一种产D-塔格糖的L-阿拉伯糖异构酶及其应用的制作方法

本发明属于生物工程，具体涉及一种产d-塔格糖的l-阿拉伯糖异构酶及其应用。

背景技术：

1、d-塔格糖是天然存在的一种重要的稀有己酮糖，是d-半乳糖的同分异构体、d-果糖的c4差向异构体和d-山梨糖的c3差向异构体。d-塔格糖是最有希望取代高热量甜味剂的候选物质。

2、与蔗糖相比，d-塔格糖甜度为蔗糖的92%，它的热量却只有蔗糖的38%。人体对d-塔格糖的吸收效率很低，仅有20%-25%被小肠吸收。d-塔格糖被小肠吸收后，代谢过程和d-果糖类似，但代谢速率只有果糖的50%。因此，d-塔格糖有望用于多种产品，包括健康食品和功能饮料。由于血糖指数较低，d-塔格糖导致血糖水平缓慢上升，这使其成为治疗2型糖尿病的其他糖的绝佳替代。此外，多种研究表明其在保护牙齿健康、降低胆固醇、提高肠道有益菌水平、预防结肠癌等方面具有重要作用。此外，d-塔格糖还可以用作化妆品工业中制备一些活性化合物的前体。综上所述，d-塔格糖因其特有的性质而具有巨大的市场应用前景。

3、d-塔格糖天然存在于木耳胶、乳制、一些水果和可可中，但是含量很少。为了大规模生产d-塔格糖，开发了化学和生物催化方法。化学生产过程复杂且效率低下，在此过程中会形成副产物，纯化复杂，能耗高。酶催化反应温和，纯化简单，绿色无污染。因此，酶法异构化生物技术生产塔格糖引起了研究人员的广泛兴趣。其中，l-阿拉伯糖异构酶（ec5.3.1.4，l-ai）可以通过催化d-半乳糖获得d-塔格糖，但是l-ai对底物不具有专一性，它还可以催化l-阿拉伯糖为l-核酮糖，且研究表明其对l-阿拉伯糖的催化效率优于d-半乳糖。l-ai广泛存在于多种微生物中，如大肠杆菌、芽孢杆菌、乳酸菌等。该酶反应在热力学上会随着反应温度的升高提高转化率。许多研究会围绕嗜热微生物来开展研究，但是较高的温度导致美拉德反应，产生褐色物质，会影响产物品质，同时也会增加副产物，增加后续纯化负担。少数报道的l-阿拉伯糖异构酶（l-ai）对d-半乳糖具有较高的转化率(>50%)，

pediococcuspentosaceuspc-5来源的l-ai在50℃时生物转化效果为52%（https://doi.org/10.1016/j.micres.2013.07.001）。源自枯草芽孢杆菌

b. subtilisdsm-92的重组l-ai，在42℃下将d-半乳糖异构为d-塔格糖，转化率约59%（https://doi.org/10.1016/j.lwt.2021.112199）。但它们所使用底物浓度都偏低，对工业生产不具有参考价值。

4、因此，需要开发具有高效催化高浓度底物d-半乳糖的l-ai酶，使其在中温条件下即可达到较高的塔格糖转化效果，来避免美拉德反应的发生，并同时获得高产率的塔格糖。筛选的新型l-ai酶制剂，对于塔格糖的工业生产具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的一是筛选鉴定可以在中温条件下高效催化d-半乳糖转化为d-塔格糖的l-阿拉伯糖异构酶并用于发酵生产d-塔格糖。本发明涉及l-阿拉伯糖异构酶的筛选，在51条序列中筛选到5条转化率较高的l-阿拉伯糖异构酶（简称l-ai）。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

3、首先提供l-阿拉伯糖异构酶在发酵生产d-塔格糖中的应用，所述l-阿拉伯糖异构酶如下：

4、l-ai-1氨基酸序列如seq id no:1所示。其来源于corynebacterium sp.，ncbi登录号为nlz57267.1，包含502个氨基酸。对应的核苷酸序列如seq id no:2所示。

5、l-ai-2氨基酸序列如seq id no:3所示。其来源于cellulomonas shaoxiangyii，ncbi登录号为wp_135974102.1，包含502个氨基酸。对应的核苷酸序列如seq id no:4所示。

6、l-ai-3氨基酸序列如seq id no:5所示。其来源于demequinamangrovi，ncbi登录号wp_042215802.1，包含504个氨基酸。对应的核苷酸序列如seq id no:6所示。

7、l-ai-4氨基酸序列如seq id no:7所示。其来源于tersicoccus sp. bi-70，ncbi登录号wp_076693203.1，包含507个氨基酸。对应的核苷酸序列如seq id no:8所示。

8、l-ai-5氨基酸序列如seq id no:9所示。其来源于tersicoccus，ncbi登录号为wp_068750957.1，包含502个氨基酸。对应的核苷酸序列如seq id no:10所示。

9、本发明还提供了一种制备d-塔格糖的方法，所述方法为将所述的l-阿拉伯糖异构酶催化d-半乳糖制备d-塔格糖。

10、所述l-阿拉伯糖异构酶的氨基酸序列如seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:7所示或seq id no:9所示。

11、所述l-阿拉伯糖异构酶是通过重组菌表达得到。具体地，所述重组菌具体将所述l-阿拉伯糖异构酶的的编码基因连接至表达载体再z转入出发菌中，以实现基因的异源表达。优选地，所述编码基因的核苷酸序列seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6、seq idno:8或seq id no:10所示。

12、具体地，所述重组菌是细菌或真菌。优选地，所述重组菌的出发菌是大肠杆菌；所述重组表达载体是pet-28a载体。更具体地，表达载体例如pet-28a载体，所述核苷酸序列插入到其中的ncoi和xhoi酶切位点中间，构建重组质粒，并将重组质粒转至基因工程菌大肠杆菌

e.colibl21(de3)中，实现基因的异源表达。

13、在具体实施方式中，所述重组菌经液体发酵培养后，将菌体离心，经超声破碎获得的上清液作为催化剂；

14、具体地，以d-半乳糖为底物，添加mn2+和/或co2+，在磷酸盐pb缓冲液ph 6.5-7.5中，50-60℃温度下反应。

15、更具体，在磷酸盐pb缓冲液ph 7.0中，55℃温度下反应5-20 h，反应结束后，经hplc液相检测和ccsa法检测d-塔格糖的转化率。

16、本发明筛选的l-阿拉伯糖异构酶采用d-半乳糖作为底物生产d-塔格糖，重组菌体经过简单处理获得粗酶液，在中温条件下，添加50 g/l的d-半乳糖，塔格糖转化率为47-57%。添加高浓度的d-半乳糖400 g/l，可以获得20-30%的塔格糖转化率。其中l-ai-1可以将400 g/ld-半乳糖高效转化，获得120 g/l塔格糖g/l，转化率较高为30%。反应条件温和，温度较低，避免褐变反应的发生，可有效降低转化成本，提高d-塔格糖的生产效率，利于工业生产和应用。