一种广谱理性设计的铜绿假单胞菌噬菌体鸡尾酒组合物及其应用

本发明涉及生物工程，尤其涉及一种广谱理性设计的铜绿假单胞菌噬菌体鸡尾酒组合物及其应用。

背景技术：

1、铜绿假单胞菌（

pseudomonas aeruginosa）是临床最常见的非发酵革兰氏阴性条件致病菌，广泛存在于自然界及医院环境中。作为全球公认的六大耐药性“超级细菌”之一，该菌具有极强的环境适应性、复杂的群体感应系统以及极高的基因组可塑性。在重症监护室（icu）等高风险临床环境中，铜绿假单胞菌是导致呼吸机相关性肺炎（vap）、大面积烧伤创面感染、囊性纤维化患者慢性呼吸道感染以及继发性血流感染的主要元凶。近年来，随着广谱抗菌药物的广泛及非规范应用，铜绿假单胞菌通过产生活性酶（如金属β-内酰胺酶）、修饰外排泵系统、降低外膜微孔蛋白通透性以及形成致密顽固的生物膜等复杂机制，迅速发展出多重耐药（mdr）、广泛耐药（xdr）甚至全耐药（pdr）表型。特别是耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌（crpa），由于常规使用的一线药物（如头孢菌素类、碳青霉烯类及氟喹诺酮类）对其大面积失效，已被世界卫生组织（who）列为极其重要且优先研发新型抗菌药物的病原体。面对广泛耐药菌株，临床作为“最后防线”的多黏菌素类和替加环素不仅在肺部等组织的穿透性上存在局限，更伴随着严重的肾毒性、神经毒性以及极高的临床治疗失败率，使得重症耐药院内感染经常陷入无药可用的绝境。因此，探索和开发能够规避现有抗生素耐药机制、安全高效的新型非传统抗菌策略已成为全球生命科学与临床医学领域的当务之急。

2、在应对多重耐药铜绿假单胞菌感染的方面，利用噬菌体作为传统抗生素的替代杀菌手段已成为当前的研究热点与重要技术路线。目前现有技术主要集中于烈性噬菌体的独立发掘以及多价混合制剂的开发，旨在利用噬菌体的特异性裂解机制高效清除靶标病原菌。

3、一方面，现有技术通过从环境或临床样本中分离出特异性侵染铜绿假单胞菌的野生型烈性噬菌体，并对其杀菌动力学特性进行系统表征。大量体外实验表明，单一噬菌体不仅能够高效裂解处于浮游状态的耐药铜绿假单胞菌，还能特异性降解细菌分泌的胞外多聚物，从而有效破坏并清除顽固的细菌生物膜。此外，这种依赖于噬菌体增殖裂解的非抗生素杀菌效能，已在小鼠肺炎、败血症及烧伤创面感染等多种动物模型中得到了充分的体内验证。

4、另一方面，为了扩大单次给药的杀菌覆盖面，现有技术广泛采用构建噬菌体鸡尾酒（phage cocktail）的组合策略。研究人员基于体外交叉裂解实验的结果，将能够裂解不同铜绿假单胞菌株的数种噬菌体进行物理混合。这种多价制剂利用不同组分间的叠加杀菌效应，进一步提升了对目标致病菌群的整体裂解与清除能力。

5、通过对现有铜绿假单胞菌噬菌体相关技术的检索与分析发现，目前已公开的技术方案主要侧重于单一噬菌体的分离鉴定及其基础生物学特性的表征。现阶段，基于理性设计策略系统性构建噬菌体鸡尾酒组合物，从而有效拓宽宿主谱覆盖范围、协同抑制或克服细菌抗性突变的技术突破仍较为少见。

6、尽管噬菌体疗法被认为是攻克多重耐药铜绿假单胞菌感染最具前景的治疗方案，但现有单一噬菌体制剂以及经验性盲配的鸡尾酒制剂，在临床转化过程中仍存在以下三大致命缺陷，严重阻碍了其从科研成果向临床应用的转化进程：

7、缺陷一：宿主谱覆盖严重不足，经验性用药有效率低下。铜绿假单胞菌的全球流行克隆群遗传多样性极高，已报道的多位点序列分型（multi-locus sequence typing，mlst）型别超过3000种。然而，现有噬菌体制剂通常仅基于数株至数十株临床菌株进行筛选，导致宿主裂解谱极其狭窄（单株噬菌体感染率通常仅10%-30%）。当面对临床来源复杂多样的未知型别菌株时，经验性用药的有效率极低，难以满足急重症感染“先用药、后鉴定”的临床现实需求。

8、缺陷二：缺乏理性受体设计，细菌抗性产生速度远超预期。铜绿假单胞菌的基因组自发突变率高达10-6~10-8/代，在单一噬菌体选择压力下，最快数小时内即可筛选出完全抗性突变株。现有鸡尾酒组合多为经验性混合，缺乏基于受体靶向机制的理性配伍，常因多种噬菌体靶向相同或高度重叠的表面受体，致使细菌仅需单一关键受体突变即可同时逃逸多种噬菌体的攻击。这种设计缺陷导致鸡尾酒制剂在体内短时间内即失效，难以满足重症感染对长效、稳定杀菌效能的严苛要求。

9、缺陷三：个性化定制模式无法满足急重症感染的时效性刚需。目前临床噬菌体治疗需遵循“患者分离株→药敏/噬菌体裂解谱测定→匹配噬菌体→扩增制备”的个性化流程，全周期通常耗时7-14天。对于进展迅速的呼吸机相关性肺炎（vap）、重症血流感染等危急情况，患者往往无法等待如此漫长的准备周期。临床上迫切需要可即时调配、无需等待个性化筛选的标准化"现货型"广谱噬菌体制剂，以便在黄金救治窗口内快速控制感染。

10、因此，现有技术还有待于改进和发展。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种经过大规模临床菌株-噬菌体交叉互作筛选、基于多靶点受体互补机制理性设计的铜绿假单胞菌噬菌体鸡尾酒组合物及其应用。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明提供一种噬菌体鸡尾酒组合物，其中，所述噬菌体鸡尾酒组合物包括噬菌体φpa_14、噬菌体φpa_36、噬菌体φpa_49及噬菌体φpa_l9；

4、其中，所述噬菌体φpa_14的保藏编号为cgmcc no.47215，所述噬菌体φpa_36的保藏编号为cgmcc no.47217，所述噬菌体φpa_49的保藏编号为cgmcc no.47216，所述噬菌体φpa_l9的保藏编号为cgmcc no.47218。

5、具体地，所述噬菌体φpa_14，分类命名为铜绿假单胞菌噬菌体（

pseudomonas

aeruginosa phage），该噬菌体已于2026年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.47215，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

6、所述噬菌体φpa_36，分类命名为铜绿假单胞菌噬菌体（

pseudomonas aeruginosa

phage），该噬菌体已于2026年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.47217，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

7、所述噬菌体φpa_49，分类命名为铜绿假单胞菌噬菌体（

pseudomonas aeruginosa

phage），该噬菌体已于2026年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.47216，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

8、所述噬菌体φpa_l9，分类命名为铜绿假单胞菌噬菌体（

pseudomonas aeruginosa

phage），该噬菌体已于2026年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.47218，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

9、可选地，所述噬菌体鸡尾酒组合物由噬菌体φpa_14、噬菌体φpa_36、噬菌体φpa_49及噬菌体φpa_l9组成。

10、可选地，所述噬菌体φpa_14、噬菌体φpa_36、噬菌体φpa_49及噬菌体φpa_l9的终浓度均为1×107～1×1010pfu/ml，如2×108pfu/ml、1×109pfu/ml等。所述终浓度是指噬菌体在氯化钠水溶液中的浓度。

11、本发明还提供一种本发明所述的噬菌体鸡尾酒组合物在制备预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染的药物中的应用。

12、本发明还提供一种药物，其中，所述药物包括本发明所述的噬菌体鸡尾酒组合物。

13、可选地，所述药物还包括药学上可接受的载体。

14、可选地，所述药学上可接受的载体包括赋形剂、助流剂、稀释剂、防腐剂、着色剂、矫味剂、润湿剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、乳化剂中的至少一种。

15、可选地，所述药物还包括抗生素。

16、可选地，所述药物的剂型选自溶液剂、气溶胶、丸剂、片剂、胶囊剂、散剂、锭剂、糊剂中的一种。

17、本发明还提供一种本发明所述的噬菌体鸡尾酒组合物在处理生物圈中铜绿假单胞菌中的应用，所述应用为非疾病治疗目的。

18、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

19、（1）基于高通量双库互作筛选实现临床菌株的全面精准覆盖，显著优于现有技术。现有技术通常仅基于小规模菌株库（通常<30株临床分离株）对单一或少量噬菌体（通常<10株）进行筛选表征，代表性严重不足，导致开发出的制剂对真实临床菌群的覆盖率通常低于50%。然而，本发明建立了包含199株临床分离株（覆盖91种mlst型别）的宿主库和78株噬菌体的种子库，通过超过15,000个数据点的大规模互作矩阵分析，确保筛选出的噬菌体组合真正代表了临床菌群整体。据此理性设计的四株噬菌体组成的噬菌体鸡尾酒组合物的整体覆盖率（≥95%）较现有技术提升近一倍，从根本上解决了实验室表现优异、临床应用效果不佳的核心瓶颈。

20、（2）基于受体靶向理性配伍实现抗性逃逸的有效抑制，系统性超越现有技术。现有技术中的噬菌体组合多为经验性盲配，缺乏对每种组分噬菌体受体靶向机制的解析，常导致多种噬菌体靶向相同受体（受体冗余率达60%-80%），细菌仅需单一受体基因突变即可同时获得对2-3种噬菌体的交叉抗性。本发明通过解析φpa_l9、φpa_14、φpa_49及φpa_36的受体机制，确认它们分别靶向菌毛、核心寡糖和psl（可溶性多糖）胞外多糖这三种完全独立的表面结构，实现了零受体冗余的理想配伍。在这一设计下，细菌必须同时发生四种独立受体的功能丧失突变才能完全逃逸，这在临床场景可及的时间尺度和感染菌量下几乎不可能发生。

21、（3）标准化“现货型”配方策略彻底颠覆了传统诊疗模式，实现了时效与成本的双重突破。现有方案依赖个性化筛选流程，全周期通常7-14天，单次制备成本高昂且无法规模化。本发明提供的固定配方噬菌体鸡尾酒组合物作为标准化产品，仅需单一固定配方即可覆盖绝大多数高危耐药克隆群，可预先大规模制备和储存，在感染确诊后即时给药，响应时间从“周”级缩短至“即时”级。这一优势在呼吸机相关性肺炎、重症血流感染等24-48小时内即可致死的急重症场景中，具有决定性的临床价值。同时，标准化配方也显著降低了制备成本，使规模化生产和商业化推广成为可能。