一种犬过敏原蛋白嵌合肽cCanf1及其编码核酸和应用

本发明涉及分子生物学，尤其涉及一种犬过敏原蛋白嵌合肽ccan f 1及其编码核酸和应用。

背景技术：

1、过敏是免疫系统对外来物质产生的过度防御反应，其本质为异常的免疫应答。近年来，因宠物引起的过敏发生率在国内外均呈上升趋势，毛发动物已经成为尘螨和花粉之后的第三大类吸入性过敏原来源，对人日常生活造成不同程度影响，逐渐发展为一类全球性健康问题。毛发动物的过敏原已成为室内过敏原的主要来源，所诱发的症状可涵盖鼻痒、流泪和皮肤瘙痒等不适，严重时甚至诱发哮喘。根据世界卫生组织/国际免疫学会联合会（who/iuis）过敏原命名小组委员会数据库(http://www.alergen.org)的记录，目前已确认的犬过敏原共有8种，分别是can f 1-8。其中can f 1作为最主要的过敏原，在过敏患者中的特异性免疫球蛋白e（sige）检出率高达50-90%。研究表明，can f 1具有特殊的空气动力学特性，可附着于微小尘埃颗粒并在空气中长期悬浮，难以沉降，不利于环境清除。一般认为，室内屋尘中can f 1的致敏阈值和哮喘阈值分别为2 μg/g和10 μg/g。

2、can f 1在犬的唾液腺中合成，通过唾液和皮屑释放到环境中。其蛋白结构高度保守，由8条反平行β-折叠片层通过氢键连接形成稳定的β-桶状结构。该结构的核心腔体内富含疏水性氨基酸，使can f 1能够紧密结合多种疏水性小分子配体，如脂肪酸、固醇类和其他脂质分子，从而赋予蛋白较强的稳定性。can f 1在空气中传播时干扰较小，可长时间悬浮并被吸入呼吸道，进而诱发过敏反应。作为犬过敏原中最主要的致敏原蛋白，can f 1被视为开发过敏原特异性免疫疗法的理想靶点。传统基于大蛋白片段的疫苗常包含大量不必要的抗原成分，而基于重组抗原表位的短肽疫苗则能精准聚焦关键免疫原性区域，有利于诱导更具针对性的免疫应答，并减少不必要的免疫副作用。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的主要目的是提供一种犬过敏原蛋白嵌合肽ccan f 1及其编码核酸和应用。

2、为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种基于b细胞抗原表位犬过敏原蛋白嵌合肽ccan f 1，其包括犬过敏原can f 1抗原氨基酸残基的第4-21位氨基酸残基所示区段、第47-55位氨基酸残基所示区段、第70-81位氨基酸残基所示区段、第97-110位氨基酸残基所示区段和第130-138位氨基酸残基所示区段。

4、进一步地，上文所述嵌合肽ccan f 1中，所述各个区段之间通过柔性linker连接。

5、进一步地，上文所述嵌合肽ccan f 1为如下a1）-a4）中任一种：

6、a1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

7、a2）将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a1）衍生的蛋白质；

8、a3）序列中包含a1）或a2）所限定氨基酸序列的蛋白质；

9、a4）在a1）-a3）任一种所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。

10、上述嵌合肽ccan f 1大小约为17 kda，该重组嵌合肽ccan f 1具有完整can f 1蛋白的抗原性，可以用于免疫抗体的制备。

11、第二方面，本发明提供了第一方面所述嵌合肽ccan f 1的编码核酸。

12、进一步地，上文所述编码核酸为如下b1）-b4）中任一所述的dna分子：

13、b1）编码区包括序列表中序列2所示的核苷酸序列的dna分子；

14、b2）核苷酸序列为序列表中序列2的核苷酸序列的dna分子；

15、b3）在严格条件下与b1）或b2）中所述的核苷酸序列杂交，且编码第一方面所述嵌合肽ccan f 1的dna分子；

16、b4）与b1）或b2）的核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码第一方面所述嵌合肽ccan f 1的dna分子。

17、本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×ssc，0.1％sds，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

18、第三方面，本发明提供了含有第二方面所述编码核酸的重组载体或转基因细胞系或重组菌。

19、第四方面，本发明提供了第一方面所述嵌合肽ccan f 1在如下c1、c3或c4或c5中的应用：

20、或，本发明提供了第二方面所述编码核酸或第三方面所述的重组载体或转基因细胞系或重组菌在如下c1、c2、c3、c4或c5中的应用：

21、c1）作为免疫原或制备免疫调节剂；

22、c2）制备免疫原或制备免疫调节剂；

23、c3）制备can f 1的抗体；该抗体具有中和过敏原can f 1的功能；

24、c4）制备抗过敏疫苗；嵌合肽ccan f 1通过免疫机体产生抗体中和过敏原can f1，实现抗过敏；

25、c5）制备中和或降低can f 1含量的产品；嵌合肽ccan f 1通过免疫机体产生抗体中和过敏原can f 1，实现降低can f 1含量。

26、进一步地，上述机体为动物，具体为禽类或哺乳动物，进一步具体为蛋鸡或小鼠。

27、进一步地，上述抗过敏疫苗为抗犬毛发或犬唾液过敏疫苗。

28、第五方面，本发明提供了一种抗过敏疫苗，包括第一方面所述嵌合肽ccan f 1。

29、第六方面，本发明提供了由第一方面所述嵌合肽ccan f 1作为抗原制备的抗体。

30、第七方面，本发明提供了第六方面所述抗体在如下任一种的应用：

31、d1）制备治疗过敏药物；该抗体作为治疗过敏药物的活性成分。

32、d2）制备降低can f 1含量的制剂；该抗体作为降低can f 1含量的制剂的活性成分。

33、或，本发明提供了一种治疗过敏的药物，包括上述的抗体。

34、上文中，所述抗体为多克隆抗体，其作用是中和过敏原can f 1。

35、进一步地，所述抗体为动物血清抗体或动物卵黄抗体。

36、更进一步地，所述抗体为小鼠血清抗体或蛋鸡卵黄抗体。

37、所述小鼠血清抗体按照如下方法制备：将所述嵌合肽ccan f 1用1×pbs（氯化钠8.0 g，磷酸氢二钠1.44 g，磷酸二氢钾0.24 g，氯化钾0.2 g，ph 7.4）稀释后与等体积佐剂混合乳化，以25 μg/只的剂量皮下注射的方式对小鼠进行免疫，共免疫三次，第一次和第二次免疫间隔期为21天，第二次和第三次免疫间隔期为10天，最后一次免疫后一周，收集小鼠血清，得到小鼠血清抗体；

38、所述卵黄抗体按照如下方法制备：将所述嵌合肽ccan f 1用1×pbs（同上）稀释后与等体积佐剂混合乳化，以300 μg/只的剂量肌肉注射的方式免疫蛋鸡，共免疫四次，每次免疫间隔期为两周，收集第2-21周的鸡蛋，聚乙二醇沉淀法提取，获得卵黄抗体。

39、本发明以25 μg/只嵌合肽ccan f 1免疫小鼠后获得的抗体效价为1: 8388608；以嵌合肽ccan f 1免疫蛋鸡（300 μg/只），两周后获得抗体效价为1: 131,072，五周后获得的抗体效价最高，为1: 1,048,576，至二十一周后获得的抗体效价为1: 131,072。进一步的功能验证表明，将该卵黄抗体以1 g/只/天、2 g/只/天、3 g/只/天的剂量添加饲喂犬四周后，其毛发中的can f 1含量分别下降3.20%、67.16%和72.65%。

40、本发明的实验证明，该嵌合肽ccan f 1免疫动物后所获得的抗体效价较高，可与完整的can f 1蛋白特异性结合。

41、本发明有益效果至少包括：

42、（1）本发明嵌合肽 ccan f 1 精准整合 can f 1 核心 b 细胞抗原表位，免疫原性强，可诱导产生高效价特异性抗体，能与天然 can f 1 蛋白特异性结合，为犬过敏原靶向免疫提供优质候选分子。

43、（2）本发明嵌合肽可通过原核系统高效可溶性表达，纯化工艺简便、得率高，适合规模化生产，有效解决天然过敏原获取难、成本高的问题。

44、（3）本发明嵌合肽制备的特异性抗体可显著降低犬毛发中 can f 1 含量，具备开发抗过敏疫苗与过敏原中和制剂的潜力，应用价值明确。