噬菌体蛋白Gp17在制备抑制霍乱弧菌定植和毒素分泌的制剂中的应用的制作方法

本发明涉及生物，具体地说，涉及噬菌体蛋白gp17在制备抑制霍乱弧菌定植和毒素分泌的制剂中的应用。

背景技术：

1、霍乱，是一种由革兰氏阴性菌—霍乱弧菌（

vibrio cholerae）引起的急性肠道传染病，严重威胁人类健康。霍乱弧菌不仅可定植于人体肠道，还能附着于浮游生物体表，通过污染水源与海产品等食物实现传播。近年来，受全球气候变暖的影响，水体环境中弧菌的丰度呈持续上升趋势，这可能进一步改变弧菌相关疾病的流行特征。此外，由于霍乱弧菌的耐药性模式复杂多变，防治工作面临持续而严峻的挑战。

2、霍乱的发病机制复杂，其核心致病因子为霍乱毒素（ct）和毒素共调菌毛（tcp）。霍乱毒素ct由

ctxab基因编码的，通过ii型分泌系统分泌至肠道内，导致宿主细胞内camp水平急剧上升，进而引起水、钠、钾代谢紊乱，引发“米泔水”样腹泻。毒素共调菌毛tcp主要亚单位为

tcpa基因编码的iv型菌毛，可通过细菌自聚集作用介导霍乱弧菌在小肠黏膜的定植，是其在肠道中感染所必需的细菌结构。研究表明：霍乱弧菌通过复杂、多层次的调控网络来协调其毒力和定植相关基因的表达，以响应宿主肠道环境中的各种信号，其调控网络由复杂的多级信号级联系统主导。该系统整合肠道微环境信号（如渗透压、ph、氧气、胆汁及碳酸氢盐水平），通过toxr/tcpp-toxt这一中心级联精确控制毒力基因的表达。上游调控因子apha/aphb协同诱导

tcpp的转录表达，进而，toxr与tcpp协同激活下游转录调控因子toxt，最终驱动

ctxab与

tcpa的转录表达。此外，环境中的厌氧条件、群体感应（qs）、环核苷酸信号分子（如camp、c-di-gmp）、活性氧/氮物种（ros/rns）等也通过apha/aphb、luxo/hapr等多种调控因子影响毒力基因的表达，使霍乱弧菌能够适应从体外环境到宿主感染不同阶段的生存与致病性诱导需求。因此，深入理解霍乱弧菌毒素与菌毛的表达调控网络，发现新型调控蛋白，可为霍乱的防控提供新的策略。

3、噬菌体作为专一性感染细菌的病毒，广泛存在于自然界中，也是霍乱弧菌需要面对的一种生存压力。噬菌体基因组中编码了大量功能多样的噬菌体蛋白，这些蛋白在自身繁殖、抑制宿主菌生长、干扰毒力表达及调控宿主生理状态等方面展现出重要潜力，同时，噬菌体三分之二蛋白注释功能信息的缺失，引发噬菌体与霍乱弧菌互作研究值得深入挖掘。根据噬菌体蛋白在病毒颗粒形成与感染过程中的作用，噬菌体蛋白分为结构相关蛋白和非结构相关蛋白。结构蛋白直接参与噬菌体颗粒的组装与稳定性，例如衣壳蛋白负责保护病毒核酸，尾丝蛋白则介导对宿主细胞表面的识别与吸附；而非结构蛋白多在感染后表达，参与调控噬菌体的复制周期、整合过程或修饰宿主代谢通路，从而协助噬菌体完成增殖。噬菌体结构相关蛋白亦参与其它功能，已有研究表明，噬菌体λ的衣壳蛋白gpe 在表达后可强烈激活avs8系统，增加宿主菌对噬菌体的防御能力；铜绿假单胞菌噬菌体dms3编码的aqs1蛋白能特异性抑制细菌群体感应系统，降低宿主的毒力与生物膜形成；此外，噬菌体展示技术衍生的抗菌肽如n10与nb2，可通过协同作用破坏鲍曼不动杆菌生物膜。这些研究结果表明，噬菌体蛋白在噬菌体与宿主互作过程中不仅参与病毒自身生命周期，还可作为重要的宿主生物学功能的调控因子发挥功能。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供噬菌体蛋白gp17在制备抑制霍乱弧菌定植和毒素分泌的制剂中的应用。

2、本发明以噬菌体vp1基因组为研究对象，经序列比对及蛋白结构预测分析，对噬菌体蛋白进行筛选，初步确定具有潜在调控功能的候选蛋白。本发明还构建了所述候选噬菌体蛋白的原核表达质粒，并将其导入霍乱弧菌中，获得相应的表达菌株n-gp37，初步评价噬菌体蛋白对霍乱弧菌定植能力及毒力相关表型的影响。通过冷光值检测和实时荧光定量pcr（rt-qpcr）分析，进一步研究噬菌体蛋白对霍乱弧菌毒力及定植相关调控基因转录水平的调控作用；同时，采用乳鼠感染模型，对所述表达菌株在体内的定植能力和病理特征进行检测和比较，从而评价噬菌体蛋白对霍乱弧菌在乳鼠体内定植能力的影响。

3、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供噬菌体蛋白gp17，其为：

4、（a）由seq id no:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质或多肽；或，

5、（b）seq id no:1所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由（a）衍生的蛋白质或多肽。

6、第二方面，本发明提供编码所述蛋白gp17的核酸分子。

7、本发明噬菌体蛋白gp17的编码基因gp17的核苷酸序列为：

8、i）、seq id no:2所示的核苷酸序列；

9、ii）、seq id no:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；

10、iii）、在严格条件下与seq id no:2所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1% sds的0.1×sspe或含0.1% sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；

11、iv）、与i）、ii）或iii）的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或，

12、v）、与i）、ii）、iii）或iv）的核苷酸序列完全互补的核苷酸序列。

13、第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

14、进一步地，本发明提供一种重组表达载体，其包含所述核酸分子，并可操作地连接于表达调控序列。

15、进一步地，本发明提供一种重组宿主细胞，其包含所述重组表达载体或将所述核酸分子整合至其基因组中。

16、第四方面，本发明提供所述蛋白gp17在制备抑制霍乱弧菌（

vibrio cholerae）的制剂中的应用。

17、进一步地，所述制剂用于抑制霍乱弧菌在宿主肠道内的定植和/或霍乱毒素（ct）的分泌。

18、进一步地，所述抑制是通过下调霍乱弧菌中毒力相关基因和/或定植相关基因的转录水平来实现的；

19、所述基因选自

ctxa、

tcpa、

tcpp、

toxr和

toxt中的至少一种，它们在genbank中的参考序列编号分别为dq774432.1、dq773719.1、dq773718.1、dq774024.1、dq773728.1。

20、进一步地，所述制剂还用于降低霍乱弧菌对胆盐、酸碱度或盐浓度的环境耐受性。

21、第五方面，本发明提供一种药物组合物，其包含所述蛋白gp17、编码所述蛋白gp17的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料中的至少一种，以及药学上可接受的载体。

22、第六方面，本发明提供所述蛋白gp17作为霍乱弧菌毒力相关基因和/或定植相关基因抑制剂中的应用；

23、所述基因选自

ctxa、

tcpa、

tcpp、

toxr和

toxt中的至少一种，它们在genbank中的参考序列编号分别为dq774432.1、dq773719.1、dq773718.1、dq774024.1、dq773728.1。

24、第七方面，本发明提供一种鉴定噬菌体蛋白gp17抑制霍乱弧菌定植和/或毒素分泌的方法，将编码噬菌体蛋白gp17的基因通过质粒导入霍乱弧菌中，得到表达所述噬菌体蛋白gp17的重组霍乱弧菌，然后进行体内和体外实验检测所述重组霍乱弧菌的毒力及定植表型；所述方法为非疾病诊断和治疗目的。

25、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

26、（一）本发明中新鉴定的噬菌体蛋白gp17在特征上属于噬菌体结构相关蛋白，实验表明，该蛋白不仅参与噬菌体结构功能，还能够显著抑制霍乱弧菌毒力基因表达及降低菌株在乳鼠肠道的定植能力，提示噬菌体结构蛋白在调控宿主致病性方面可能具有新的功能模式，为靶向霍乱弧菌毒力调控提供了新的技术思路。本发明从霍乱弧菌特异性噬菌体基因库中筛选新型蛋白，不仅为阐明其影响宿主毒力与定植的复杂调控网络提供了全新工具，更能由此发现可干预的关键靶点。本发明筛选到的调控定植和毒力的蛋白可作为应用性研究探索的关注点，为控制霍乱弧菌传播及其感染治疗提供一种新的潜在策略。

27、（二）本发明提供的噬菌体蛋白gp17是一种全新的蛋白，经序列保守性比对分析和空间结构预测显示该蛋白为噬菌体结构蛋白，结构具有保守性，因此研究该蛋白与宿主互作过程中的生物学功能及其功能保守性，对于跨种属防控治疗具有重要意义。

28、（三）将噬菌体基因库作为筛选抑毒蛋白对象能大大提升获得阳性结果的可能性。噬菌体具有特异靶向的特点，因本身具有杀菌抑菌作用，潜在可候选的未知蛋白多。

29、（四）在噬菌体与宿主相互作用过程中，噬菌体能利用宿主资源实现其自身蛋白快速、高效地基因转录表达。这些蛋白不仅在宿主细胞内易于表达，也可借助质粒系统在大肠杆菌等原核表达体系中高效制备，从而便于开展表型分析与功能鉴定。