一种WSMV和MDMV的双重荧光PCR检测试剂和方法与流程

本发明属于分子生物学检测，具体涉及一种wsmv和mdmv的双重荧光pcr检测试剂和方法。

背景技术：

1、小麦线条花叶病毒（wsmv）和玉米矮花叶病毒（mdmv）均属于马铃薯y病毒科（potyviridae），是严重危害禾本科作物（特别是小麦、玉米及高粱等）的重要植物病毒。wsmv主要通过麦曲叶螨（aceria tosichella）传播，感染小麦后导致叶片条纹花叶、植株矮化和产量损失20%~80%。mdmv则通过蚜虫以非持久性方式传播，是玉米矮花叶病的主要病原之一，可造成玉米产量严重损失。

2、由于这两种病毒的寄主范围存在交叉，且在我国及全球多个主要农业产区中，小麦和玉米常常实行连作、套种或邻作，导致wsmv和mdmv在田间极易发生复合感染和协同危害。这种双重感染不仅会加重作物的发病症状，还会给田间诊断和病害防控带来极大的困难。因此，建立一种能够同时、快速、准确鉴别这两种病毒的同步检测方法，对于口岸出入境植物检疫、田间病毒病的早期预警以及抗病育种材料的筛查具有极其重要的现实意义。

3、目前针对wsmv和mdmv的分子检测方法主要包括常规rt-pcr和单重荧光定量rt-pcr，但这些方法均需对两种病毒分别进行独立检测，样品用量大、试剂消耗多、检测周期长、成本高。现有技术中尚缺乏针对wsmv和mdmv的双重荧光rt-pcr检测方案，而已有的多重pcr方法普遍面临引物对间的竞争抑制问题。当两种靶标病毒载量差异较大时（例如一种高丰度、另一种超低丰度），高丰度靶标的引物对在反应早期抢占聚合酶和dntps等资源，导致低丰度靶标的扩增被严重抑制甚至无法检出。传统添加剂如bsa、甜菜碱等虽可在一定程度上缓解单重pcr中的抑制物干扰，但对多重pcr中引物间的竞争性相互作用效果有限，且小麦和玉米组织中富含的多糖、酚类和腐殖酸等内源性抑制物对多重pcr各靶标的非均一干扰进一步加剧了扩增失衡。

4、本技术人研究团队开发了一种基于胆碱类深共熔溶剂（chcl-glycerol des）与咪唑类离子液体（[bmim][cl]）复配的增强型缓冲体系，有效解决了单重rt-pcr中小麦组织复合抑制物的干扰问题。然而，将该体系直接应用于wsmv和mdmv的双重荧光rt-pcr检测时发现，虽然体系对多糖-酚类-腐殖酸复合抑制物具有良好的清除能力，但两种病毒引物对之间的竞争抑制仍然存在，尤其是在mdmv为低丰度靶标时，其扩增效率显著受到wsmv高丰度扩增的抑制。

5、因此，开发一种能够同时解决“植物组织复合抑制物干扰”和“多重pcr引物对间竞争抑制”两大技术难题的wsmv和mdmv双重荧光rt-pcr检测试剂及方法，具有重要的现实意义和应用价值。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，在第一方面，本发明提供了一种wsmv和mdmv双重荧光rt-pcr检测试剂，其包含一步法荧光rt-pcr缓冲液，所述缓冲液包含三元复合添加剂体系，所述三元复合添加剂体系由第一添加剂、第二添加剂和第三添加剂组成；

2、所述第一添加剂为胆碱类深共熔溶剂；

3、所述第二添加剂为咪唑类离子液体；

4、所述第三添加剂为氨基酸类深共熔溶剂。

5、进一步地，所述胆碱类深共熔溶剂由氯化胆碱与甘油按摩尔比1:1~1:2通过氢键自组装形成。

6、进一步地，所述胆碱类深共熔溶剂在所述wsmv和mdmv双重荧光rt-pcr检测试剂中的体积分数为1.5%~3.5%（v/v）。

7、进一步地，所述咪唑类离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑氯盐（[bmim][cl]）。

8、进一步地，所述1-丁基-3-甲基咪唑氯盐在所述wsmv和mdmv双重荧光rt-pcr检测试剂中的体积分数为0.5%~1.5%（v/v）。

9、进一步地，所述氨基酸类深共熔溶剂为l-脯氨酸-甘油深共熔溶剂。

10、进一步地，所述l-脯氨酸-甘油深共熔溶剂由l-脯氨酸与甘油按摩尔比1:1~1:3通过氢键自组装形成。

11、进一步地，所述l-脯氨酸-甘油深共熔溶剂在所述wsmv和mdmv双重荧光rt-pcr检测试剂中的体积分数为0.8%~1.5%（v/v）。

12、进一步地，所述wsmv和mdmv双重荧光rt-pcr检测试剂还包含辅助添加剂，所述辅助添加剂选自牛血清白蛋白、甜菜碱和t4基因32蛋白。

13、进一步地，所述牛血清白蛋白在所述wsmv和mdmv双重荧光rt-pcr检测试剂中的浓度为0.05~0.3 mg/ml，所述甜菜碱在所述wsmv和mdmv双重荧光rt-pcr检测试剂中的浓度为0.2~0.8 m，所述t4基因32蛋白在所述wsmv和mdmv双重荧光rt-pcr检测试剂中的浓度为0.05~0.2 μg/μl。

14、进一步地，所述wsmv和mdmv双重荧光rt-pcr检测试剂还包含rt-pcr缓冲剂、mgcl2、dntps；

15、进一步地，所述wsmv和mdmv双重荧光rt-pcr检测试剂还包含50~100 mm tris-hcl（ph 8.3~8.8）、3~6 mm mgcl2、0.2~0.4 mm dntps。

16、在第二方面，本发明提供了一种wsmv和mdmv双重荧光rt-pcr检测试剂盒，其包含如本文所述的wsmv和mdmv双重荧光rt-pcr检测试剂、逆转录酶、dna聚合酶、rnase抑制剂、针对wsmv的特异性引物对和taqman探针以及针对mdmv的特异性引物对和taqman探针。

17、进一步地，所述针对wsmv的特异性引物对和taqman探针的核苷酸序列为：

18、正向引物 wsmv-f：5'-cgtgttgtgaataatgcaggca-3'（seq id no:1）；

19、反向引物 wsmv-r：5'-cgaagtgatggcttcgcagc-3'（seq id no:2）；

20、taqman探针 wsmv-p：5'-vic-caatgagcagcaact-mgb-3'（seq id no:3）；

21、所述针对wsmv的taqman探针的5'端标记有荧光报告基团vic，3'端标记有非荧光淬灭基团及与之相连的mgb修饰基团。

22、进一步地，所述针对mdmv的特异性引物对和taqman探针的核苷酸序列为：

23、正向引物 mdmv-f：5'-tgacggtcgaacgatgaaac-3'（seq id no:4）；

24、反向引物 mdmv-r：5'-cacttctttccatcatgtccattt-3'（seq id no:5）；

25、taqman探针 mdmv-p：5'- cy5-acgaatggaattcatc-mgb-3'（seq id no:6）；

26、所述针对mdmv的探针的5'端标记有荧光报告基团cy5，3'端标记有非荧光淬灭基团及与之相连的mgb修饰基团。

27、进一步地，所述试剂盒还包含植物内参引物对和探针、外源内控rna及其对应的引物对和探针。

28、进一步地，针对wsmv的探针、针对mdmv的探针、植物内参探针和外源内控rna探针各自在5'端标记有发射光谱互不重叠的荧光报告基团，和在3'端标记有非荧光淬灭基团及与之相连的mgb修饰基团。

29、进一步地，所述植物内参引物对和探针靶向植物18s rrna基因。

30、进一步地，所述植物内参探针的荧光报告基团标记为fam。

31、进一步地，所述外源内控rna为人工合成的rna片段。

32、进一步地，所述外源内控rna探针的荧光报告基团标记为rox。

33、在第三方面，本发明提供了一种使用如本文所述的wsmv和mdmv双重荧光rt-pcr检测试剂盒同时检测wsmv和mdmv的方法，其包括以下步骤：

34、（1）样品裂解处理：取待检植物组织，加入含1.0%~2.0%（v/v）胆碱类深共熔溶剂的裂解液，室温下进行物理研磨或敲击裂解，静置后获取含有总rna的植物组织粗提物液体；

35、（2）一步法双重荧光rt-pcr反应体系构建：在反应管中混合如本文所述的wsmv和mdmv双重荧光rt-pcr检测试剂、逆转录酶、dna聚合酶、rnase抑制剂、针对wsmv的特异性引物对和探针、针对mdmv的特异性引物对和探针、任选的植物内参引物对和探针、任选的外源内控rna及其对应的引物对和探针，以及步骤（1）获得的粗提物液体1~5 μl，以无核酸酶水补足至终体积10~25 μl；

36、（3）扩增与荧光信号采集：将步骤（2）构建的反应管置于荧光定量pcr仪中，依次进行以下反应：50°c~52°c逆转录8~12 min；95°c预变性1~3 min；进行40~45个循环的pcr扩增，每个循环包括95°c变性3~10 s和60°c~63°c退火与延伸20~30 s，并在每个循环的退火延伸阶段同步采集多通道的荧光信号；

37、（4）结果判定：依据wsmv探针荧光通道的ct值，判定样品为wsmv阳性或阴性，依据mdmv探针荧光通道的ct值，判定样品为mdmv阳性或阴性。

38、进一步地，所述步骤（4）的结果判定标准为：如果wsmv探针荧光通道出现典型对数扩增曲线且ct值≤35和/或mdmv探针荧光通道出现典型对数扩增曲线且ct值≤35，和当存在时，植物内参探针和外源内控rna探针所对应的荧光通道均显示正常扩增，则判定样品为wsmv和/或mdmv阳性。

39、进一步地，步骤（2）中所述wsmv和mdmv双重荧光rt-pcr检测试剂的添加量为反应体系终体积的一半。

40、在第四方面，本发明提供了如本文所述的wsmv和mdmv双重荧光rt-pcr检测试剂或wsmv和mdmv双重荧光rt-pcr检测试剂盒在wsmv和mdmv口岸出入境检疫、田间病毒病同步诊断及抗病育种材料同步筛查中的应用。

41、本发明的有益效果

42、本发明的wsmv和mdmv双重荧光rt-pcr检测试剂通过在先前开发的胆碱类des+咪唑类il二元体系基础上进一步引入氨基酸类深共熔溶剂（即l-脯氨酸-甘油des），构建胆碱类des+咪唑类il+氨基酸类des三元协同增强型缓冲体系。该三元体系不仅能有效清除小麦和玉米组织中的多糖、多酚和腐殖酸复合抑制物，还能显著缓解双重pcr中不同靶标引物对之间的竞争抑制，实现wsmv和mdmv在同一反应管中的高效、同步、高灵敏度检测。