一种功能增强型CAR-T细胞及其制备方法和应用

本发明涉及生物医药，尤其是涉及一种功能增强型car-t细胞及其制备方法和应用。

背景技术：

1、传统的肿瘤治疗方式主要包括手术切除、放射治疗以及化学治疗等。近年来，介入治疗、靶向治疗、免疫治疗等新型治疗策略迅速发展。其中，嵌合抗原受体t细胞（chimericantigen receptor t cell, car-t）疗法作为一种突破性的免疫细胞治疗技术，在部分血液系统恶性肿瘤治疗中取得了显著成功，已成为当前最具临床应用前景的细胞治疗方式之一。car-t细胞疗法是利用基因工程技术，通过改造患者自体或健康供者来源的t细胞，使其表达能够特异性识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, car），从而对肿瘤细胞实现精准杀伤的免疫治疗方法。作为一种革命性的肿瘤免疫治疗手段，car-t细胞已在多种恶性肿瘤的临床研究与治疗中展现出巨大潜力，尤其在b细胞白血病、淋巴瘤及多发性骨髓瘤等血液肿瘤中表现出卓越的治疗效果。

2、目前研究表明，car-t治疗后复发的主要机制之一是肿瘤细胞表面car靶向抗原表达下调或缺失，也称为肿瘤抗原阴性复发。然而值得注意的是，仍有相当比例的患者在复发时肿瘤细胞仍表达靶抗原，即抗原阳性复发。福瑞德·哈金森癌症研究中心的david gmaloney团队在一项临床研究（nct01865617）中的结果显示，car-t治疗后抗原阳性复发比例可占总复发病例的78%。在抗原阳性复发患者中，通常可以观察到car-t细胞在体内无法维持有效数量，提示了car-t细胞存在杀伤活性不足以及体内持久性差的问题。因此，提升car-t细胞的持久性、抗耗竭能力及长效抗肿瘤活性，已成为优化其临床疗效的核心研究方向。

3、car-t细胞在体内的持久性受多种因素影响，包括细胞自身特性、制备工艺及肿瘤微环境等。研究表明，记忆t细胞比例与car-t疗效密切相关。而在car-t制备过程中，先富集干细胞样记忆t细胞亚群再进行car-t制备，也能显著提高car-t抗肿瘤活性；但目前常用于car-t细胞培养的细胞因子il-2会降低记忆t细胞的比例，同时car分子介导的tonicsignaling会持续激活car-t细胞，并在制备期间诱发抗原非依赖的耗竭，最终损害car-t细胞功能。

4、cd27作为tnf受体超家族成员，主要表达于初始t细胞和记忆t细胞表面，过继性细胞疗法中，回输产品的质量直接决定临床疗效与安全性。cd27的表达水平最初被认为是评估t细胞记忆特征的关键生物标志物。但有研究发现，通过嵌合转换受体（chimeric switchreceptor, csr）实现car-t细胞深度激活，并在该体系中同步发现cd27信号显著上调。然而，在淋巴瘤和脑肿瘤模型中的研究结果显示，持续cd27信号的激活最终也可能导致t细胞功能的失活。上述看似矛盾的研究结果提示cd27信号对抗肿瘤t细胞的作用具有高度复杂性，尤其是cd27信号对car-t细胞抗肿瘤活性的调控作用与机制仍有待进一步阐明。

5、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供阻断cd27-cd70互作的物质在制备功能增强型car-t细胞中的应用，首次证实car-t细胞体外制备阶段存在不同亚群之间cd27-cd70互作，cd27-cd70互作导致抗原非依赖性过早活化与功能耗竭，阻断亚群之间cd27-cd70互作可显著提升car-t细胞的记忆表型维持能力、体内持久性及长效抗肿瘤活性。

2、本发明的目的之二在于提供一种功能增强型car-t细胞的制备方法。

3、本发明的目的之三在于提供一种功能增强型car-t细胞。

4、本发明的目的之四在于提供上述的制备方法制得的功能增强型car-t细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

5、为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

6、第一方面，本发明提供了阻断cd27-cd70互作的物质在制备功能增强型car-t细胞中的应用。

7、进一步的，所述阻断cd27-cd70互作的物质包括抑制cd70基因的复制、转录、翻译、转录后修饰和/或翻译后修饰的物质；和/或，抑制或降低cd70蛋白的含量、活性和/或功能的物质。

8、进一步的，所述阻断cd27-cd70互作的物质包括用于沉默或敲除cd70基因的核酸分子；和/或，结合cd70蛋白的抗体。

9、进一步的，所述阻断cd27-cd70互作的物质包括a1~a4中的至少一种：

10、a1、靶向cd70基因的rna干扰分子；

11、a2、靶向cd70基因的sgrna；

12、a3、编码a2中所述sgrna的dna分子；

13、a4、含有a2中所述sgrna和/或a3中所述dna分子的表达盒、重组载体或重组宿主细胞。

14、进一步的，所述靶向cd70基因的sgrna的核苷酸序列如seq id no.1所示。

15、第二方面，本发明提供了一种功能增强型car-t细胞的制备方法，所述制备方法包括在car-t细胞体外制备过程中，抑制car-t细胞自身cd70蛋白与cd27蛋白之间的相互作用。

16、进一步的，抑制car-t细胞自身cd70蛋白与cd27蛋白之间的相互作用的方法包括向培养体系中加入结合cd70蛋白的抗体。

17、进一步的，抑制car-t细胞自身cd70蛋白与cd27蛋白之间的相互作用的方法包括敲除cd70基因编码序列；和/或，通过rna干扰降低cd70 mrna水平。

18、第三方面，本发明提供了一种功能增强型car-t细胞，采用上述的制备方法制得。

19、第四方面，本发明提供了上述的制备方法制得的功能增强型car-t细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

20、进一步的，所述肿瘤为cd70阳性的肿瘤。

21、本发明提供的阻断cd27-cd70互作的物质在制备功能增强型car-t细胞中的应用，具体以下有益效果：

22、1、有效避免car-t细胞的过早激活，显著提升其抗肿瘤活性。

23、数据表明，经cd70敲除改造后的car-t细胞，彻底阻断了car-t制备期间cd70-cd27信号轴的传导，避免car-t细胞的过早激活，在体外连续多次肿瘤细胞刺激后仍能维持较强的肿瘤杀伤能力和效应因子分泌水平，小鼠体内荷瘤实验也证实阻断car-t之间cd27-cd70互作后的car-t细胞具有更强的抗肿瘤功能。

24、2、明确阻断cd27-cd70互作与car-t细胞持久性及记忆表型形成的关联，为制备长效型car-t产品提供了理论依据和技术支撑。

25、本发明提出阻断cd27-cd70互作对car-t细胞分化谱系的积极影响。阻断cd27-cd70互作后，car-t细胞中中央记忆t细胞（tcm）和干细胞样记忆t细胞（tscm）的比例明显上升，而终末分化效应记忆t细胞的比例相应下降，这一表型转变使得car-t细胞在体内具有更长的存活半衰期和更强的免疫记忆应答能力。基于此，本发明从分子机制和细胞行为两个层面，完整论证了阻断不同亚型间cd27-cd70互作对car-t细胞功能持久性的正向调控作用，避免了传统策略中仅依赖细胞因子或共刺激结构域改造所带来的功能耗竭问题。

26、3、该制备策略具有良好的通用性和可转化性，适用于多种靶点car-t细胞的优化升级。

27、本发明所确立的阻断cd27-cd70互作的方案不局限于某一特定car结构或靶向抗原，而是可灵活嫁接至针对血液瘤的cd19 car-t、和针对实体瘤抗原的gd2 car-t制备流程中。通过阻断cd27-cd70互作即可实现功能增强，无需额外引入外源基因或小分子化合物，既简化了制备工艺，又降低了潜在的安全风险和监管复杂性。因此，本发明为car-t细胞疗法的效能提升和规模化应用提供了一条直接、高效且易于推广的新途径，有望在血液肿瘤和实体肿瘤的免疫治疗中发挥重要的临床应用价值。