一种生物氮菌剂制备及其活性检测方法与流程

本发明涉及微生物培养及菌剂制备，尤其涉及一种生物氮菌剂制备及其活性检测方法。

背景技术：

1、氮素是作物生长过程中需求量较大的营养元素，农业生产中通常通过施用尿素、铵态氮肥等化学氮肥补充作物所需氮素；化学氮肥能够在施用后较快形成可被作物吸收利用的氮源，但受氮素利用效率及土壤氮素转化过程影响，其实际供氮效果存在一定局限；生物氮菌剂利用固氮微生物将空气中的分子氮转化为可利用氮源，可作为化学氮肥的补充用于作物氮素供应，由于微生物固氮受到菌体生长状态、土壤环境以及作物根际条件等因素影响，实际施肥过程中通常仍需保留一定量的速效氮肥以满足作物生长前期的氮素需求，生物氮菌剂与化学氮肥配合使用由此成为微生物肥料的一种应用方式。

2、现有技术已经关注结合态氮对固氮菌固氮功能的影响，例如公开号为cn108048384a公开了一种glna基因缺失的耐铵固氮微生物，通过改变菌体对铵态氮的调节作用使其在较高铵浓度条件下保持固氮能力；公开号为cn113321558a公开了一种含固氮微生物的长效氮肥，将尿素、固氮微生物及具有吸附、保水作用的添加剂配合使用，以兼顾化学氮源供给和微生物作用；此外，现有技术中还存在筛选耐铵固氮菌、采用载体负载微生物以及控制氮肥释放等技术方案，都是从提高固氮菌在含氮环境中的固氮能力、改善菌体存活条件或者协调化学氮肥与微生物菌剂共存等方面进行改进。

3、在实际土壤环境中，速效氮含量并非保持固定，尿素等氮肥施入土壤后会经历溶解、水解、迁移、转化和作物吸收，使局部铵态氮由较高水平逐步降低，在此过程中还会因肥料继续转化、土壤水分变化及氮素迁移而出现短时铵浓度波动；持续存在较高水平铵态氮时，固氮菌降低固氮功能，减少不必要的能量消耗，但速效氮逐渐减少以后，低水平残余铵以及短时出现的铵浓度升高仍使固氮功能受到抑制，菌体在低氮过渡阶段因此反复经历固氮功能降低和恢复的过程；现有生物氮菌剂主要以有效活菌数、存活稳定性或者在无固定氮条件下恢复后的固氮活性评价菌剂性能，难以反映菌剂在上述氮源变化条件下的实际固氮状态。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：现有生物氮菌剂在速效氮由高向低变化的使用环境中，存在低水平残余铵或短时铵浓度波动反复抑制固氮功能，影响生物固氮作用连续发挥的问题，为此，本发明提供一种生物氮菌剂及其制备方法和活性检测方法。

2、为实现上述目的，本发明提供一种生物氮菌剂，所述生物氮菌剂包括巴西固氮螺菌菌体、用于负载菌体的载体以及用于菌体制剂化的保护组分。

3、所述巴西固氮螺菌菌体在制剂化前先进行固氮功能诱导，使菌体固氮活性达到稳定水平，再采用铵态氮进行短时处理使菌体固氮活性降低，撤除外源铵态氮后，在菌体固氮活性尚未恢复至处理前水平时加入保护组分，并进行载体化和低温脱水，得到固体生物氮菌剂。

4、所述巴西固氮螺菌选用能够在铵态氮作用下发生固氮活性降低，并在撤除铵态氮后恢复固氮活性的菌株。

5、铵态氮短时处理在菌体固氮活性达到稳定水平后进行，使制剂化前的菌体处于即时固氮活性低于其恢复后固氮活性的状态。

6、所述载体包括硅藻土和腐植酸，按载体总质量为100份计，硅藻土为65-75份，腐植酸为25-35份；

7、所述保护组分包括大豆磷脂、海藻糖和谷氨酸钠，相对于100份载体，大豆磷脂的用量为2-4份，海藻糖的用量为1-3份，谷氨酸钠的用量为0.3-0.8份，所述保护组分在外源铵态氮撤除后与菌体混合，随后进行载体化和低温脱水。

8、所述生物氮菌剂的有效活菌数≥2×108cfu/g，水分含量为6-10wt%。

9、按照本发明提供的活性检测方法完成复水和菌体标准化后直接检测时，菌体的即时固氮活性低于经无固定氮条件充分恢复后的固氮活性，短时铵态氮处理并撤除铵态氮后能够恢复固氮功能，在持续铵态氮条件下其固氮活性仍受到抑制。

10、在一种实施方式中，按照本发明提供的活性检测方法进行短时铵态氮处理并撤除铵态氮后，菌体固氮活性恢复至无铵基准固氮活性80%所需的时间≤12min，在连续进行多次短时铵态氮处理的检测条件下，检测周期内累计固氮活性相对于相同检测时间内无铵基准条件累计固氮活性的保持率≥80%。

11、本发明还提供上述生物氮菌剂的制备方法，所述制备方法包括菌体扩繁、固氮功能诱导、铵态氮短时处理、外源铵态氮撤除、恢复前保护以及载体化和低温脱水，具体如下：

12、s1：将巴西固氮螺菌进行活化和种子培养，将所得种子液接入扩繁培养体系进行培养，所述扩繁培养体系中含有供菌体生长利用的固定氮源，待菌体数量达到后续固氮功能诱导所需水平后结束扩繁。

13、s2：将扩繁后的巴西固氮螺菌转入无外加固定氮源的固氮诱导培养体系，在微需氧条件下进行固氮功能诱导，使菌体固氮活性逐步升高，待固氮活性达到稳定水平后结束诱导，所述诱导过程以菌体固氮活性的变化作为判断依据。

14、进一步地，所述固氮功能诱导在28-32℃、ph6.5-7.2的条件下进行，诱导时间为2-18h；

15、在一种实施方式中，连续取样测定菌体固氮活性，当固氮活性达到该批菌体稳定固氮活性的85%以上，且相邻取样点的固氮活性变化不超过10%时，结束固氮功能诱导。

16、s3：向完成固氮功能诱导的菌体培养体系中加入铵态氮进行短时处理，使菌体固氮活性降低，并通过控制铵态氮浓度和处理时间，使菌体在撤除铵态氮后仍能够恢复固氮活性。

17、进一步地，所述铵态氮由铵盐提供，优选采用nh4cl，处理过程中nh4+浓度为0.05-1.00mmol/l，处理时间为3-20min，优选nh4+浓度为0.10-0.50mmol/l，处理时间为3-10min，所述nh4+浓度和处理时间在上述范围内配合选择。

18、在一种实施方式中，以铵态氮处理结束时菌体即时固氮活性为处理前固氮活性的10-30%，且撤除铵态氮后20min内能够恢复至处理前固氮活性的80%以上作为处理条件的确定依据，使短时铵态氮处理后的菌体固氮活性降低，同时保留撤铵后的恢复能力。

19、s4：铵态氮处理结束后立即降低菌体温度，并去除培养体系中的外源铵态氮，所述外源铵态氮采用低温离心洗涤方式去除，处理过程中采用无固定氮的等渗液对菌体进行洗涤或洗滤。

20、进一步地，所述铵态氮撤除过程在4-10℃下进行，待菌体外环境中的残余nh4+浓度降低至0.02mmol/l以下时完成外源铵态氮撤除，并以达到上述残余nh4+浓度的时间作为后续保护处理的计时起点。

21、s5：将撤除外源铵态氮后的菌体保持在4-10℃，在菌体固氮活性尚未恢复至铵态氮处理前水平时加入预冷的保护组分并进行混合，保护处理完成后不进行使菌体固氮活性充分恢复的无固定氮培养，直接进行载体化处理。

22、进一步地，所述保护组分在撤除外源铵态氮后的0-15min内加入，优选在5-10min内加入，具体加入时间以菌体即时固氮活性仍低于铵态氮处理前固氮活性为控制依据。

23、s6：将经保护处理的菌体与硅藻土和腐植酸组成的载体混合，使菌体负载于载体中，随后进行低温脱水，得到所述生物氮菌剂。

24、进一步地，菌体与载体混合后的湿物料含水量为20-30wt%，脱水过程中物料温度不高于35℃，待所得菌剂的水分含量降低至6-10wt%后结束脱水。

25、在上述制备方法中，固氮功能诱导在铵态氮短时处理之前进行，使铵态氮作用于固氮活性已经达到稳定水平的菌体，铵态氮处理结束后先撤除外源铵态氮，再在菌体固氮活性尚未恢复至处理前水平时加入保护组分，随后进行载体化和低温脱水，使所得生物氮菌剂区别于扩繁后直接制剂化、固氮诱导后直接制剂化以及撤除铵态氮后经无固定氮恢复处理再进行制剂化所得菌剂。

26、本发明还提供一种用于上述生物氮菌剂的活性检测方法，所述方法将菌剂复水、分离并完成菌体量标准化后直接进行检测，不设置使菌体固氮活性充分恢复的无固定氮预培养步骤，并分别测定菌体在无铵条件、持续铵态氮条件以及短时铵态氮处理并撤除铵态氮后的固氮活性变化，以评价生物氮菌剂在不同铵态氮作用条件下的固氮响应。

27、所述活性检测方法包括将待测生物氮菌剂加入无菌等渗复水液中进行复水，使载体中的菌体进入复水液，去除载体颗粒后收集菌体，根据菌悬液的od600调整不同待测样品的菌体浓度，使不同样品之间的菌体量保持在预设偏差范围内，完成菌体标准化后直接用于后续固氮活性检测，固氮活性检测结果按照菌体蛋白量进行归一化。

28、将标准化后的菌体分别用于无铵基准固氮活性检测、持续铵态氮检测和短时铵态氮处理后的恢复检测，所述无铵基准固氮活性检测在无外加固定氮源且不外加铵态氮的检测培养体系中进行，待固氮活性进入稳定阶段后取相应检测结果作为无铵基准固氮活性；所述持续铵态氮检测在检测周期内维持设定的铵态氮浓度，用于测定持续铵态氮作用下菌体固氮活性的降低情况；所述短时铵态氮检测对菌体进行有限时间的铵态氮处理，处理结束后撤除外源铵态氮并连续测定菌体固氮活性的恢复过程。

29、进一步地，持续铵态氮检测过程中nh4+浓度为1-5mmol/l，并在检测周期内监测nh4+浓度，使其保持在设定范围内；短时铵态氮检测过程中nh4+浓度为0.05-0.20mmol/l，处理时间为3-10min，处理结束后将菌体外环境中的残余nh4+浓度降低至0.02mmol/l以下，并以达到上述残余nh4+浓度的时间作为恢复检测的计时起点。

30、短时铵态氮撤除后，按照设定时间间隔测定菌体固氮活性，以无铵基准固氮活性的80%作为恢复终点，将菌体固氮活性恢复至所述恢复终点所需的时间记为t80。

31、进一步地，对标准化后的菌体连续进行两次以上短时铵态氮处理，每次处理结束后均撤除外源铵态氮并设置恢复阶段，按照相同时间间隔测定整个检测周期内的固氮活性，根据各检测时间点的固氮活性及对应时间，采用梯形积分法分别计算相邻检测时间点之间的累计固氮活性并求和，得到整个检测周期内的累计固氮活性，将重复短时铵态氮处理条件下的累计固氮活性与相同检测时间内无铵基准条件下的累计固氮活性进行比较，所得比值作为动态累计活性保持率。

32、在一种实施方式中，用于评价前述生物氮菌剂t80和动态累计活性保持率时，短时铵态氮处理采用0.20mmol/l的nh4+处理5min，处理结束后将残余nh4+浓度降低至0.02mmol/l以下；动态累计活性保持率检测连续进行3个短时铵态氮处理周期，每次撤除铵态氮后设置15min恢复阶段。

33、所述固氮活性采用乙炔还原法进行测定，将标准化后的菌体置于无固定氮检测培养体系中，使菌体在规定反应时间内与乙炔接触，测定反应生成的乙烯量，并按照菌体蛋白量对检测结果进行归一化，所述t80及动态累计活性保持率均以乙炔还原法测得的固氮活性为基础进行计算。

34、上述生物氮菌剂通过固氮功能诱导使菌体固氮活性达到稳定水平，再进行铵态氮短时处理和外源铵态氮撤除，并在菌体固氮活性尚未恢复至处理前水平时加入保护组分，随后进行载体化和低温脱水。

35、所述活性检测方法通过持续铵态氮条件下的固氮活性降低情况以及短时铵态氮撤除后的固氮活性恢复速度和累计固氮活性，对不同制备处理所得生物氮菌剂的动态固氮活性进行评价。

36、本发明的技术效果和优点：

37、本发明中，通过先对巴西固氮螺菌进行固氮功能诱导，使菌体建立稳定的固氮功能，再进行短时铵态氮处理，在菌体固氮活性尚未恢复至处理前水平时加入保护组分，随后进行载体化和低温脱水，使所得菌剂保持较低的即时固氮活性和较快的后续恢复能力；与扩繁后直接制剂化、固氮诱导后直接制剂化或撤铵后经无固定氮恢复处理再进行制剂化的方式相比，上述处理顺序使所得菌剂在持续高铵条件下仍保持固氮抑制，而在低水平铵态氮降低或短时铵态氮撤除后具有较快的固氮活性恢复速度，在重复短时铵态氮处理条件下能够保持较高的累计固氮活性，同时结合持续铵态氮和短时铵态氮处理后的动态活性检测，可对所得菌剂的固氮功能降低及恢复情况进行评价。