一种近红外比率型小分子荧光探针及其合成方法与应用

本发明属于线粒体功能检测，涉及线粒体自噬监测工具的开发与应用。更具体地，涉及一种基于 ph 响应的近红外比率型小分子荧光探针及其合成方法和它在特异性识别线粒体自噬过程中的 ph 环境变化的应用，实现对细胞及活体水平线粒体自噬的精准检测、实时成像与动态监测。

背景技术：

1、线粒体自噬是细胞通过自噬机制选择性清除受损、功能异常线粒体的关键生物学过程，参与维持细胞内环境稳态、能量代谢平衡及细胞存活调控，其功能紊乱与肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病、代谢综合征等多种重大疾病的发生发展密切相关。因此，开发高效、精准的线粒体自噬检测工具，对于揭示疾病病理机制、实现早期诊断及评估治疗效果具有重要意义。

2、目前，线粒体自噬的监测方法主要包括透射电子显微镜观察、western blot 检测自噬相关蛋白表达、绿色荧光蛋白（gfp）标记的自噬标志物融合蛋白成像等。然而，这些方法存在明显局限性：透射电子显微镜操作复杂、样本制备耗时且无法实现活体动态监测；western blot 仅能获得细胞群体的平均水平，缺乏单细胞分辨率且无法反映时空动态变化；gfp 标记法存在光漂白明显、组织穿透深度浅、背景荧光干扰大等问题，尤其在活体成像中效果受限。

3、小分子荧光探针技术因其操作简便、灵敏度高、可视化能力强等优势，已成为生物分子与细胞过程检测的重要手段。其中，近红外荧光探针凭借组织穿透深度深、光毒性低、生物背景干扰小等特点，在活体成像中展现出独特优势。线粒体自噬过程中，自噬体与线粒体融合后形成的自噬溶酶体具有酸性微环境（ph 约 4.5-6.0），这一 ph 变化为探针设计提供了特异性靶点。现有 ph 响应型荧光探针多存在响应范围不匹配、线粒体靶向性差、光稳定性不足、细胞毒性较高等问题，难以满足线粒体自噬精准检测的需求。

4、因此，开发一种兼具高 ph 响应特异性、强线粒体靶向性、优异光稳定性及低细胞毒性的近红外荧光探针，成为本领域亟待解决的技术难题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供一种近红外小分子荧光探针及其合成方法与应用，所述荧光探针是一种基于ph响应特异性检测线粒体自噬的近红外小分子荧光探针。

2、为实现上述目的，本技术首先提供一种近红外比率型小分子荧光探针，所述近红外比率型小分子荧光探针的结构式为：

3、。

4、其有益效果在于：该荧光探针以半花菁衍生物为荧光报告基团，以吗啉环为线粒体靶向基团，以酚羟基为 ph 响应位点，通过荧光信号的 “淬灭 - 激活” 切换，实现对细胞及活体水平线粒体自噬的精准、特异性检测与动态监测。

5、其次，本发明提供一种如上述近红外比率型小分子荧光探针的合成方法，所述合成方法具体包括如下步骤：

6、（1）取三氯氧磷溶于干燥的二氯甲烷中，将溶液缓慢加入到二氯甲烷、n,n-二甲基甲酰胺体积比为1:1的混合溶剂中，0℃搅拌1h；随后加入n-甲基-4-哌啶酮，70℃回流反应3h；反应结束后将其缓慢滴加到去离子水中并冷藏过夜；有黄色固体析出，抽滤并用二氯甲烷洗涤，得到粗产物化合物1。

7、(2)将2,3,3-三甲基-3h-吲哚和碘乙烷溶于甲苯中，100℃回流搅拌24h；有固体析出，待反应完毕，冷却至室温，抽滤得到粗产物并用乙醚洗涤，得到粉色固体化合物2。

8、(3)在氮气保护条件下，取经步骤（1）和步骤（2）制备的化合物1和化合物2溶于醋酸酐，然后向混合物中加入乙酸钠，室温25℃反应6h；有绿色固体析出，反应结束直接抽滤并用去离子水洗涤，得到绿色固体产物化合物n-cy7。

9、(4)在氮气保护下，取经化合物步骤（3）制备的化合物n-cy7以及间苯二酚溶于无水n,n-二甲基甲酰胺中，并缓慢滴加三乙胺，110℃回流反应0.5h，得到蓝色溶液，冷却至室温后，减压蒸馏除去溶剂，得到粗产物；将粗产物经硅胶柱纯化，得到纯产物半花菁n-hcy7。

10、(5)取经步骤（4）制备的半花菁n-hcy7以及2-（4-吗啉）基溴溶于干燥的乙腈中，80℃反应6h，有蓝色沉淀析出；冷却至室温后，减压蒸馏除去溶剂，并用dcm洗3次，通过液相色谱仪进行纯化，最终得到纯产物，即所述近红外比率型小分子荧光探针。

11、以上所述的近红外小分子荧光探针的合成路线，如下所示：

12、

13、其有益效果在于：探针以半花菁衍生物为荧光报告基团，特异性响应自噬溶酶体酸性微环境（ph 4.5-6.0），在正常生理 ph 下荧光微弱，可精准检测线粒体自噬并避免非特异性干扰；其含有的特异性线粒体靶向基团能实现精准追踪线粒体自噬全流程且不干扰其他细胞器检测；荧光发射波长处于 650-750 nm 近红外区，兼具组织穿透深、光毒性低、生物背景干扰小的优势，可覆盖体外单细胞成像与活体组织动态监测等多层面场景；同时探针水溶性优异，10-50 μm 浓度下细胞存活率高，可以长时间稳定检测，为线粒体自噬相关疾病的病理机制研究、疾病早期诊断及治疗效果评估提供高效可视化工具。

14、优选地，步骤（1）中，所述n-甲基-4-哌啶酮、n,n-二甲基甲酰胺、三氯氧磷的摩尔比为1：3~5：3~5；所述三氯氧磷溶于干燥的二氯甲烷中三氯氧磷和二氯甲烷体积比是18:15；所述三氯氧磷与去离子水的体积比为18:200。

15、优选地，步骤（2）中所述2，3，3-三甲基-3h-吲哚、碘乙烷的摩尔比为1：1.5~3.5；所述2，3，3-三甲基-3h-吲哚质量和甲苯的体积比为10g：50ml。

16、优选地，步骤（3）中所述化合物1、化合物2、乙酸钠的摩尔比为1：2：13.3；所述化合物1的质量和乙酸酐的体积比为0.2g：15ml。

17、优选地，步骤（4）中所述化合物n-cy7、间苯二酚、三乙胺的摩尔比为1：1.5~3：1.5~3；化合物n-cy7质量和n,n-二甲基甲酰胺体积比是0.8:15ml；所述硅胶柱纯化的洗脱剂为ch2cl2：meoh体积比10:1。

18、优选地，步骤（5）中所述半花菁n-hcy7、2-（4-吗啉）基溴的摩尔比为1：3~5；所述半花菁n-hcy7质量和乙腈体积比为173mg：15ml。

19、针对合成荧光探针反应，发明人通过创造性试验得到各种原料配比，其中n-甲基-4-哌啶酮、间苯二酚和三乙胺的用量尤为重要，其中三乙胺影响到反应的酸碱调控，关系到反应能否顺利进行；而n-甲基-4-哌啶酮和间苯二酚的含量直接影响到反应进行的程度，关系到反应完全及过量处理的步骤。

20、本发明还提供一种上述的近红外比率型小分子荧光探针在检测细胞中线粒体自噬的应用，实现细胞水平线粒体自噬的实时动态成像、活体组织线粒体自噬的精准监测。

21、综上，一种近红外小分子荧光探针及其合成方法与应用，与现有技术相比，本发明具备如下显著优势：

22、1）检测特异性与精准度突出。探针采用“半花菁衍生物荧光报告基团-吗啉环靶向基团-酚羟基ph响应位点”的设计，吗啉环可借助线粒体膜电位差实现特异性富集；仅在自噬溶酶体ph 4.5~6.0的酸性微环境中荧光显著增强，生理ph下荧光淬灭，有效规避非靶向区域及正常生理环境的干扰，可精准标记线粒体自噬发生区域。

23、2）光物理性能与生物相容性优异。探针荧光发射波长处于650~750 nm近红外区，生物背景干扰小、光毒性低，适配活体成像；细胞毒性极低，10~50μm浓度下细胞存活率高，生物相容性良好，适合各类细胞及活体模型检测。

24、3）合成与应用场景适配性强。合成步骤简洁（仅5步），反应条件温和（室温至110℃），纯化过程简单高效；应用场景广泛，既可实现细胞水平线粒体自噬的单细胞分辨率实时成像，又能完成活体组织（肿瘤、肝脏、脑组织等）的动态监测，还可用于线粒体自噬相关疾病早期诊断试剂盒制备及自噬调控药物筛选评估，实用性与转化前景突出。