萝卜RsCYP79F1基因在提高萝卜硫素含量方面的应用

本发明属于植物基因工程，具体涉及萝卜

rscyp79f1基因在提高萝卜肉质根中萝卜硫素含量中的应用。

背景技术：

1、萝卜（

raphanus sativus l.）是十字花科萝卜属重要根茎类蔬菜，肉质根是主要的营养储存与食用器官。硫代葡萄糖苷（glucosinolates，gsls）作为主要存在于十字花科植物中的一种重要次生代谢物，具有参与植物防御、赋予植物特殊的风味、促进人体健康等作用。脂肪族硫苷4-甲基亚磺酰丁基硫苷（glucoraphanin， gra）的水解产物萝卜硫素（sulforaphane，sf）对致癌物质有解毒作用，并能够抑制癌细胞的生长。随着人们健康意识的增强，如何提高萝卜肉质根中的萝卜硫素这一功能成分的含量成为一个生物技术领域重要研究方向。

2、功能成分萝卜硫素最初是在萝卜中发现的，且种子中其含量较高。萝卜肉质根是主要食用器官，其萝卜硫素含量比种子中低。研究表明一些基因在拟南芥（

arabidopsis

thaliana） 的萝卜硫素生物合成代谢中发挥着十分重要的作用，这些关键酶基因包括硒甲基转移酶基因（

smt）、细胞色素氧化酶基因（

cyp79f1）等，其中

cyp79f1 是与萝卜硫素合成密切相关，其所编码的蛋白酶主要催化 n-羟基化反应，促使二高蛋氨酸 （dihomo-met）生成 5-甲硫基戊醛肟，是合成萝卜硫素核心结构的关键酶之一。萝卜中

rscyp79f1基因的生物学功能尚未阐明，限制了肉质根中功能成分萝卜硫素含量的遗传操作。

3、本发明通过在萝卜中过表达

rscyp79f1基因从而提高肉质根萝卜硫素含量，从而为萝卜肉质根高萝卜硫素含量积累性状遗传改良与优异种质创新提供重要的基因来源与技术支撑。

技术实现思路

1、本发明目的是提供一种涉及萝卜

rscyp79f1基因及其在提高肉质根中萝卜硫素含量方面的应用。

2、为实现上述目的，本发明所述萝卜

rscyp79f1基因的cds序列、氨基酸序列如seqid no.1 、seq id no.2所示（全长1623 bp，见附序列表），主要技术方案如下：

3、（1）与拟南芥

atcyp79f1基因进行序列比对，扩增萝卜

rscyp79f1基因cdna序列（图1）。

4、（2）过表达载体构建：通过同源重组将

rscyp79f1 cds序列连接至

wip载体（

asci/

kpni酶切位点），构建重组质粒。

5、（3）通过发根农杆菌介导的萝卜的遗传转化来进行萝卜

rscyp79f1基因功能的研究。将

rscyp79f1基因过表达重组质粒转化至发根农杆菌msu440，通过遗传转化后得到转基因植株，通过提取dna进行鉴定，得到4株转基因阳性植株（图2）。通过rt-qpcr的检测，发现转基因阳性植株中

rscyp79f1的相对表达量相比于对照显著增加，通过提取转基因阳性植株中的萝卜硫素，通过hplc的方法进行测定，结果表明，过表达

rscyp79f1后，萝卜硫素含量比对照增加5.95倍。

6、（4）pcr扩增体系为： cdna模板2 μl，引物

rscyp79f1 - f1 1 μl，

rscyp79f1- r11 μl，2 × phanta flash master mix 10 μl，ddh2o 补足至 20 μl。

7、反应条件为：95℃变性30 s；随后进行35个循环，每循环95℃ 10 s、60℃ 10 s、72℃ 30 s；之后72℃ 1 min；最后于 4℃保存。

8、（5）优选rt-qpcr引物为：

9、上游引物seq id no.5：5'- tcacgccggatgaagtcaaa - 3'

10、下游引物seq id no.6：5'- catttccgcaagcgtccatt - 3'

11、所述

rscyp79f1基因序列包括：

12、（i）seq id no.1所示的cds序列；

13、（ii）seq id no.2所示的氨基酸序列；

14、（iii）包含

rscyp79f1序列的重组表达载体。

15、（6）有益效果：

16、（i）通过rt-qpcr的检测，发现转基因阳性植株中

rscyp79f1的表达量相比于对照显著增加（图3）；

17、（ii）通过提取转基因阳性萝卜肉质根中的萝卜硫素，利用hplc的方法进行测定，发现过表达

rscyp79f1后，萝卜硫素的含量比对照增加5.95倍（图4）；

18、本申请利用超高效液相色谱仪（hplc）准确鉴定萝卜种质中萝卜硫素含量，萝卜

rscyp79f1基因在萝卜硫素的合成过程中发挥重要作用，因此通过过表达萝卜

rscyp79f1基因进行萝卜的遗传转化从而获得转基因植株，使得萝卜肉质根中的萝卜硫素含量增加了5.95倍，这有利于高萝卜硫素萝卜品种的创新，极大程度上提高了萝卜的营养价值。

1.萝卜rscyp79f1基因及其在提高萝卜硫素含量方面的应用，其特征在于，分离萝卜rscyp79f1基因，进行萝卜rscyp79f1基因过表达载体构建，通过遗传转化获得rscyp79f1过表达转基因阳性植株，提高肉质根中萝卜硫素含量。

2.一种用于权利要求1所述萝卜rscyp79f1基因，其特征在于，该基因的cds序列、氨基酸序列具体如seq id no.1-seq id no.2所示。

3.一种用于扩增权利要求1所述rscyp79f1基因的pcr引物对，其特征在于，所述引物对的碱基序列如seq id no.3 - seq id no.4所示。

4.一种用于权利要求1所述编码rscyp79f1基因以及检测转基因植物中rscyp79f1基因的rt-qpcr分析引物对，其特征在于，所述引物对的碱基序列如seq id no.5- seq id no.8所示。

5.一种用于权利要求1所述编码rscyp79f1基因的过表达分析引物对，其特征在于，所述引物对的碱基序列如seq id no.9- seq id no.10所示。

6.一种用于权利要求1所述提高萝卜肉质根中萝卜硫素含量的方法，其特征是，通过克隆萝卜rscyp79f1基因并构建启动子驱动的过表达载体，利用发根农杆菌介导的遗传转化体系将其转化进萝卜中，通过超高效液相色谱（hplc）法测定萝卜硫素含量，得到萝卜硫素含量提高的转基因植株。