一种裂解多糖单加氧酶突变体、包含该突变体的酶制剂及应用

本发明属于酶工程，具体涉及一种裂解多糖单加氧酶突变体、包含该突变体的酶制剂及应用。

背景技术：

1、木质纤维素是地球上储量最丰富、分布最广泛的可再生生物质资源。高效转化利用木质纤维素对于缓解能源危机、减少环境污染及推动绿色生物制造具有重要战略意义。裂解多糖单加氧酶（lytic polysaccharide monooxygenase, lpmo）是近年来发现的铜依赖性氧化酶，其能够通过氧化裂解纤维素、几丁质等多糖底物c1或c4位的糖苷键，破坏高度有序的结晶区结构，显著增加木质纤维素的可及表面积。lpmo与纤维素酶系、半纤维素酶系等传统水解酶之间存在强烈的协同增效作用，可将多糖降解效率提升数倍，已成为当前生物质能源与生物精炼领域的核心酶制剂之一。

2、然而，天然来源的lpmo在工业化应用中仍面临诸多挑战。首先，野生型lpmo的比活力普遍较低，电子传递效率受限，难以满足大规模工业降解对高催化通量的需求。其次，lpmo作为铜依赖性氧化酶，其正确折叠高度依赖氧化性环境，在大肠杆菌等常用宿主细胞的胞质还原环境中极易形成无活性的包涵体，导致可溶性活性蛋白得率极低。此外，传统制备工艺需经历细胞破碎、层析纯化、浓缩干燥等复杂步骤，设备依赖度高、原材料消耗大，且游离态lpmo稳定性差、难以回收重复利用，使得综合生产成本居高不下，严重制约了其实际应用。

3、定向进化技术为突破上述瓶颈提供了有效途径。该技术模拟自然进化过程，通过随机突变和迭代筛选，无需预先精确解析酶的三维结构与催化机制，即可获得催化性能显著提升的优良突变体。然而，定向进化的成功高度依赖于高通量筛选体系的建立。传统lpmo活性检测多采用质谱分析氧化寡糖产物或复杂的还原糖测定法，操作繁琐、成本高昂、检测周期长，根本无法应对突变体文库动辄数千至上万个克隆的筛选需求，已成为制约lpmo定向进化效率的关键短板。因此，需要开发一种催化活性高、稳定性好、可回收重复利用的裂解多糖单加氧酶突变体及其酶制剂。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的一些不足，本发明提供了一种裂解多糖单加氧酶突变体、包含该突变体的酶制剂及应用；本发明基于大肠杆菌pelb信号肽周质分泌系统构建工程菌，通过易错pcr构建突变体文库，利用2,6-二甲氧基苯酚（2,6-dmp）显色体系建立96孔板高通量筛选方法，获得高催化活性的裂解多糖单加氧酶突变体；所述裂解多糖单加氧酶突变体的氨基酸序列如seq id no:4所示，编码该突变体的基因序列如seq id no:3所示，该突变体的酶活提升至野生型的1.59倍；本发明还构建了芽孢表面展示裂解多糖单加氧酶突变体的固定化酶制剂，在降解木质纤维素中具有很好的应用。

2、为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术手段：

3、本发明首先提供了一种裂解多糖单加氧酶突变体，所述裂解多糖单加氧酶突变体的氨基酸序列包括如下任一：

4、（1）seq id no:4所示的氨基酸序列；

5、（2）在seq id no:4所示的氨基酸序列基础上进行一定程度上的氨基酸替换、插入、取代、添加、缺失修改后的氨基酸序列。

6、本发明还提供了编码所述裂解多糖单加氧酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no:3或其简并序列所示。

7、本发明还提供了生物材料，所述生物材料为：表达盒、载体、重组细胞或重组菌；

8、其中，所述表达盒包含所述基因；

9、所述载体携带所述基因或携带所述表达盒；

10、所述重组细胞或重组菌携带所述基因或表达盒、或含有所述载体、或能够表达上述裂解多糖单加氧酶突变体。

11、本发明还提供了一种酶制剂，所述酶制剂包含上述裂解多糖单加氧酶突变体。

12、优选地，所述酶制剂包括芽孢表面展示裂解多糖单加氧酶突变体的固定化酶制剂。

13、优选地，所述芽孢表面展示裂解多糖单加氧酶突变体的固定化酶制剂的构建方法包括：

14、将编码裂解多糖单加氧酶突变体的基因克隆至枯草芽孢杆菌芽孢表面展示穿梭载体phs-cotb中，然后转化枯草芽孢杆菌wb800n，经培养诱导形成芽孢后，所述裂解多糖单加氧酶突变体展示于芽孢表面，获得芽孢表面展示裂解多糖单加氧酶突变体的固定化酶制剂。

15、优选地，所述枯草芽孢杆菌wb800n在枯草芽孢杆菌基础上敲除了npre、nprb、apre、epr、mpr、bpf、vpr、wpra这 8个蛋白酶基因。

16、本发明还提供了所述裂解多糖单加氧酶突变体、或所述生物材料、或所述酶制剂在降解木质纤维素中的应用。

17、优选地，所述木质纤维素来源包括小麦秸秆。

18、本发明还提供了一种降解木质纤维素的方法，所述方法包括：将所述裂解多糖单加氧酶突变体、或所述生物材料、或所述酶制剂加入到木质纤维素中。

19、优选地，所述方法包括：

20、将含有木质纤维素的底物颗粒、固定化酶制剂、混合酶酶系、电子供体抗坏血酸及cu2+混合组成反应体系，控制反应体系含水量，于37℃降解72 h；

21、所述混合酶酶系包括质量比为1:1:1:1:1的甘露聚糖酶、葡聚糖酶、酸性纤维素酶、纤维二糖酶、木聚糖酶混合酶系。

22、优选地，控制反应体系含水量为65%，于37℃降解72 h；

23、以含有木质纤维素的底物颗粒质量计，固定化酶制剂添加量为20%（v/m，ml/g），混合酶酶系添加量为0.3%（m/m），抗坏血酸终浓度为4mm，cu2+终浓度为0.075mm。

24、与现有技术相比，本发明的优点和技术效果：

25、（1）本发明利用大肠杆菌pelb信号肽周质分泌系统实现lpmo的可溶性表达，结合96孔板2,6-dmp显色法高通量筛选，单次可筛选数百至数千个克隆，筛选周期从数周缩短至3-4天，正向突变率显著提升。

26、（2）本发明筛选获得的突变体mtc1lpmo-a1酶活较野生型提高1.59倍，且经多轮复测变异系数小于8%，活性提升稳定可靠。结构分析揭示a1突变通过优化n端疏水微环境提升催化效率。

27、（3）本发明将突变体展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，芽孢的高抗逆性有效保护酶蛋白，固定化酶制剂易于收集、无需纯化、且可通过离心直接回收，具备工业化连续操作的应用潜力。

28、（4）本发明工艺简便、成本低廉，固定化酶制剂可通过离心直接回收并重复使用，具备规模化生产与广泛应用前景。

1.一种裂解多糖单加氧酶突变体，其特征在于，所述裂解多糖单加氧酶突变体的氨基酸序列包括如下任一：

2.编码权利要求1所述的裂解多糖单加氧酶突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no:3或其简并序列所示。

3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为：表达盒、载体、重组细胞或重组菌；

4.一种酶制剂，其特征在于，所述酶制剂包含权利要求1所述裂解多糖单加氧酶突变体。

5.根据权利要求4所述酶制剂，其特征在于，所述酶制剂包括芽孢表面展示裂解多糖单加氧酶突变体的固定化酶制剂。

6.权利要求1所述裂解多糖单加氧酶突变体、或权利要求3所述生物材料、或权利要求4~5任一项所述酶制剂在降解木质纤维素中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述木质纤维素来源包括小麦秸秆。

8.一种降解木质纤维素的方法，所述方法包括：将权利要求1所述裂解多糖单加氧酶突变体、或权利要求3所述生物材料、或权利要求4~5任一项所述酶制剂加入到木质纤维素中。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，控制反应体系含水量为65%，于37℃降解72 h；