一种用于水处理的载体菌丝球低温保存方法

本发明属于但不限于环境生物，尤其涉及用于水处理的菌丝球—微藻复合载体保存技术。

背景技术：

1、在污水处理、污染物去除和生物资源化利用过程中，微生物固定化载体能够为微生物提供附着空间，使微生物保持较高的局部浓度并持续发挥水处理功能。菌丝球是丝状真菌在液体培养过程中由菌丝相互缠绕形成的三维自固定化结构，具有较大的比表面积、内部孔隙和一定的结构强度，可以作为污染物传递以及微生物附着的载体。将菌丝球与微藻共同培养形成菌藻复合体系，还能够利用菌丝球的空间结构为微藻提供表面和内部孔隙附着位点，使复合体系兼具载体结构和微藻水处理功能。

2、现有公开研究已经关注到真菌与微藻的共培养、共颗粒化或共固定化，并将其用于有机物和含氮污染物去除、藻生物量回收以及水处理过程强化。这类技术主要解决菌丝球与微藻如何接触、附着和共同发挥作用的问题。对于已经形成水处理功能的菌藻复合载体，工程应用还需要在设备检修、季节性停运、备用菌剂储存或系统快速启动前，将其保持在可恢复的状态。

3、现有的丝状真菌保存方法通常以保存菌种或保持菌株存活为目标，常见方案包括斜面传代、甘油保存、冷冻保存和冷冻干燥等。上述方法的保存对象通常是单一菌株或分散细胞，未针对菌丝球的三维载体结构、微藻的附着状态以及复合体系恢复后的水处理性能进行协同设计。直接将普通菌种保存条件用于菌藻复合载体，可能造成培养基残留继续消耗或诱导菌丝生长，导致载体结构变化；也可能因营养不足、酸碱条件不适或低温应力造成微藻脱落、菌藻活性下降和水处理功能恢复不稳定。

4、另一方面，冷冻干燥和超低温保存通常需要专用设备、较复杂的预处理和严格的温度控制，保存后还可能需要较长的复苏过程，难以直接适应以完整菌藻复合载体为对象的现场备用需求。仅降低温度而不控制保存液的碳源、氮源、磷源及酸碱环境，也难以同时兼顾保存期间的低代谢状态、载体结构稳定性和恢复后的污染物去除能力。因此，需要一种以水处理功能型菌藻复合载体为保存对象，将菌丝球结构、微藻附着、保存液组成、密封方式和低温条件结合起来的低温保存方法。

5、因此，现有技术需要解决的核心技术问题是：如何在不破坏菌丝球三维载体结构和微藻附着关系的情况下，通过可操作的保存液及低温条件，使具有水处理功能的菌藻复合载体在保存期间保持低代谢稳定状态，并在需要时恢复干重、酶活性以及cod、氨氮和总磷去除能力。

技术实现思路

1、本发明针对具有水处理功能的菌藻复合载体在设备检修、季节性停运、备用储存以及再次启用过程中的保存需求，提出一种面向功能型生物载体的低温保存方法。本发明以菌丝球作为三维固定化载体，与微藻共同培养形成菌藻复合载体，在保存前通过温和清洗去除培养体系残留物，随后将其置于含有机碳源、无机氮源和无机磷源的特定保存液中，并采用甘油进行辅助保护处理后密封，在0～4 ℃条件下保存，使菌藻复合体系维持相对稳定的低代谢保存状态，并在后续恢复培养过程中保持水处理功能恢复能力。

2、本发明提供一种用于水处理的载体菌丝球低温保存方法，包括以下步骤：

3、将菌丝球与微藻混合培养形成菌藻体；采用ph为6～8的磷酸盐缓冲液或灭菌生理盐水对所述菌藻体进行清洗；将清洗后的菌藻体加入保存液，所述保存液包括有机碳源、无机氮源和无机磷源，其中cod浓度为300～500 mg/l，nh4⁺-n浓度为80～200 mg/l，po4³⁻-p浓度为15～25 mg/l，且保存液ph为2.0～3.0；向保存体系中加入甘油进行辅助保护处理，以提高低温保存过程中菌藻复合载体的结构稳定性，并将处理后的菌藻体置于0～4 ℃低温环境中保存。

4、进一步地，所述菌丝球与所述微藻按照体积比1:6进行混合，并在140～160 rpm、室温和自然ph条件下振荡培养2小时，以促进微藻与菌丝球充分接触，使微藻附着于菌丝球表面及内部孔隙，形成稳定的菌藻复合体。

5、进一步地，所述菌丝球包括黑曲霉（

aspergillus niger）菌丝球或烟曲霉（

aspergillus fumigatus）菌丝球。

6、进一步地，所述保存液还包括透明质酸和维生素e，其中透明质酸浓度为3～7 g/l，维生素e浓度为2～4 g/l。

7、进一步地，所述菌藻体在0～4 ℃条件下的保存时间为1～12个月。

8、进一步地，保存结束后，将所述菌藻体转移至恢复培养体系中进行功能恢复培养，所述恢复培养体系包括浓度为2 g/l的葡萄糖、浓度为0.5 g/l的氯化铵以及浓度为0.5 g/l的磷酸氢二钾，恢复培养转速为160 r/min，温度为25 ℃，时间为1～3小时。

9、通过测定恢复培养后的菌藻体干重、酶活性以及cod、氨氮和总磷去除能力，并与保存前对应初始性能进行比较，获得复活性能保持率，以评价低温保存条件下菌藻复合载体的功能保持效果。

10、本发明还提供一种低温保存的用于水处理的菌藻复合载体，包括菌丝球以及附着于所述菌丝球表面和内部孔隙中的微藻；所述菌藻复合载体浸置于保存液中，所述保存液包括有机碳源、无机氮源和无机磷源，其中cod浓度为300～500 mg/l，nh4⁺-n浓度为80～200 mg/l，po4³⁻-p浓度为15～25 mg/l，ph为2.0～3.0；所述菌藻复合载体经甘油保护处理后密封，并处于0～4 ℃低温保存状态，以保持其结构完整性及恢复后的水处理功能。

11、进一步地，所述菌丝球为黑曲霉菌丝球或烟曲霉菌丝球。

12、进一步地，所述微藻为蛋白核小球藻（

chlorella pyrenoidosa）或普通小球藻（

chlorella vulgaris）。

13、进一步地，所述保存液还包括浓度为3～7 g/l的透明质酸。

14、结合上述技术方案和所解决的技术问题，本发明所获得的积极效果、显著进步及预料不到的技术效果如下：

15、本发明区别于传统针对单菌株、游离细胞或分散微生物的保存方式，以具有完整空间结构和水处理功能的菌藻复合载体作为保存对象，将菌丝球三维网络结构、微藻附着状态以及恢复后的水处理性能纳入统一保存体系，使菌藻复合载体在保存过程中能够维持结构稳定性，并为后续功能恢复提供基础。

16、本发明通过保存液营养组分、保护组分以及酸碱环境的协同调控，在满足菌藻体系基础维持需求的同时降低保存阶段过度生长风险。其中，维生素e能够降低低温保存过程中氧化应激影响，透明质酸能够增强菌藻复合载体结构稳定性，从而提高保存后的功能恢复能力。

17、本发明采用预清洗、保存液处理、甘油保护以及0～4 ℃低温保存相结合的方式，降低培养基残留物及外界环境变化对菌藻复合载体的不利影响。该方法无需依赖冷冻干燥或超低温保存设备，更适用于水处理工程中备用菌剂储存、系统检修以及快速启动等应用场景。

18、本发明通过恢复培养后干重、酶活性以及cod、氨氮和总磷去除能力等指标，对保存前后菌藻复合载体性能进行对应评价，不仅关注微生物存活状态，同时关注其作为水处理功能载体的应用恢复能力。

19、作为本发明权利要求创造性的辅助证据，本发明还具有以下技术效果：

20、（1）本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：

21、本发明可应用于污水处理、生物强化处理以及资源化利用等领域，为具有水处理功能的菌藻复合载体提供长期储存和备用管理方案。采用本发明方法后，无需在系统重新启动时重新构建菌藻复合体系，可缩短生物处理单元恢复周期，提高工程运行连续性，具有进一步工程应用和推广价值。

22、（2）本发明的技术方案填补了现有技术应用范围的不足：

23、现有微生物保存技术主要围绕菌株存活、细胞活性保持或简单菌剂储存展开，对于同时具有三维固定化结构、微藻附着关系以及污染物去除功能的菌藻复合载体缺少针对性的保存方法。本发明围绕菌藻复合载体的结构保持、活性维持和功能恢复进行协同设计，拓展了传统微生物保存技术的应用对象。

24、（3）本发明的技术方案解决了长期存在的技术难题：

25、本发明解决了菌藻复合载体在长期保存过程中难以同时维持菌丝球结构稳定性、微藻附着状态以及恢复后污染物去除能力的问题，通过保存条件和保存体系的协同调控，实现了功能型菌藻载体的稳定保存。

26、（4）本发明的技术方案克服了传统技术偏见：

27、传统微生物保存通常以降低代谢活动和维持细胞存活为主要目标，而对于具有复杂空间结构的菌藻复合载体，仅采用常规低温或冷冻保存方式容易忽视载体结构变化、微藻脱附以及功能恢复能力下降等问题。本发明突破了仅关注微生物存活率的保存思路，将载体结构稳定性、生物活性保持以及水处理功能恢复作为综合评价目标，实现了面向水处理应用需求的功能型生物载体保存。