比酶活、热稳定性及催化效率提高的碱性果胶裂解酶突变体及其应用

本发明属于生物工程和酶工程，具体涉及比酶活、热稳定性及催化效率提高的碱性果胶裂解酶突变体及其应用。

背景技术：

1、果胶裂解酶(pectate lyase，简称pl)基于β-反式消除作用切割果胶内部的α-1,4-糖苷键以产生寡聚糖，其在食品、造纸、纺织和饲料等领域具有较大应用潜力。天然的pl广泛存在于动植物和微生物中，但动植物中pl产量低，难以提取；微生物生长快速、培养条件简单、制备相对简单，是目前pl的重要来源。目前现存的pl仍存在一些局限性，比如耐碱性和耐热性差、ph作用范围小等。申请人前期研究的碱性果胶酶基因ncbi号为alk03050.1，含有963bp的开放阅读框，编码321个氨基酸，将该基因pela在大肠杆菌bl21(de3)中进行表达所得碱性果胶裂解酶经纯化后进行酶学性质分析的研究表明，该酶的最适温度为70℃，最适ph为10.0，比酶活为108.60±0.60u/mg，可以有效地降解聚半乳糖醛酸。但是该酶热稳定性不好，在70℃ph10.0条件下t1/2值仅有40.54min，不利于工业应用，因此通过分子改造方法提高该碱性果胶裂解酶的热稳定性具有重要意义。

2、目前常用的酶分子改造策略有定向进化、理性设计和半理性设计。定向进化通过对目标酶分子进行多轮突变、表达和筛选，从而获得所需功能的酶突变体。但是此法筛选工作量极大、耗时长、成本高，常因缺乏易实现的高通量筛选技术而受到限制。相反，理性设计和半理性设计通过计算模拟考察某位点突变对催化性能的影响，从而对酶定向进化进行设计指导和虚拟筛选，在酶工程领域发挥着重要的作用。因此，需要通过定向进化技术构建热稳定性高、比酶活高的碱性果胶裂解酶突变体。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的一些不足，本发明提供了比酶活、热稳定性及催化效率提高的碱性的果胶裂解酶突变体及其应用；本发明以野生型碱性果胶裂解酶的基因为模板，采用定点突变技术对其进行突变，然后将其重组表达，获得碱性果胶裂解酶突变体；所述碱性果胶裂解酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3或seq id no.5所示；相比野生型碱性果胶裂解酶，所述碱性果胶裂解酶突变体的比酶活、热稳定性及催化效率均有较大幅度的提高，更加适合造纸、纺织脱胶、洗涤等领域工业化生产的需要，在工业生产中具有较大的应用潜力以及经济价值，具有很好的实用性。

2、为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术效果。

3、本发明首先提供了一种碱性果胶裂解酶突变体，所述碱性果胶裂解酶突变体在氨基酸序列seq id no.1所示的野生型碱性果胶裂解酶基础上，将其第262位点的天冬氨酸突变为谷氨酸。

4、所述碱性果胶裂解酶突变体的氨基酸序列包括seq id no.3；或在seq id no.3所示的氨基酸序列基础上缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的保守性突变而获得的具有碱性果胶裂解酶活性的氨基酸序列。

5、优选地，所述碱性果胶裂解酶突变体还在seq id no.3的基础上，将将184位点的丝氨酸突变成丙氨酸。

6、所述碱性果胶裂解酶突变体的氨基酸序列包括seq id no.5；或在seq id no.5所示的氨基酸序列基础上缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的保守性突变而获得的具有碱性果胶裂解酶活性的氨基酸序列。

7、本发明还提供了编码上述碱性果胶裂解酶突变体的多核苷酸。

8、优选地，所述多核苷酸的核苷酸序列如seq id no.4、seq id no.6或其简并序列所示。

9、本发明还提供了包含上述多核苷酸的重组表达载体。

10、优选地，所述重组表达载体的表达载体包括pet28a。所述重组表达载体还可以用其他现有的表达载体构建；使用上述多核苷酸构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译；所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的；翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

11、优选地，本发明还提供了包含上述多核苷酸、或上述重组表达载体的重组菌。

12、其中，所述重组菌的构建方法包括：

13、(1)对pet28a质粒进行线性化处理，获取线性化的pet28a质粒；

14、(2)运用无缝克隆技术，将编码上述碱性果胶裂解酶突变体的多核苷酸与线性化的pet28a质粒进行连接，得到重组表达载体

15、(3)将重组载体转到宿主菌bl21(de3)中形成重组菌。

16、本发明还提供了一种生产碱性果胶裂解酶突变体的方法，所述方法包括：

17、对所述重组菌进行培养、诱导表达、分离纯化，最终得到所述碱性果胶裂解酶突变体。

18、优选地，以lb液体培养基为发酵培养基，所述重组菌在37℃培养至od600＝0.6-0.8，加入iptg后在16℃进行诱导表达12-16h，将所得菌液离心后收集发酵上淸，即为果胶裂解酶粗酶液，该果胶裂解酶粗酶液中含有碱性果胶裂解酶突变体。

19、本发明还提供了上述碱性果胶裂解酶突变体、或上述方法生产的碱性果胶裂解酶突变体在切割果胶内部的α-1,4-糖苷键以产生寡聚糖中的应用。

20、本发明还提供了上述碱性果胶裂解酶突变体、或上述方法生产的碱性果胶裂解酶突变体在降解聚半乳糖醛酸中的应用。

21、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

22、本发明通过定点突变的方法改造野生型碱性果胶裂解酶的基因，通过对其第262位点和第184位点的氨基酸进行突变，得到两种碱性果胶裂解酶突变体。

23、本发明将野生型碱性果胶裂解酶的氨基酸的第262位点的氨基酸由天冬氨酸突变为谷氨酸，得到碱性果胶裂解酶突变体d262e。相比野生型碱性果胶裂解酶，所述碱性果胶裂解酶突变体d262e的活性大幅度提高，比酶活显著增强，热稳定性明显提高，具体试验数据显示，碱性果胶裂解酶突变体d262e比酶活为759.01u/mg，相当于野生型碱性果胶裂解酶的387％，在70℃ph10.0条件下半衰期增加了20.92min，催化效率达到了野生型的8.08倍，更加适合纺织、造纸回收、化妆品、烘焙领域工业化生产的需要。

24、同时，本发明在将野生型碱性果胶裂解酶的262位点的天冬氨酸突变为谷氨酸的基础上，又将184位点的丝氨酸突变为丙氨酸得到碱性果胶裂解酶突变体s184a/d262e。相比野生型碱性果胶裂解酶，所述碱性果胶裂解酶突变体s184a/d262e的酶活、热稳定性及催化效率均有较大幅度的提高，所述碱性果胶裂解酶突变体在70℃的相对酶活提升141.81％、熔解温度(tm)提高3.57℃；在70℃/ph 10.0协同胁迫下半衰期(t1/2)达61.74min，为野生型的1.53倍；动力学参数分析表明km、vmax、kcat及kcat/km均显著优化，其中催化效率(kcat/km)达野生型的8.19倍，更加适合纺织、造纸回收、化妆品、烘焙领域工业化生产的需要。