一种TILs细胞的培养液及其培养方法与应用与流程

本发明涉及细胞培养，尤其涉及一种用于培养来源于癌积液中tils细胞的培养液及tils细胞的培养方法与应用。

背景技术：

1、腹腔癌、胸腔癌积液来源的肿瘤浸润淋巴细胞扩增培养，通过从胸腔癌积液中分离出具有靶向肿瘤细胞的特异性抗体的t细胞，采用纯细胞因子诱导激活，再通过细胞因子激活扩增获得高纯度高数量的特异性抗体的til细胞，达到研究或治疗的目的。

2、尽管传统治疗方法如手术、化疗和放疗在抗癌过程中发挥了重要的作用；但是，也同样面临着巨大的局限性。手术往往无法完全清除癌细胞；而化疗和放疗虽然能有效杀死癌细胞，同时也会对正常细胞造成严重的伤害，给患者带来极大的副作用。面对如此严峻的癌症形势，免疫细胞治疗，尤其是til细胞疗法，因其独特的对肿瘤细胞的特异性和杀伤能力，成为癌症治疗领域的新希望。

技术实现思路

1、基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种可以提升tils细胞快速扩增的培养液及其培养方法，且得到的tils细胞具有较好的杀瘤特异性。

2、本发明的技术方案之一如下：

3、一种针对来源癌积液中tils细胞的培养液，包括基础培养液，包括诱导培养液和扩增培养液；其中：

4、所述诱导培养液中包括基础培养液，在所述基础培养中添加并含有终浓度10~100ng/mlcd52、终浓度10~2000 iu/ml il-2、终浓度100~2000 ng/ml il-7、终浓度100~2000ng/ml il-15中的一种或多种；

5、所述扩增培养液包括基础培养液，在所述基础培养中添加并含有终浓度10~2000iu/ml il-2、终浓度50~2000ng/ml il-6、终浓度100~2000 ng/ml il-7、终浓度10~2000ng/ml il-10、终浓度100~2000 ng/ml il-15、终浓度50~500 ng/ml cd52及终浓度10~100ng/mlγ干扰素。

6、较好地，所述tils细胞培养液，其所述诱导培养液的基础培养液中，含有终浓度20~80 ng/mlcd52、终浓度100~1500 iu/ml il-2、终浓度200~1600 ng/ml il-7、终浓度200~1600 ng/ml il-15中的一种或多种；所述扩增培养液的基础培养中，含有终浓度100~1500iu/ml il-2、终浓度200~1500 ng/ml il-6、终浓度200~16000 ng/ml il-7、终浓度100~1500 ng/ml il-10、终浓度200~1600 ng/ml il-15、终浓度100~400 ng/ml cd52及终浓度20~80 ng/mlγ干扰素。

7、上述tils细胞培养液中，基础培养基为x-vivo、dmem/f12、imdm或rpmi-1640培养基中的任一种；优选地，在基础培养基中还含有终浓度1~10v/v% ab血清。

8、较好地，所述tils细胞培养液，在所述诱导培养液的基础培养中含有il-2，或者基础培养中含有il-2及il-7，或者基础培养中含有il-2及il-7及il-15。

9、本发明还提供一种tils细胞的培养方法，包括如下步骤：

10、第0天，将分选获得的t细胞加入上述诱导培养液中，并控制细胞密度为1.0~2.0×106个/ml，得到的细胞悬液移入t175培养瓶中，置于37℃、5%co2的培养箱中静置培养3天；

11、第3天，往t175培养瓶中补充添加上述诱导培养液，并控制细胞密度1.0~2.0×106个/ml；

12、第5至第7天，每隔两天补充添加上述扩增培养液，且每次补液后控制细胞密度1.0~2.0×106个/ml；

13、第9天，将t175培养瓶中的细胞及培养液转移至1l培养袋中，补充添加上述扩增培养液，并控制细胞密度2.0~3.0×106个/ml；

14、第11天至第27天，每隔两天补充添加上述扩增培养液，且每次补液后控制细胞密度2.0~3.0×106个/ml；

15、第28天，停止细胞培养，首先，收集培养袋中的细胞及培养液；接着，使用滤网过滤，去除残留；最后，收集滤液并离心，去上清，得到tils细胞沉淀。

16、上述tils细胞培养方法中，第0中的t细胞采用如下步骤分选得到：

17、获取癌症患者胸腔积液样本，并对样本进行离心处理，收集离心得到的细胞沉淀；

18、使用生理盐水重悬细胞沉淀，并往重悬后的细胞液中加入淋巴分离液，再次离心，收集离心管中的白色白膜层细胞，转入新离心管；

19、往新离心管中加入生理盐水，对新离心管离心，离心结束后往细胞沉淀中加入生理盐水洗涤，完后再次离心，得到细胞沉淀；

20、往新离心管中得到洗涤后的细胞沉淀中加入吸附cd3/cd28的磁珠，进行磁吸筛选，得到t细胞。

21、上述tils细胞培养方法中，对第28天离心得到的细胞沉淀还需如下处理：

22、第28天，对收集到的tils细胞沉淀加入细胞冻存液重悬，并控制悬液中的细胞密度1.0~2.0×107个/ml，得到的tils细胞悬液分装置冻存管中，冻存保存，备用

23、本发明制备的tils细胞，可以作为一种生物制剂，被应用于制备治疗胸腔肿瘤或癌症等药物组分，或作为药物添加剂并以赋形剂的形式被使用。

24、相对于现有技术，本发明具有如下优点：

25、1）、tils细胞培养液的诱导培养液中，cd52与il-2、il-7、il-15等激活扩增因子，采用激活因子组合方式配制使用，旨在深度诱导激活tils细胞，确保其在保持高度激活状态的同时，避免过度激活导致的tils细胞衰竭；

26、2）、tils细胞培养液的扩增培养液中，cd52辅助il-2、il-6、il-7、il-10、il-15、γ干扰素等激活扩增因子，使il-6、il-10和γ干扰素塑造炎症环境，更利于tils细胞的高效快速扩增，并增强tils细胞活性；

27、3）、tils细胞的培养方法，培养过程无需废弃培养旧液，直接补充添加新的培养液，如诱导培养液或扩增培养液等，操作流程简单。

1.一种tils细胞培养液，所述tils细胞来源于癌积液中，其特征在于，该培养液包括诱导培养液和扩增培养液；其中：

2.根据权利要求1所述的tils细胞培养液，其特征在于，所述诱导培养液的基础培养液中，含有终浓度100~1500 iu/ml il-2、终浓度200~1600 ng/ml il-7、终浓度200~1600 ng/ml il-15中的一种或多种；所述扩增培养液的基础培养中，含有终浓度100~1500 iu/mlil-2、终浓度200~1500 ng/ml il-6、终浓度200~16000 ng/ml il-7、终浓度100~1500 ng/ml il-10、终浓度200~1600 ng/ml il-15、终浓度100~400 ng/ml cd52及终浓度20~80 ng/mlγ干扰素。

3.根据权利要求1或2所述的tils细胞培养液，其特征在于，所述基础培养基为x-vivo、dmem/f12、imdm或rpmi-1640培养基中的任一种。

4.根据权利要求3所述的tils细胞培养液，其特征在于，在所述基础培养基中还含有终浓度1~10v/v% ab血清。

5.根据权利要求1或2所述的tils细胞培养液，其特征在于，在所述诱导培养液的基础培养中含有il-2；或者在所述诱导培养液的基础培养中含有il-2及il-7；或者在所述诱导培养液的基础培养中含有il-2及il-7及il-15。

6.一种癌积液来源的tils细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，第0中的t细胞采用如下步骤分选得到：

8.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，对第28天离心得到的细胞沉淀还需如下处理：

9.一种生物制剂，其特征在于，该生物制剂包含如权利要求7所述培养方法制得的tils细胞。

10.一种如权利要求7所述培养方法制得的tils细胞在制备治疗胸腔肿瘤或癌症药物中的应用。