq id no：28所示的lcdr2，如seq id no：32所示的lcdr3；或

40、所述vh包含如下所示的互补决定区(cdr)氨基酸序列：如seq id no：18所示的hcdr1，如seq id no：22所示的hcdr2，如seq id no：23所示的hcdr3，且所述vl包含如seqid no：26所示的lcdr1；如seq id no：28所示的lcdr2，如seq id no：32所示的lcdr3；或

41、所述vh包含如下所示的互补决定区(cdr)氨基酸序列：如seq id no：19所示的hcdr1，如seq id no：21所示的hcdr2，如seq id no：23所示的hcdr3，且所述vl包含如seqid no：27所示的lcdr1；如seq id no：29所示的lcdr2，如seq id no：32所示的lcdr3；或

42、所述vh包含如下所示的互补决定区(cdr)氨基酸序列：如seq id no：19所示的hcdr1，如seq id no：21所示的hcdr2，如seq id no：23所示的hcdr3，且所述vl包含如seqid no：27所示的lcdr1；如seq id no：30所示的lcdr2，如seq id no：32所示的lcdr3；或

43、所述vh包含如下所示的互补决定区(cdr)氨基酸序列：如seq id no：19所示的hcdr1，如seq id no：21所示的hcdr2，如seq id no：23所示的hcdr3，且所述vl包含如seqid no：26所示的lcdr1；如seq id no：30所示的lcdr2，如seq id no：32所示的lcdr3；或

44、所述vh包含如下所示的互补决定区(cdr)氨基酸序列：如seq id no：17所示的hcdr1，如seq id no：21所示的hcdr2，如seq id no：23所示的hcdr3，且所述vl包含如seqid no：26所示的lcdr1；如seq id no：31所示的lcdr2，如seq id no：32所示的lcdr3。

45、7、项1-6中任一项的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，包含人类通用框架区（fr）。在一些实施方案中，所述vh包含人类亚组iii通用框架区（fr）。在一些实施方案中，所述vl包含人类亚组κi通用框架。在一些实施方案中，包含人类通用框架区（fr）和在人类通用框架区（fr）基础上的一个或多个氨基酸取代。

46、在一些实施方案中，所述框架区为人类通用框架区，并且包含一个或多个（例如1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3个）氨基酸取代。在一些实施方案中，所述框架区为人类通用框架区或与人类通用框架区具有70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%同一性。在本发明的一些示例性实施方案中，所述vh包含如下所示的fr氨基酸序列：

47、hfr1：z1z2z3lz4z5sgaevkkpgasz6kvsckas（seq id no：39）

48、hfr2：z7hwvrqapgqgz8ewmgw（seq id no：40）

49、hfr3：nyaqkfqgrvtz9tz10dz11sz12staymelsz13lrsz14dtavyyc（seq id no：41）

50、hfr4：wgz15gtz16vtvss（seq id no：42）

51、vl包含如下所示的fr氨基酸序列：

52、lfr1：z17z18z19ltqspz20z21lsz22sz23gz24rz25tz26z27cras（seq id no：43）

53、lfr2：lz28wyqqkpgz29apz30lliz31（seq id no：44）

54、lfr3：z32z33z34z35gz36pz37rfsgsgsgtz38ftltiz39slz40z41z42dz43atyyc（seqid no：45）

55、lfr4：fgz44gtz45z46z47ikr（seq id no：46）

56、其中，z1-z47各选自任一种氨基酸。

57、8、项7的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，其中，

58、z1选自q或e，z2选自v或i，z3选自q或t，z4选自v或k，z5选自e或q，z6选自v或m，z7选自m、i或l，z8选自l或p，z9为m或i，z10为r或a，z11为t或k，z12为i或t，z13为r或s，z14为d或e，z15选自k或q，z16选自l或m，z17选自d或e，z18选自i或t，z19选自q、t或v，z20选自s、a或g，z21选自s或t，z22选自a或l，z23选自v或p，z24选自d或e，z25选自v或a，z26选自i或l，z27选自t或s，z28选自n或a，z29选自k或q，z30选自k、q或r，z31选自y或s，z32选自s或n，z33选自l或r，z34选自q或a，z35选自s或t，z36选自v或i，z37选自s或a，z38选自d或e，z39为s或r，z40选自q或e，z41选自p或s，z42选自e或g，z43选自f或l，z44选自g、q或p，z45选自k或r，z46选自v或l，z47选自d或e。

59、9、项8的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，其中：

60、hfr1中z1、z2、z3、z4、z5、z6依次选自下述的任一种组合：q、v、q、v、e、v；e、v、q、v、q、v；e、v、q、v、e、v；q、i、t、k、e、v；e、v、q、v、q、m；

61、hfr2中z7、z8依次选自下述的任一种组合：m、l；l、l；i、p；

62、hfr3中z9、z10、z11、z12、z13、z14的组合为：m、r、t、i、r、d；或i，a，k，t，s，e

63、hfr4中z15、z16依次选自下述的任一组合：k、l；q、m；q、l；或k、m；

64、10、项8或9的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，其中：

65、lfr1中z17、z18、z19、z20、z21、z22、z23、z24、z25、z26、z27依次选自下述的任一种组合：d、i、q、s、s、a、v、d、v、i、t；e、i、v、g、t、l、p、e、a、l、s；e、i、v、a、t、l、p、e、a、l、s；e、t、t、s、t、a、v、d、v、i、t；

66、lfr2中z28、z29、z30、z31依次选自下述的任一种组合：n、k、k、y；a、q、r、y；n、k、k、s；n、k、q、y；

67、lfr3中z32、z33、z34、z35、z36、z37、z38、z39、z40、z41、z42、z43依次选自下述的任一种组合：s、l、q、s、v、s、d、s、q、p、e、f；s、r、a、t、i、a、e、s、q、s、e、f；n、r、a、t、i、a、d、s、e、p、e、f；s、l、q、s、v、s、e、r、q、p、e、f；s、l、q、s、v、s、d、s、q、p、g、l；

68、lfr4中z44、z45、z46、z47依次选自下述的任一种组合：g、k、v、d；g、k、l、e；p、k、v、e；g、k、v、e；q、r、l、e；

69、11、项10的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，其中z1-z16依次选自下表4的任一种组合：

70、表4

71、

72、12、项8-11中任一项的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，其中z17-z47依次选自下表5的任一种组合：

73、表5：

74、

75、13、项8的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，z1-z47依次选自下表6中的任一种组合：

76、表6：

77、

78、

79、14、项1的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，其中vh序列选自选自seqid no：1-6中的任一序列，或与seq id no：1-6中的任一序列具有至少80%、85%、90%、95%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。

80、15、项1或14的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，其中vl序列选自seqid no：7-13中的任一序列，或与seq id no：7-13中的任一序列具有至少80%、85%、90%、95%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。

81、16、项1-15任一项的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，其中vh序列与vl序列选自如下任一组：

82、seq id no：1与seq id no：7、seq id no：1与seq id no：8、seq id no：2与seq idno：8、seq id no：2与seq id no：12、seq id no：2与seq id no：13、seq id no：3与seq idno：8、seq id no：4与seq id no：8、seq id no：5与seq id no：9、seq id no：5与seq idno：10、seq id no：5与seq id no：11、seq id no：6与seq id no：7、与上述vh序列或vl序列具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。

83、17、项1-16中任一项的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，其选自：fab、f(ab')2、fab'、scfv、fv、fd、dab、双体抗体（diabody）、或多体抗体（multibody）。

84、18、项1-17中任一项的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为全人源抗体、人源化抗体、鼠源抗体、嵌合抗体或纳米抗体。

85、19、项1-18中任一项的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含重链恒定区和轻链恒定区，其中，所述重链恒定区选自igg的重链恒定区，所述轻链恒定区选自κ链或λ链。

86、20、项19的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，其中重链恒定区为人igg1的重链恒定区。在一些实施方案中，所述重链恒定区包含如seq id no：14中所示的氨基酸序列，或包含与seq id no：14具有70%或以上序列同一性的氨基酸序列（例如75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列）。

87、21、项19或20的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，其中轻链恒定区源自人κ链。在一些实施方案中，所述轻链恒定区包含如seq id no：15中所示的氨基酸序列，或包含与seq id no：15具有70%或以上序列同一性的氨基酸序列（例如75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列）。

88、22、项1-21中任一项的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，其为单特异性抗体、双特异性抗体、或多特异性抗体。

89、23、一种分离的核酸分子，其包含编码项1-22中任一项的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列。

90、24、一种构建体，其包含项中的核酸分子，所述构建体选自：质粒、噬菌粒、病毒载体、或线性核酸。

91、25、一种病毒、噬菌体或细胞，其表达项1-22中任一项的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段，或包含项23中的核酸或项24中的构建体。

92、26、一种药物组合物，其包含：项1-22中任一项的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段、项23中的核酸、项24中的构建体、或项25中的病毒、噬菌体或细胞。

93、27、一种试剂盒，其包含：项1-22中任一项的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段、项23中的核酸、项24中的构建体、或项25中的病毒、噬菌体或细胞。

94、28、一种治疗或预防乙型肝炎病毒（hbv）感染，或缓解乙型肝炎症状的方法，其包含向患者施用有效量的项26中的药物组合物。

95、29、一种检测hbv的方法，包括使项1-22中任一项的特异性结合hbsag的抗体或其抗原结合片段、项23中的核酸、项24中的构建体、或项25中的病毒、噬菌体与来自受试者的体液接触。

96、30. 项29的方法，其中所述体液为受试者的血浆或血清。